II Tổng quan tài liệu
2.7.2 Tình hình nghiên cứu trong n−ớc
Theo tác giả Lu Xuân Hoàn: ng−ời mẹ khi mang thai ở tháng thứ 6-9 nếu sử dụng tetracycline (oxytetracycline, chlortetracycline, tetracycline) thuốc sẽ tập trung ở x−ơng và mầm răng gây dị tật chân tay, đục thuỷ tinh thể.
Tác giả Trần Thị Thanh Nga và cộng sự khi nghiên cứu tình hình đề kháng kháng sinh ở khoa tiết niệu bệnh viện Chợ Rẫy cho biết: từ 10/1996- 3/1999 khảo sát 61 mẫu n−ớc tiểu thấy kiểu đề kháng của E.coli là amoxicillin
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 40 - nalidixic acide – trimethoprim – sulfamethoxazole - chlortetracycline, norfloxacin - ciprofloxacin - cefoperazone, kiểu đề kháng của Enterobacter sp là amoxicillin - chlortetracycline - sulfamethoxazole - gentamycin, kiểu đề kháng của Pr.Rettgeri là sulfamethoxazole - chlortetracycline, kiểu đề kháng của Citrobacter sp là amoxicillin - chlortetracycline.
Lý Thị Thanh Loan - Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản II đu sử dụng kháng sinh nhóm tetracycline (oxytetracycline, chlortetracycline, tetracycline) thay thế cho chloramphenicol (đ- bị cấm sử dụng) trong điều trị bệnh do Aeromonas, Pseudomonas Fluorescens, Edwarsielladar gây ra trên cá Basa, cá Tra và Vibrio gây bệnh cho tôm đạt kết quả tốt.
Theo các tác giả I.Qbal, J.Siddique, (2001) khi tiến hành thử kháng sinh đồ đối với một số vi khuẩn gây viêm vú trên đàn bó sữa nuôi ở Việt Nam thì thấy Staphylococcus aureus, Staphylococci rất mẫn cảm với oxytetracycline.
Trung tâm bệnh nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh và đơn vị nghiên cứu Wellcome trust Viện Đại học Oxford đu phân lập từ máu và dịch nuo tuỷ bệnh nhân từ năm 1993-1997 đ−ợc 47 chủng Streptococcus pneumoniae để nghiên cứu. Các tác giả cho biết: "từ năm 1993-1995 chỉ có 10% chủng kháng Penicillin, và 50% số chủng kháng tetracycline, 15% kháng erythromycin, 10% kháng chloramphenicol"
Tác giả Bùi Văn Uy, (2002) cho biết: một kiểm nghiệm tại thành phố Hồ Chí Minh, trong 100 mẫu thịt lợn đ−ợc kiểm nghiệm thì có 69 mẫu có l−ợng tồn d− oxytetracycline, 31 mẫu có tồn d− chloramphenicol, nh−ng hàm l−ợng tồn d− chloramphenicol cao hơn.
2.8. Khái niệm hội chứng tiêu chảy
Tiêu chảy là một thuật ngữ diễn tả biểu hiện lâm sàng của hội chứng bệnh lý đặc thù ở đ−ờng tiêu hoá. ỉa chảy là hiện t−ợng ỉa nhanh, nhiều lần trong ngày, trong phân có nhiều n−ớc do ruột tăng c−ờng co bóp và tiết dịch Tạ Thị Vịnh (1990) [13] .Hậu quả là con vật ỉa chảy, mất n−ớc, điện giải, suy
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 41 kiệt và chết nếu không can thiệp kịp thời. Bệnh gây tỷ lệ tử vong cao, làm tổn thất lớn trong chăn nuôi.
2.8.1 Nguyên nhân gây tiêu chảy
Có nhiều nguyên nhân gây hội chứng tiêu chảy, việc xác định nguyên nhân chính rất khó và chỉ mang tính t−ơng đôí. Tuỳ tong giai đoạn, tong lứa tuổit mà có những nguyên nhân gây bệnh khác nhau. Các nguyên nhân chủ yếu gây tiêu chảy là:
+ Do điều kiện ngoại cảnh, chăm sóc nuôi d−ỡng 2.8.2 Nguyên nhân gây tiêu chảy
Có nhiều nguyên nhân gây hội chứng tiêu chảy, việc xác định nguyên nhân chính rất khó và chỉ mang tính t−ơng đối. Tùy từng giai đọan, từng lứa tuổi mà có những nguyên nhân gây bệnh khác nhau. Các nguyên nhân chủ yếu gây tiêu chảy là:
+ Do điều kiện ngoại cảnh, chăm sóc nuôi d−ỡng: lợn con giai đoạn 1-21 ngày tuổi khả năng phòng vệ của cơ thể ch−a hoàn thiện. Vì vậy điều kiện ngoại cảnh có ảnh h−ởng rất lớn đến sức khỏe của lợn con. Thực tế lợn con th−ờng bị tiêu chảy vào những ngày m−a nhiều, độ ẩm cao, trời lạnh, gió mùa Sử An Ninh (1993) [14].
