Nguyên lý
Hàm lƣợng anthocyanin trong cao khô tuyệt đối đƣợc xác định theo phƣơng pháp pH vi sai và đƣợc tính quy theo cyanidin-3-glucoside. Cyanidin-3- glucoside đƣợc chọn vì đây là dạng phổ biến của anthocyanin trong tự nhiên.
Hoá chất
Dung dịch đệm pH 1.0
Hoà tan hoàn toàn 1.86g KCl vào 980ml nƣớc cất trong becher. Đo và chỉnh pH về 1.0 bằng dung dịch HCl 20%.
Dung dịch đệm pH 4.5
Hoà tan hoàn toàn 54.43g CH3COONa.3H2O vào 960ml nƣớc cất trong becher. Đo và chỉnh pH về 4.5 bằng dung dịch HCl 20%.
Các dung dịch đệm đƣợc bảo quản trong chai kín ở nhiệt độ phòng, sử dụng đƣợc trong nhiều tháng. Trƣớc khi sử dụng nên kiểm tra và chỉnh về đúng pH của phép đo.
Cách tiến hành:
Mở máy quang phổ và làm nóng máy 30 phút trƣớc khi đo. Chỉnh đƣờng nền bằng nƣớc cất ở bƣớc sóng từ 400 đến 700nm.
Pha loãng dịch dịch trích ly thu đƣợc sau khi lọc (Md) theo độ pha loãng DF xác định ở phần trên bằng dung dịch đệm pH 1,0 (M1) và dung dịch đệm pH 4,5 (M2), để mẫu đạt cân bằng trong 15 phút.
Chỉnh điểm 0 cho máy quang phổ bằng nƣớc cất tại các bƣớc sóng (λvis max) và 700nm (độ đục của mẫu).
Đo độ hấp thu của dung dịch vừa pha tại các bƣớc sóng hấp thu cực đại của mẫu (λvis max) và 700nm
Hàm lƣợng anthocyanin trong dịch trích đƣợc xác định theo công thức:
3 10 ) / (mg l A MW DF add
A: mật độ quang (độ hấp thu của anthocyanin)
A = (A λvis max – A700nm)pH 1,0 – (A λvis max – A700nm)pH 4,5
MW = 449,2 g/mol : khối lƣợng phân tử của cyanidin-3-glucosdie DF: độ pha loãng
l : bề dày cuvet (cm)
ε = 26900: Hệ số hấp thu phân tử của cyanidin-3-glucosdie (l.mol-1
.cm-1)