Với một hệ máy có độ nhạy cao thì sự ổn định và lặp lại đóng vai trò quan trọng trong phân tích. Lặp lại tốt mới có thể cho độ chính xác tốt, trong một phạm vi cho phép. Đối với hệ máy sắc ký, khi đã lựa chọn đƣợc điều kiện tối ƣu cho quá trình tách, thì một yếu tố quan trọng quyết định hiệu quả phân tích đó là độ lặp của thiết bị, bao gồm cả độ lặp diện tích pic và thời gian lƣu. Bảng 3.1 và 3.2 chỉ ra độ lặp lại của hệ sắc ký đã chọn về diện tích pic và thời gian lƣu. Dung dịch chuẩn để khảo sát độ lặp có nồng độ sấp xỉ 10 ppm mỗi phtalat, chạy gradient tỉ lệ thành phần pha động 4, nhiệt độ cột 30oC, thể tích van bơm mẫu là 25 µl. Mỗi dung dịch đƣợc bơm 3 lần vào cột để xác định độ lặp diện tích pic và thời gian lƣu.
Bảng 3.1: Độ lặp lại thời gian lưu của các phtalat.
Các phtalat Lần 1 (phút) Lần 2 (phút) Lần 3 (phút) Trung bình % RSD DPP 3,604 3,603 3,597 3,601 0,10 BBP 5,437 5,432 5,419 5,429 0,17 DBP 6,028 6,022 6,008 6,019 0,17 DOP 16,658 16,637 16,622 16,639 0,11 DINP 17,606 17,579 17,560 17,582 0,13
35
Bảng 3.2: Độ lặp lại diện tích pic của các Phtalat.
Các phtalat Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình % RSD DPP 1689959 1690525 1691581 1690688 0,05 BBP 3172087 3160450 3157402 3163313 0,24 DBP 3142503 3117621 3134748 3116124 0,41 DOP 3062057 3018114 3031389 3037187 0,74 DINP 4759637 4713360 4721293 4730530 0,52
Nhận thấy % RSD của các diện tích pic trung bình và thời gian lƣu trung bình của các lần lặp lại đều dƣới 5%. Vì vậy, kết luận đƣợc hệ sắc ký đã chọn có độ lặp lại tốt, phù hợp phép phân tích. Hình 3.5 thể hiện sắc đồ khảo sát độ lặp lại của hệ máy.
3.1.8. Điều kiện tối ưu cho quá trình tách các Phtalat.
Cột tách: cột C18 inertsil ODS-3 250mm × 2,1mm × 5µm.
Detector :PDA.
Bƣớc sóng hấp thụ cực đại: 224 nm.
Nhiệt độ cột 30oC.
Tốc độ dòng 0,5 ml/phút.
Gradient thành phần pha động : gradient 4.
Thể tích van bơm mẫu: 25 µl.
t (phút) 0 8 10 22 24 30
36
Bơm lần 1
Bơm lần 2
Bơm lần 3
37
3.2. Đƣờng chuẩn hỗn hợp xác định 05 phtalat.
3.2.1. Khoảng tuyến tính và khoảng động học của detector .
Khoảng tuyến tính và khoảng động học của detector đƣợc khảo sát qua các dung dịch chuẩn phtalat đƣợc pha từ các dung dịch chuẩn gốc trình bày ở bảng 2.2. Các dung dịch đƣợc pha với các nồng độ 10, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 và 1000 ppm cho mỗi phtalat.
Mỗi dung dịch đƣợc bơm 1 lần trên hệ sắc ký, kết quả đƣợc biểu diễn trên hình 3.6.
Hình 3.6: Khoảng tuyến tính và khoảng động học của detector
Hình 3.6 cho thấy đối với mỗi phtalat thì detector cho khoảng tuyến tính và khoảng động học là khác nhau. Cụ thể, với DPP đƣờng tuyến tính chỉ tới nồng độ
38
khoảng 300 ppm, nhƣng với các phtalat còn lại khoảng tuyến tính rộng hơn, nồng độ tới hạn lên tới 500, 600 ppm.