+ Chế độ dinh d−ỡng, chăm sóc cũng ảnh h−ởng không nhỏ đến tỷ lệ mắc tiêu chảy. Thức ăn thiếu khoáng, Vitamin, Fe… cùng ph−ơng thức ch−n nuôI không phù hợp làm giảm sức đề kháng của cơ thể tạo điều kiện cho vi khuẩn đ−ờng tiêu hóa phát triển và gây bệnh.
+ Do kí sinh trùng: Kí sinh trùng kí sinh trên gia sức không chỉ c−ớp chất dinh d−ỡng của vật chủ mà còn tiết độc tố, gây tổn th−ơng niêm mạc đ−ờng tiêu hóa làm giảm sức đề kháng, tạo điều kiện cho vi khuẩn, virut xâm nhập gây bệnh.
+do virus: các virus th−ờng gây tiêu chảy ỏ lợn nh− Pavovirus, Enterovirus, Rotavirrus, Adenovirus…
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 42 + Do vi khuẩn: vi khuẩn là nguyên nhân gây bệnh phổ biến, quan trọng nhất và đ−ợc chú ý nhiều nhất. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy vi khuẩn gây tiêu chảy lợn chủ yếu do một số loại nh−: E.coli, Salmonella sp, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Clostridium pefrigens… Trong đó th−ờng gặp nhất là Salmonella sp, Ecoli và số l−ợng tăng lên một cách bội nhiễm khi lợn mắc tiêu chảy.
Hội chứng tiêu chảy ở lợn con th−ờng diễn ra theo hai quá trình, ban đầu là rối loạn tiêu hóa sau đó là quá trình nhiễm trùng. Các tác nhân stress có hại tác động làm rối loạn cơ năng tiêu hóa ở ruột, thức ăn không tiêu đ−ợc bị lên men, các chất hữu cơ bị phân giải, sinh các sản phẩm độc nh− Indol, Scatol,HS, CH …làm thay đổi pH đ−ờng ruột, gay trở ngại tiêu hóa hấp thụ, làm tổn th−ơng niêm mạc đ−ờng tiêu hóa. Đông thời vi khuẩn đ−ờng ruột có điều kiện thuận lợi phát triển tăng nhanh về số l−ợng, phá vỡ trạng tháI cân bằng động hệ vi khuẩn đ−ờng ruột. Vi khuẩn có hại xâm nhập và bệnh làm tình trạng bệnh lý trầm trọng hợn.
2.8.3 Các vi khuẩn hiếu khí th−ờng gặp trong đ−ờng ruột
Tất cả các vi sinh vật có mặt ở ống tiêu hóa đ−ợc gọi là cụm từ “ Vi khuẩn chí đ−ờng ruột” Vũ Văn Ngữ, (1979) [15]. Trong đ−ờng tiêu hóa của động vật có nhiều loại vi khuẩn. Mật độ vi khuẩn trong ruột non và dạ dày thấp do chịu ảnh h−ởng của acid dạ dày và dịch mật. Mật độ vi khuẩn tăng dần theo chiều dài ống tiêu hóa. Tổng số vi khuẩn trong tá tràng dao động từ 102 – 103 vi khuẩn/1gram chất chứa và tăng lên đến 105 – 107 vi khuẩn/1gram chất chứa ở hồi tràng. ở ruột già số l−ợng vi khuẩn tăng lên đáng kể khoảng 1010 – 1011 vi khuẩn/1gram chất chứa, trong đó vi khuẩn hiếm khí chiếm trên 90%. Số l−ợng vi khuẩn ở ống tiêu hóa th−ờng ổn định, không bị tăng lên sau khi ăn. Nh−ng khi hàng rào bảo vệ bị tổn th−ơng số l−ợng vi khuaant sẽ tăng lên, ở ruột non có quá nhiều acid trung hòa và trở ngại quá trình tiết dịch mật hay tăng tiết dịch mật cũng làm cho số l−ợng vi khuẩn tăng lên.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 43 3. Nội dung, nguyên liệu, địa điểm
và ph−ơng pháp nghiên cứu.
