Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến đổi đại thể được lấy mẫu ngâm trong formol trung tính 10% để làm tiêu bản vi thể. Cần tiến hành làm tiêu bản để xác định bệnh tích vi thể chủ yếu của bệnh. Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm đúc bằng parafin, nhuộm Haematoxilin-Eosin (HE). Các bước của quá trình làm tiêu bản vi thể như sau:
Cố định bệnh phẩm: Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10%.
Vùi bệnh phẩm:
- Rửa formol: Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trong 24 giờ. - Đưa mẫu vào hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động.
Đúc block: Đúc mẫu bệnh phẩm trong parafin.
Cắt dán mảnh và cố định tiêu bản:
- Cắt mảnh: Bằng máy microtom.
- Tãi mảnh: Dàn lát cắt bằng phẳng trên phiến kính trong nước ấm 48oC. Sau đó để tủ ấm 37oC đến khi bệnh phẩm khô là có thể đem nhuộm được.
Nhuộm tiêu bản:
- Khử parafin: Cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ: Xylen I: 6h; Xylen II: 6h; Xylen III: 12h.
- Khử xylen: Cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 lọ: Cồn 100o: 2 lần (mỗi lần 1 phút). Cồn 95o: 1 lần; Cồn 70o: 1 lần; Cồn 50o: 1 lần.
- Khử cồn: Cho dưới vòi nước chảy 15 phút. - Nhuộm Haematoxylin (Nhuộm nhân).
Nhỏ haematoxylin ngập tiêu bản trong 5 phút, rửa nước. Sau đó cho tiêu bản qua hệ thống cồn: Cồn 50o: 1 lần; Cồn 70o: 1 lần; Cồn 95o: 1 lần; Cồn 100o: 2 lần.
Rửa tiêu bản:
- Nhuộm Eosin (Nhuộm bào tương).
Nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 5-10 phút, rửa nước. Cho tiêu bản qua hai lọ cồn 1000 mỗi lọ 1 phút.
- Tẩy cồn, làm trong tiêu bản: Cho tiêu bản đi qua xylen.
Gắn Baume canada:
Nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen trên tiêu bản. Kiểm tra tiêu bản trên kính hiển vi quang học.
2.2.6.Phương pháp nuôi cấy tế bào
Khôi phục tế bào: Tế bào Marc 145 được bảo quản ở -196oC trước khi tiến hành nuôi cấy cần khôi phục lại tế bào. Chuẩn bị môi trường đầy đủ (MEM, 10% FBS làm ấm trong tủ ấm 37oC trong 30 phút trước khi lấy tế bào ra nuôi cấy).
Bước 1: Giải đông tế bào ở nhiệt độ 25oC-30oC trong bể ủ cách thủy trong khoảng 2 phút, cho vào tube có 10ml môi trường đầy đủ (MEM, 10% FBS).
Bước 2: Ly tâm loại bỏ nước nổi và giữ lại cặn tế bào, cho môi trường vào đánh tan cặn tế bào.
Bước 3: Chuyển tế bào vào bình nuôi cấy chứa 5ml môi trường đầy đủ. Bước 4: Đưa vào nuôi cấy và theo dõi sự phát triển của tế bào. Giữ tế bào ở 37oC, 5% CO2 hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào. Khi tế bào đạt 100% diện tích nuôi cấy có thể chuyển đời sang chai nuôi khác.
Cấy truyền tế bào
Bước 1: Loại bỏ môi trường đang nuôi trong chai 75cm2, rửa tế bào bằng 20ml dung dịch PBS (không chứa Ca2+ hoặc Mg2+), sau đó hút bỏ dung dịch rửa.
Bước 2: Trypsin hóa tách tế bào, sử dụng 5ml Trypsin-EDTA. Ủ trong 5 đến 10 phút. Thêm 7ml môi trường không đầy đủ, trộn đều chuyển sang ống ly tâm.
Bước 3: Loại bỏ trypsin, ly tâm loại bỏ phần dung dịch và giữ lại cặn màu trắng. Bước 4: Cân bằng môi trường và đếm số tế bào, hòa tan tế bào trong 6ml
môi trường đầy đủ. Đếm tế bào, pha loãng tế bào 100 lần (10µl tế bào trong 990µl môi trường không đầy đủ) dùng buồng đếm đếm số tế bào trên kính hiển vi, tính số tế bào trong 1ml.
Bước 5: Cấy truyền tế bào, pha loãng tế bào đến 2x105 tế bào/ml trong môi trường đầy đủ, chia huyễn dịch tế bào vào bình nuôi (6ml/bình T25, 15ml/ bình T75).
Bước 6: Nuôi tế bào và kiểm tra sự phát triển, giữ tế bào ở 37oC, 5%CO2
hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào.
Thu tế bào
Các bước thu tế bào giống với các bước cấy truyền tế bào chỉ khác ở bước 5 và bước 6.
Bước 5: Chia ống tế bào, pha loãng tế bào ở 5x106 tế bào/ml trong môi trường đầy đủ có bổ sung 10% DMSO, chia huyễn dịch tế bào vào các ống bảo quản 1ml/ống.
Bước 6: Bảo quản tế bào, giữ ống tế bào trong hộp lạnh ở -20oC trong 2-3 giờ, chuyển sang -80oC khoảng 15 giờ, chuyển tế bào vào giữ trong nitơ lỏng (TCVN 8400-21:2014).
2.2.7. Phương pháp nhân virus PRRS
Tiến hành nhân virus trên tế bào Marc 145 khi tế bào được nuôi cấy trong chai nuôi T25 có độ che phủ đáy bình 60-70%. Loại bỏ môi trường nuôi cấy cũ và rửa tế bào 2 lần bằng PBS 1X. Bổ sung 0,5ml virus gốc/T25. Ủ virus và tế bào trong 1 giờ ở 37oC. Sau khi ủ, loại bỏ dịch ủ và bổ sung 5ml môi trường duy trì MEM 2% FBS. Nuôi virus trong tủ ấm 37oC, 5% CO2, quan sát biến đổi bệnh tích tế bào Marc 145 dưới kính hiển vi soi ngược sau 24 giờ, 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ. Thu virus khi bệnh tích tế bào đạt 80% (TCVN 8400-21: 2014).