3.2.2. Dựng đường chuẩn.
Dựa vào kết quả khảo sát khoảng tuyến tính và khoảng động học của detector chúng tôi tiến hành dựng đƣờng chuẩn của các phtalat. Dung dịch dựng đƣờng chuẩn đƣợc pha từ các dung dịch chuẩn gốc trình bày ở bảng 2.2. Các dung dịch đƣợc pha loãng sử dụng pipetman, định mức 10 ml bằng ACN. Từ dung dịch gốc, các dung dịch làm việc đƣờng chuẩn đƣợc pha nhƣ bảng 3.3 dƣới đây.
Bảng 3.3: Các dung dịch đường chuẩn.
C (ppm) DPP BBP DBP DOP DINP DD 1 20 10 16 10 10 DD 2 40 40 48 40 40 DD 3 60 80 80 80 60 DD 4 80 100 160 100 80 DD 5 100 160 240 200 100 DD 6 160 320 320 300 200 DD 7 200 480 400 400 400
Mỗi dung dịch đƣợc bơm trên hệ sắc ký 3 lần, diện tích pic trung bình thu đƣợc sẽ là số liệu để dựng đƣờng chuẩn sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ.
Bảng 3.4: Diện tích pic trung bình thu được của các phtalat.
STT DPP BBP DBP DOP DINP 1 2032219 550960 1343126 994189 300759 2 4029099 2232641 4216428 3984372 1309865 3 5938241 4466210 6375960 8174826 1959184 4 7876640 5576384 12773192 9973829 2639542 5 9851262 8860962 18610713 19357528 3343993 6 15786764 17299108 24491708 28615128 7238097 7 19899628 26780065 31436967 38935791 14434143
39
Bảng 3.5: Phương trình đường chuẩn của 05 Phtalat.
Các phtalat Phƣơng trình đƣờng chuẩn Hệ số tƣơng quan DPP y = 98992x + 11276 R² = 0,9999 BBP y = 55324x - 9824 R² = 0,9996 DBP y = 77214x + 21973 R² = 0,9994 DOP y = 96324x + 15255 R² = 0,9997 DINP y = 36572x - 18913 R² = 0,9996
Đƣờng chuẩn của 05 phtalat đƣợc biểu diễn trên hình 3.7
3.2.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng.
Sau 10 lần bơm hỗn hợp chuẩn phtalat nồng độ 10 ppm trên thiết bị HPLC – UV chúng tôi đã xác định đƣợc giới hạn phát hiện của thiết bị phân tích này đối với từng phtalat nằm trong khoảng từ 0,19 đến 0,66 ppm, giới hạn định lƣợng từ 0,63 đến 2,2 ppm. Kết quả chi tiết đƣợc biểu diễn trên bảng 3.6.
Bảng 3.6: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị.
Các phtalat LOD (ppm) LOQ (ppm)
DPP 0,47 1,6
BBP 0,61 2,0
DBP 0,19 0,63
DOP 0,63 2,1
40
Hình 3.7: Đƣờng chuẩn 05 phtalat nghiên cứu trong luận văn.
DPP BBP
DBP DOP
DINP Với 05 đƣờng chuẩn của 05 phtalat này
thì:
- Trục tung: diện tích pic
- Trục hoành: nồng độ chất phân tích (ppm)
41
3.2.4. Kiểm tra sự khác nhau có nghĩa giữa hệ số a và giá trị 0.
Trong phƣơng trình hồi qui y = a + bx, trƣờng hợp lý tƣởng xảy ra khi a=0. Tuy nhiên, trong thực tế các số liệu phân tích thƣờng mắc sai số ngẫu nhiên luôn làm cho a0. Nếu giá trị a khác không có nghĩa thống kê thì phƣơng pháp phân tích sẽ mắc sai số hệ thống. Vì vậy, trƣớc khi sử dụng đƣờng chuẩn cho phân tích công cụ cần kiểm tra xem sự khác nhau giữa giá trị a và giá trị 0 không có ý nghĩa thống kê không.
Nếu xem a ≈ 0 thì phƣơng trình đƣợc viết thành phƣơng trình y = b’x. Thay các giá trị yi và xi vào phƣơng trình y = b’x ta sẽ đƣợc các giá trị b’ là trung bình cộng các giá trị bi thu đƣợc.