3.1. Nội dung nghiên cứu.
3.1.1. Nghiên cứu sự hấp thu, phân bố của Oxytretracyclin và Oxytretracyclin LA trong huyết t−ơng lợn cho theo đ−ờng tiêm bắp liều Oxytretracyclin LA trong huyết t−ơng lợn cho theo đ−ờng tiêm bắp liều 20mg/kgP.
- Nghiên cứu sự hấp thu, phân bố của Oxytretracyclin trong huyết t−ơng lợn cho theo đ−ờng tiêm bắp liều 20mg/kgP.
- Nghiên cứu sự hấp thu, phân bố của Oxytretracyclin LA trong huyết t−ơng lợn cho theo đ−ờng tiêm bắp liều 20mg/kgP.
- Nghiên cứu so sánh sự hấp thu, phân bố của Oxytretracyclin và
Oxytretracyclin LA trong huyết t−ơng lợn cho theo đ−ờng tiêm bắp liều 20mg/kgP.
3.1.2. Nghiên cứu sự phân bố Oxytretracyclin và Oxytretracyclin LA trong cơ và một số cơ quan nội tạng lợn cho theo đ−ờng tiêm bắp liều 20mg/kgP. cơ và một số cơ quan nội tạng lợn cho theo đ−ờng tiêm bắp liều 20mg/kgP.
- Nghiên cứu sự phân bố Oxytretracyclin trong cơ và một số cơ quan nội tạng lợn cho theo đ−ờng tiêm bắp liều 20mg/kgP sau 24h.
- Nghiên cứu sự phân bố Oxytretracyclin LA trong cơ và một số cơ quan nội tạng lợn cho theo đ−ờng tiêm bắp liều 20mg/kgP sau 24h.
- Nghiên cứu so sánh sự phân bố Oxytretracyclin, Oxytretracyclin LA trong cơ và một số cơ quan nội tạng lợn cho theo đ−ờng tiêm bắp liều 20mg/kgP sau 24h.
- Nghiên cứu so sánh sự phân bố Oxytretracyclin, Oxytretracyclin LA trong cơ và một số cơ quan nội tạng lợn cho theo đ−ờng tiêm bắp liều 20mg/kgP sau 120h.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 44 3.1.3. Điều trị thử nghiệm trên lợn bị tiêu chảy.
3.2. Nguyên liệu.
3.2.1. Động vật thí nghiệm.
Lợn sử dụng trong nghiên cứu có trọng l−ợng từ 20-30kg (2- 3 tháng tuổi). Lợn dùng trong thí nghiệm là lợn khoẻ mạnh, không bị nhiễm kí sinh trùng đ−ờng tiêu hoá và một
số bệnh truyền nhiễm gây kế phát tiêu chảy, đồng đều về độ tuổi, không sử dụng thuốc kháng sinh ( trong thời gian 10 -15 ngày) khi đ−ợc chăm sóc nuôi d−ỡng trong điều kiện nh− nhau.
Thức ăn cho lợn thí nghiệm là thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh của Công ty CP-Group, n−ớc uống là và thức ăn đ−ợc cung cấp cho lợn ăn hàng ngày. 3.2.2. Giống vi khuẩn thí nghiệm.
Giống vi khuẩn thực hiện trong đề tài là giống vi khuẩn Baccillus, dùng canh khuẩn 18-24h để làm thí nghiệm.
3.2.4. Các môi tr−ờng nuôi lấy vi khuẩn (Nguyễn Nh− Thanh 1974 [26]. * Môi tr−ờng n−ớc + bột Pepton * Môi tr−ờng n−ớc + bột Pepton
+ N−ớc thịt: 1000ml + Pepton: 5g
+ Muối tinh (Nacl): 9g
+ PA sau khi vô trùng: 7,2-7,4
* Môi tr−ờng thạch tráng (thạch n−ớc thịt pepton)
+ N−ớc thịt pepton: 1000ml + Thạch agar: 22g
+ PH sau khi vô trùng: 7,2-7,4 * Môi tr−ờng thạch nền: + N−ớc cất: 1000ml + Thạch agar: 22g
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 45 + Muối tinh (Nacl): 9g
+ PH sau khi vô trùng từ 7,2-7,4 3.2.5. Dụng cụ thí nghiệm.