Sau đó đánh giá sự sai khác giữa giá trị a và giá trị 0 theo chuẩn F (tính theo tỷ số của hai phƣơng sai của hai phƣơng trình sao cho F >1) và so sánh giá trị này với F(P, f1, f2) với P = 0,95. f1, f2 là bậc tự do (f1=n-3, f2=n-2, n là số điểm trên đƣờng chuẩn).
Phƣơng sai của 2 phƣơng trình đƣợc tính nhƣ sau:
2 ) ( 2 ) ˆ ( 2 2 2 n bx a y n y y Sy i i i i 3 ) ( 3 ) ˆ ( ' 2 ' 2 2 ' n x b y n y y S y i i i i Chuẩn F đƣợc tính nhƣ sau: 2 2 ' y y tinh S S F
42
Bảng 3.7: Kết quả so sánh giữa giá trị a của phương trình đường chuẩn của 05 phtalat với giá trị 0.
Các Phtalat PT hồi quy Sy2 S'y2 Ftính Fbảng
DPP y = 98992x + 11276 4,7.1010 6,3.1010 1,34 5,19
BBP y = 55324x - 9824 1,4.1014 3,1.1014 2,21 5,19
DBP y = 77214x + 21973 3,1.1013 4,7.1013 1,52 5,19
DOP y = 96324x + 15255 1,3.1013 2,2.1013 1,69 5,19
DINP y = 36572x - 18913 1,8.1014 2,6.1014 1,44 5,19
Ta thấy Ftính < Fbảng với tất cả các phƣơng trình đƣờng chuẩn của các Phtalat. Vì vậy có thể kết luận đƣợc giá trị a và 0 khác nhau không có ý nghĩa thống kê, hay phƣơng pháp xác định 05 phtalat không mắc sai số hệ thống.
3.2.5. Kiểm tra sự sai khác giữa b và b’.
Khi không có sai số hệ thống thì phƣơng trình y = a + bx trở thành phƣơng trình y = b’x, tức là sự khác nhau giữa b và b’ không có ý nghĩa thống kê. Do đó có thể dùng chuẩn t để kiểm tra sự khác nhau của 2 giá trị trung bình.
Trƣớc tiên kiểm tra xem 2 phƣơng sai của chúng có đồng nhất không, nếu chúng đồng nhất thì ta kết luận luôn 2 giá trị b và là khác nhau không có nghĩa thống kê, hay chúng giống nhau. Cụ thể giá trị một số đại lƣợng thống kê của tập giá trị b và b’ trong phƣơng trình hồi quy của DPP đƣợc thể hiện trong bảng 3.8.
Bảng 3.8: Một số đại lượng thống kê của tập giá trị b và b’ trong phương trình hồi quy của DPP.
n = 7 Trung bình Độ lệch chuẩn Phƣơng sai Ftính Fbảng b 99290 1074 1153795
1,30 3,05 b’ 99492 1225 1499445
43
Nhận thấy Ftính < Fbảng nên kết luận đƣợc rằng 2 phƣơng sai của b và b’ là khác nhau không có nghĩa hay chúng giống nhau. Sử dụng chuẩn t để xem xét tiếp. Tính độ lệch hợp nhất của 2 phƣơng sai trên Spooled của 2 giá trị trên.
1 2 2 2 2 1 ¹ 1 ( ) ( ) ( 1) ( 1) 2 2 A B A B n n Ai A Bi B i A A B B pooled x x A B A B x x x x n S n S S S n n n n = 1151,79
Với số thí nghiệm nhỏ hơn 30 dùng chuẩn t 2 phía để so sánh.
. A B A B thucnghiem pooled A B x x n n t S n n = 0,33
So sánh giá trị t tính đƣợc từ thực nghiệm và t tra bảng t(P,f = n1+n2 - 2) = t (0,95;12) = 2,189
Suy ra tthực nghiệm < tbảng => kết luận đƣợc rằng 2 giá trị trung bình của hệ số b, b’ của đƣờng chuẩn của DPP khác nhau không có nghĩa. Hay phƣơng pháp xác định DPP không mắc sai số hệ thống (cả sai số hệ thống biến đổi và không đổi). Tƣơng tự cũng so sánh đƣợc giá trị b và b’ của các đƣờng chuẩn các phtalat khác. Kết quả cho thấy chúng đều khác nhau không có nghĩa, vì vậy có thể kết luận phƣơng pháp HPLC xác định các phtalat không mắc sai số hệ thống.