Hộp lồng Petki trong suốt, đáy bằng phẳng, có đ−ờng kính 100mm, cao 15mm, ống ly tâm bằng thuỷ tinh, cốc đong loại 100ml có chia độ, ống trụ bằng nhôm cap 10mm, đ−ờng kính trong 8mm, đ−ờng kính ngoài 9mm, chày cối sứ, syringe loại 5ml, que cấy vi khuẩn, giấy khói, trụ quay để tiến hành thí nghiệm.
Nồi hấp cao áp, tủ sấy tiệt trùng và buồng cấy Erhet, máy li tâm, tủ ấm. 3.2.6. Hoá chất.
Dung dịch NaOH 0,1N và Hcl 0,1N; dung dịch Citratnatri 5%, n−ớc cất, bông, cồn sát trùng 700.
3.3. Địa điểm nghiên cứu.
Thí nghiệm đ−ợc thực hiện tại bộ môn nội – chẩn – d−ợc - độc chất thú y, Khoa thú y, Tr−ờng Đại học nông nghiệp Hà Nội.
Điều trị thử nghiệm ở lợn bị tiêu chảy đ−ợc thực hiện tại các trại lợn siêu nạc trên địa bàn ngoại thành Hà Nội (huyện Đông Anh, huyện Gia Lâm).
3.4. Ph−ơng pháp nghiên cứu.
3.4.1. Hàm l−ợng Oxytretracyclin và hàm l−ợng Oxytretracyclin LA trong huyết t−ơng và các cơ quan nội tạng lợn đ−ợc xác định theo ph−ơng pháp vi huyết t−ơng và các cơ quan nội tạng lợn đ−ợc xác định theo ph−ơng pháp vi sinh vật (d−ợc điển Việt Nam 2002).
Lợn thí nghiệm đ−ợc bố trí theo ph−ơng pháp phân lô so sánh:
- Lợn thí nghiệm đ−ợc chia làm 3 lô: Lô I (đối chứng), không cho thuốc. Lô II (thí nghiệm) tiêm bắp Oxytretracyclin liều 20mg/kgP. Lô III tiêm bắp Oxytretracyclin LA liều 20mg/kgP.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 46 Thí nghiệm: 18 lợn chia thành 3 lô theo sơ đồ bố trí thí nghiệm nh− sau:
STT Lô thí nghiệm Số lợn thí
nghiệm (con)
1 Lô I: Lô đối chứng 6
2 Lô II: Lô tiêm Oxytretracyclin liều 20mg/kg P 6 3 Lô III: Lô tiêm Oxytretracyclin LA liều 20mg/kg P 6
Lợn thí nghiệm và lợn làm đối chứng đ−ợc nuôi trong điều kiện nh− nhau, n−ớc uống và thức ăn hàng ngày đ−ợc cung cấp tự do.
Mỗi con lợn trong các lô đều đ−ợc đánh dấu từ một đến hết. Ngay tr−ớc khi tiêm thuốc, lấy mỗi con 1 ml máu, cho vào ống li tâm có sẵn Citrat + Natri dạng khan đu đ−ợc vô trùng, những mẫu máu này dùng để lấy huyết t−ơng làm đối chứng với huyết t−ơng của chính bản thân chúng sau khi đu tiêm thuốc. Sau đó chúng tôi tiến hành tiêm cho lợn Oxytretracyclin và Oxytretracyclin LA theo cách bố trí thí nghiệm, rồi tiến hành trình tự các b−ớc.
- B−ớc I:
+ Việc xác định nồng độ thuốc Oxytretracyclin, Oxytretracyclin LA trong huyết t−ơng lợn đ−ợc tiến hành nh− sau:
Sau khi tiêm: 30 phút, 1 giờ, 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ, 120 giờ. Mỗi thời điểm lấy 1 ml máu/con ở vịnh tĩnh mạch cổ cho vào ống li tâm có sẵn Citrat Natri khan, đậy nút, đánh dấu máu của từng con, sau đó mang li tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong 15 phút, sau đó chắt huyết t−ơng, làm kháng sinh đồ theo ph−ơng pháp đặt ống trụ.