3.3. Đánh giá phƣơng pháp phân tích.
Mẫu đƣợc xử lý theo quy trình đã đƣợc trình bày ở mục 2.4.1, phần Thực Nghiệm. Đem phân tích trên hệ HPLC với những thông số tối ƣu của quá trình tách và định lƣợng đã chọn đƣợc. Sau đó đánh giá phƣơng pháp phân tích dựa trên những kết quả thu đƣợc.
3.3.1 Đánh giá độ lặp lại của phương pháp xử lý mẫu.
Độ lặp lại của quá trình xử lý mẫu đƣợc thực hiện bằng cách cân cùng một khối lƣợng 0,03g một mẫu, ở đây mẫu đƣợc chọn là mẫu Vịt (P1). Mẫu đƣợc cân vào 3 lọ thủy tinh 20 ml và tiến hành xử lý theo quy trình đã đƣa ra ở mục 2.4.1. Kết quả độ lặp lại đƣợc thể hiện ở bảng 3.9
44
Bảng 3.9: Độ lặp lại của phương pháp xử lý mẫu
Các phtalat Lần 1 (ppm) Lần 2 (ppm) Lần 3 (ppm) Hàm lƣợng (mg/g) % RSD m=0.0302 g m=0.0300 g m=0.0295 g DPP -- -- -- -- -- BBP -- -- -- -- -- DBP -- -- -- -- -- DOP 4043,06 3931,42 4013,73 133,660 1,45 DINP -- -- -- -- -- -- : không phát hiện
Nhận thấy % RSD giữa các hàm lƣợng phtalat trong các lần xử lý mẫu khá tốt, đều nhỏ hơn 5%, do đó kết luận phƣơng pháp xử lý mẫu có độ lặp lại tin cậy đƣợc.
3.3.2 Đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp.
Hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp phá mẫu là một trong những đại lƣợng quan trọng để đánh giá hiệu quả của phƣơng pháp. Nó cho biết lƣợng chất bị mất đi trong quá trình phá mẫu. Đánh giá hiệu suất thu hồi là đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp xử lý mẫu đã chọn.
Để đánh giá hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp, chúng tôi đã lựa chọn một loại mẫu không phát hiện các phtalat, thêm chuẩn vào mẫu đó và xử lý. Mẫu đƣợc chọn là mẫu nhựa PVC cứng.
Mẫu đƣợc cân khối lƣợng khoảng 0,050 g trên cân phân tích, chuyển vào bình thủy tinh 20 ml và xử lý theo quy trình đã nêu ở phần trên. Nồng độ các phtalat thêm vào đƣợc tính theo sau khi định mức.
Bình 0: mẫu trắng, chỉ chứa 1 ml acetonitril. Bình 1 và 2: chỉ chứa lƣợng mẫu đã cân.
Bình 3 và 4: mẫu và lƣợng phtalat thêm chuẩn mức 1 (1000 ppm). Bình 5 và 6: mẫu và lƣợng phtalat thêm chuẩn mức 2 (2000 ppm). Hiệu suất thu hồi của các phtalat đƣợc xác định theo công thức:
45 100% x 0 C C C H thêm blank Trong đó,
Cthêm: nồng độ của mẫu thêm chuẩn (ppm) Cblank: nồng độ của mẫu nền (ppm)
C0: nồng độ ban đầu khi thêm chuẩn (ppm) Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.10.
Bảng 3.10: Hiệu suất thu hồi của các phtalat.