+ Nghiên cứu sự hấp thu, phân bố của thuốc trong các cơ quan phủ tạng lợn ở các thời điểm 24h, 48h, 72h đ−ợc tiến hành nh− sau:
ở các thời điểm trên giết mổ lợn ở lô thí nghiệm II, III và lô đối chứng I. Dùng panh, kéo vô trùng để lấy mẫu ở một số tổ chức và phủ tạng nh−: gan, thận, lách, phổi, cơ thăn, cơ thân, cơ tim. Mỗi mẫu lấy vài gram sau đó lấy 1 gram mỗi mẫu nghiền nát với n−ớc sinh lí vô trùng theo tỷ lệ 1:1 (1g
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 47 mẫu với 1 ml n−ớc sinh lí) rồi cho vào ống li tâm, li tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong 30 phút. Sau đó bỏ ra hút lấy phần dịch trong ở phía trên làm kháng sinh đồ bằng ph−ơng pháp đặt ống trụ nh− đối với huyết t−ơng.
- B−ớc II:
Thạch nền đ−ợc hấp ở 1210C/20 phút cho nóng chảy rồi đổ vào mỗi hộp. Lồng Petri (đu đ−ợc rửa sạch và hấp tiệt trùng) 8-10ml láng cho thạch dàn đều trên đáy hộp lồng. Để yên tĩnh trên mặt phẳng và nằm ngang từ 5-10 phút để cho thạch đông cứng lại.
Thạch tráng sau khi đ−ợc hấp nóng chảy, đổ vào cốc đong loại 100 ml có chia độ, dùng nhiệt kế loại đo nhiệt độ trực tiếp để kiểm tra nhiệt độ. Khi nhiệt độ của thạch tráng xuống đến 50-450C thì cho canh khuẩn Bacillussutilis 18-24 giờ vào (tỷ lệ 0,2ml canh khuẩn/100ml thạch) dùng đũa thuỷ tinh đu đ−ợc vô trùng chộn đều rồi đổ vào mỗi hộp lồng (đu có thạch nền đ−ợc chuẩn bị ở phần trên) 8-10ml, láng cho chúng dàn đều trên mặt thạch nền, để yên tĩnh trên mặt phẳng nằm ngang khoảng 5 phút. Đặt vào mỗi hộp lồng 4 ống trụ đu đ−ợc vô trùng, khi đặt ống phải l−u ý các yêu cầu sau:
+ Thao tác phải dứt khoát, chỉ đặt mỗi ống một lần, khi đu cắm vào thạch rồi thì tuyệt đối không đ−ợc điều chỉnh nữa.
+ ống trụ phải vuông góc với mặt thạch tráng.
+ ống trụ chỉ vừa vặn qua lớp thạch tráng, vừa chạm vào mặt thạch thì dừng lại.
+ Bốn ống trụ phải cách đều nhau và cách đều thành hộp lồng. - B−ớc III:
Hút từ mỗi mẫu 0,4ml huyết t−ơng (hoặc n−ớc chiết tổ chức) đ−ợc chuẩn bị từ b−ớc I, cho vào mỗi ống trụ (trong hộp lồng đ−ợc chuẩn bị ở b−ớc II 0,2ml. Cứ mỗi mẫu thì cho vào 2 ống trụ đối xứng nhau. Đánh dấu các mẫu t−ơng ứng với ống trụ. Để yên tĩnh trong điều kiện phòng khoảng 30 phút, sau đó chuyển vào nuôi d−ỡng trong tủ ấm 370C (18-24 giờ thì bỏ ra dùng th−ớc
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 48 đo mm đo đ−ờng kính vòng vô khuẩn, nếu có. Các b−ớc II và b−ớc III phải tiến hành trong tủ cấy Erhet).
Tiến hành xây dựng đ−ờng kháng sinh chuẩn để tính kết quả dùng kháng sinh Oxytretracyclin dạng chuẩn (Oxytretracyclin hydrochlorid) pha với n−ớc sinh lí
thành các nồng độ: 0,25; 0,50; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10 (mg/ml).
Sau đó làm kháng sinh đồ nh− ở phần trên. Đo đ−ờng kính vòng vô khuẩn của duy nồng độ thuốc chuẩn, sau đó mang kết quả này biểu diễn trên một hệ trục toạ độ với trục tung biểu diễn nồng độ thuốc, trục hoành biểu diễn đ−ờng kính vòng vô khuẩn. Từ đây ta xây dựng đ−ợc một đ−ờng t−ơng quan chuẩn giữa nồng độ thuốc với đ−ờng kính vô khuẩn. Căn cứ vào đ−ờng này và độ