Các phtalat Cblank (ppm) C0 (ppm) Cspike (ppm) H (%) Htb (%)
DPP 0 1000 935,99 93,60 94,13 0 2000 1893,1 94,65 BBP 0 1000 1119,3 111,9 100,6 0 2000 1786,8 89,34 DBP 0 1000 927,82 92,78 97,61 0 2000 2048,8 102,4 DOP 0 1000 1088,7 108,9 107,8 0 2000 2133,2 106,7 DINP 0 1000 837,06 83,71 88,84 0 2000 1879,5 93,98
Kết quả hiệu suất thu hồi của các phtalat khá cao, từ 88,84% - 107,8%. Vì vậy có thể kết luận phƣơng pháp xử lý mẫu này đáng tin cậy.
3.4. Phân tích mẫu thực tế.
Áp dụng các điều kiện tối ƣu đã đƣợc khảo sát, chúng tôi tiến hành phân tích 03 mẫu thực (P1, P2 và P3). Các mẫu đƣợc pha loãng với hệ số thích hợp để nồng độ đo đƣợc nằm trong vùng tuyến tính của đƣờng chuẩn. Kết quả mẫu P1, P2 và P3 đƣợc trình bày trong bảng 3.11.
46
Hàm lƣợng (%) của các phtalat đƣợc tính theo công thức:
Trong đó: C là nồng độ phtalat trong mẫu (ppm). m là khối lƣợng mẫu (g).
H là hiệu suất thu hồi của phtalat (%).
Bảng 3.11: Hàm lượng các phtalat trong mẫu thực
Mẫu P1 Mẫu P2 Mẫu P3
DPP (%) -- -- -- BBP (%) -- -- -- DBP (%) -- 0,7701 19,18 DOP (%) 13,37 14,66 3,020 DINP (%) -- -- -- Tổng (%) 13,37 15,43 22,20
Dựa vào bảng 3.11 ta nhận thấy mẫu P1 phát hiện đƣợc 01 phtalat là DOP với hàm lƣợng chiếm 13,37 % (w/w), mẫu P2 và P3 phát hiện đƣợc 02 phtalat là DBP và DOP với hàm lƣợng tƣơng ứng là 0,77 % và 14,66 % (P2); 19,18% và 3,02% (P3). Tổng hàm lƣợng phtalat trong 03 mẫu P1, P2 và P3 lần lƣợt là 13,37, 15,43 và 22,20.
47
Mẫu P1
Mẫu P2
Mẫu P3
48
3.5. Hàm lƣợng cho phép của hàm lƣợng phtalat trong đồ chơi trẻ em.
Luật định của Bộ Môi trƣờng và Năng lƣợng Đan Mạch số 151 ban hành ngày 15 tháng 3 năm 1999 quy định về hàm lƣợng của Phtalat trong đồ chơi trẻ em nhóm từ 0-3 tuổi. Các đồ chơi cũng nhƣ các mặt hàng khác mà trẻ em có thể bỏ vào miệng, không đƣợc chứa quá 0,05% phtalat theo luật định. Trong luật định, tất cả các dieste của axit o-phtalic đƣợc xem nhƣ là phtalat. Điều này có nghĩa là hầu hết các phtalat thƣờng đƣợc sử dụng trong các sản phẩm của trẻ em đƣợc bao chùm bởi các quy định của Đan Mạch. Ủy ban châu Âu (EC) cũng đã thực hiện một giới hạn về hàm lƣợng phtalat trong đồ chơi và các sản phẩm khác cho trẻ em trong độ tuổi từ 0-3. Quy định của EC tạm thời quan tâm tới sáu phtalat: dibutyl phtalat (DBP), butylbenzyl phtalat (BBP), di-n-octyl phtalat (DnOP), dietylhexyl phtalat (DEHP), diisononyl phtalat (DINP) và diisodecyl phtalat (DIDP). Hơn nữa, theo quy định của EC, nồng độ tối đa cho phép của các chất phtalat (tổng hàm lƣợng phtalat) trong đồ chơi và các sản phẩm khác cho trẻ em trong nhóm tuổi từ 0-3 là ≤ 0,1% (w / w) [18].
49
KẾT LUẬN
Kết quả nghiên cứu và khảo sát các điều kiện tối ƣu và quy trình phân tích một số phtalat trong nhựa (đồ chơi trẻ em) chúng tôi thu đƣợc nhƣ sau: