B. CÁC NGHIEĐN CỨU VEĂ TRÂU
3.12. CÁC DÚNG CÚ VÀ THIÊT BỊ SỬ DÚNG
Phađn tích thành phaăn sợi, tieăn xử lý ¾ Glass fiber
¾ Sorlex
¾ Grucible
¾ Tụ sây ¾ Lò nung
¾ Thiêt bị hút chađn khođng ¾ Thiêt bị noơ hơi
¾ Cađn phađn tích Giai đốn thụy phađn
¾ Máy đo pH ¾ Beơ laĩc ¾ Erlen 250 ml ¾ Cađn kĩ thuaơt Leđn men
¾ Beơ laĩc đieău nhieơt
Hình 3.2 Beơ laĩc
¾ Máy súc oxi
¾ Thiêt bị phađn tích HPLC
Hình 3.3 Thiêt bị phađn tích HPLC
3.13. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIEĐN CỨU
Phương pháp hoá lý xác định thành phaăn cụa trâu
Trâu nguyeđn lieơu được xay thaơt nhuyeên, và sây trong vòng 8giờ đeơ tách lối hêt aơm trước khi tiên hành bât kì thí nghieơm phađn tích nào
1. Xác định hàm lượng resin
Đeơ xác định hàm lượng resin có trong trâu, chúng ta dùng heơ dung mođi benzen và ethanol theo tư leơ 2:1 trích ly phaăn resin trong câu trúc.
Phương pháp tiên hành:
• Sây glass fiber và cađn khôi lượng m1 cụa nó
• Cađn chính xác khoạng m (g) trâu đã được xay nhuyeên cho vào glass fiber và dùng heơ thông sorlex đeơ trích ly resin trong thời gian 6-7 giờ.
• Sau đó lây glass fiber đem phơi ngoài naĩng khoạng 1h đeơ bay bớt dung mođi và sây cho tới khi khôi lượng khođng đoơi, đem cađn khôi lượng m2 (g) glass fiber chứa trâu tách nhựa.
Cách tính toán: %resin 100 m2 m1*100
m
−
2. Xác định thành phaăn carbohydrate, lignin
1./ Chuaơn bị maơu thí nghieơm:
• Sây mău trong tụ sây ở 105oC đeơ deê xay.
• Nghieăn nhỏ mău baỉng máy xay.
• Rađy mău đã nghieăn baỉng sàng rađy kích thước loê 250µm.
• Đaịt mău trong tụ sây từ 8 giờ trở leđn, lây ra khi caăn làm thí nghieơm. Cách chuaơn bị dung dịch NDS (Neutral Detergent Solution)
a.) Nước cât : 1 lít b.) EDTA: 18.61 g
c.) Natri tetraborat decahydate : 6.81 g d.) Natri dodecylsulfat : 30 g
e.) 2-ethoxyethanol : 10 ml f.) Na2HPO4 : 4.56 g
Đaău tieđn cho b.) và c.) hoà tan hoàn toàn vào a.)
Khi hoà tan hêt, cho tiêp túc d.) và e.) vào. Vì d.) là moơt lối chât hốt đoơng beă maịt, sẽ deê táo bĩt, neđn hoà tan từ từ tránh táo nhieău bĩt.
Cuôi cùng hoà tan f.) vào. Dung dịch sẽ có pH trung tính (từ 6.9 - 7.1) . Cách chuaơn bị dung dịch ADS (Acid Detergent Solution)
a.) Axit sunfuric : 49.04g b.) CTAB : 20g
Hoà tan a.) và b.) vào 1 phaăn nước cât, sau đó định mức leđn 1L 2./ Thực hieơn thí nghieơm
a./ Thí nghieơm NDS ( xác định toơng thành phaăn carbohydrate và lignin )
Vỏ trâu tách nhựa cho tiêp xúc với dung dịch NDS, dung dịch này sẽ hoà tan các thành phaăn táp, chư còn lái chụ yêu là cellulose, hemicellulose, lignin và thành phaăn tro. Thí nghieơm này dùng đeơ xác định toơng hàm lượng (cell+hemi+lignin)
Phương pháp tiên hành:
• Cađn chính xác khoạng 0.5g trâu đã tách nhựa cho vào bình caău coơ nhám.
• Sau khi đun, tiên hành lĩc chađn khođng giữ lái phaăn bã, trong quá trình lĩc, rữa bã với nước nóng từ 3-4 laăn, moêi laăn khoạng 50ml.
• Cuôi cùng rửa lái baỉng axeton cho sách bã, và đem sây trong vòng 8h.
• Cađn khôi lượng bã W1 sau khi sây và đem nung ở 500oC
• Sau khi nung chư còn lái phaăn tro, xác định khôi lượng W2 phaăn tro đó.
Tính toán:
% (cellulose + hemicellulose+lignin) = (W1-W2)/ 0.5*100. b./ Thí nghieơm ADS (xác định hàm lượng cellulose và lignin)
Dung dịch ADS sẽ hoà tan hemicellulose, và xác định được toơng hàm lượng
cellulose+lignin Tiên hành thí nghieơm:
• Cađn chính xác khoạng 1g trâu đã tách nhựa cho vào bình caău coơ nhám.
• Cho 100ml dung dịch ADS, 0.2 ml dodecahydronapthalene vào và cũng đun trong vòng 1h
• Lĩc chađn khođng lây phaăn bã, cũng rửa với nước nóng và axeton
• Sây phaăn bã trong vòng 8h, xác định khôi lượng W3 cụa bã đã sây. c./ Thí nghieơm ADL
Tiêp túc với thí nghieơm ADS, axit đaơm đaịc sẽ hoà tan cellulose trong phaăn trâu cụa thí nghieơm tređn, do đó xác định được thành phaăn lignin
• Dung dịch caăn thiêt H2SO4 72%
• Tiên hành: lây phaăn bã sây ở thí nghieơm ADS cho vào khoạng 25-30 ml H2SO4 72%, khuây đeău tay trong vòng 30 phút.
• Lĩc lây phaăn bã và rửa thaơt sách axit baỉng nước nóng 5-6 laăn.
• Đem sây trong thời gian 8h và xác định khôi lượng W4 cụa bã (lúc này bã chứa haău hêt là lignin).
• Nung phaăn bã ở 500oC và xác định khôi lượng W5 sau khi nung Tính toán: % (cellulose + lignin) = (W3-W5)*100
Từ sô lieơu cụa ba thí nghieơm có theơ tính toán được thành phaăn cellulose, hemicellulose và lignin.
3. Xác định hàm lượng tro
Lượng tro cũng có ý nghĩa quan trĩng đên quá trình thụy phađn, vì thành phaăn chụ yêu trong tro là Si và có ạnh hưởng ức chê enzyme
• Cađn khôi lượng côc nung đã được sây m1
• Cađn khôi lượng trâu đã được sây m2
• Tiên hành nung ở nhieơt đoơ 500oC và xác định khôi lượng m3 côc chứa tro sau khi nung
• Tính toán: %tro = (m3-m1)/m2 *100
Quá trình noơ hơi
Đeơ quá trình thụy phađn đát hieơu quạ tôt, quá trình tieăn xử lý đóng vai trò quan trĩng. Trong khuođn khoơ cụa đeă tài này, tođi chĩn phương pháp noơ hơi nước (steam explosion) là phương pháp xử lý nguoăn nguyeđn lieơu ban đaău. Theo nhaơn xét từ luaơn vaín nghieđn cứu cụa chị K.Thạo, phương pháp này có hieơu quạ hơn so với các phương pháp xử lý kieăm, axit… Với nguyeđn lieơu vỏ trâu, ngoài hemicellulose, lignin thì thành phaăn silica có trong vỏ trâu gađy ạnh hưởng khođng tôt,và vieơc phá vỡ câu trúc lớp silica baỉng phương pháp noơ hơi đã được Dr. Mochidzuki đái hĩc Tokyo nghieđn cứu.
Thiêt bị dùng đeơ noơ hơi là thiêt bị chịu áp suât cao (có theơ chịu được áp suât leđn đên hơn 200at) và có câu táo như hình vẽ. Nguyeđn lieơu vỏ trâu có kích thước nhỏ từ 1-1.5 cm neđn khođng caăn phại caĩt nhỏ.
Tiên hành thí nghieơm:
• Cađn khoạng 200-300g trâu thođ cho vào ông nhaơp lieơu
• Cho khoạng 4lít nước vào và baơt cođng taĩc đieơn trở đeơ nađng nhieơt đoơ
• Cài đaịt nhieơt đoơ 200oC, 2100C, 2200C
• Khi đã đát được nhieơt đoơ cài đaịt, thì taĩt cođng taĩc và đeơ yeđn trong vòng từ 5-7 phút
• Xạ áp và tiên hành vaĩt thu lây phaăn bã
• Đem cađn lượng bã thu được và tiên hành thí nghieơm xác định hàm aơm cụa bã.
• Thực hieơn thí nghieơm phađn tích thành phaăn sợi cụa bã sau noơ hơi.
Quá trình thụy phađn
Quá trình thụy phađn trâu có nhieău yêu tô ạnh hưởng: tư leơ bã khođ, tư leơ enzyme, đoơ pH, nhieơt đoơ… Trong phám vi đeă tài này, chúng tođi chư khạo sát ba yêu tô tư leơ bã khođ, tư leơ enzyme, đoơ pH, còn nhieơt đoơ tođi chĩn nhieơt đoơ hốt đoơng tôi ưu cụa enzyme do nhà sạn xuât cung câp là 50oC.
Thời gian khạo sát với moêi mẹ thụy phađn là 2-3 ngày. Lượng đường sinh ra trong quá trình thụy phađn được xác định baỉng phađn tích saĩc kí lỏng (HPLC).
Nguyeđn taĩc vaơn hành máy HPLC
• Chuaơn bị dung mođi cháy saĩc kí: sử dúng nước cât được lĩc kĩ baỉng màng lĩc và theđm axit H2SO4 98% lối tinh khiêt cụa hãng Normandic, tư leơ giữa nước cât và H2SO4 là 1000 ml : 400µl.
• Baơt cođng taĩc khởi đoơng và chờ máy oơn định
• Mở van và nhân nút Purge đeơ xạ đường ông, thực hieơn Purge 2-3 laăn
• Khoá van lái, nhân nút Pump đeơ bơm dung mođi vào coơt.
• Taíng daăn áp suât bơm từ 0.2 leđn 0.5, 0.8, 1 kgf.
• Cài đaịt nhieơt đoơ coơt là 60oC và nhân nút Oven đeơ taíng nhieơt đoơ coơt.
• Khi nhieơt đoơ đã oơn định, nhân SHIFT-Rflow, và đeơ trong 30 phút.
• Taĩt SHIFT-Rflow, và nhân SHIFT-Balance và Zero đeơ chưnh máy oơn định, đưa đường neđn veă vị trí 0.
• Khi máy đã oơn định, bơm mău vào baỉng Sypringe, tráng kĩ Sypringe trước khi bơm mău vào
Cách xác định noăng đoơ đường
Khi thực hieơn đo baỉng HPLC, đeơ xác định được noăng đoơ câu tử caăn phađn tích, thì phại thực hieơn đo dãy chuaơn cụa câu tử đó, xađy dựng đoă thị và từ đó đưa phương trình thực nghieơm. Dựa vào phương trình thực nghieơm đeơ xác định lái noăng đoơ câu tử trong mău.
Bạng 3.1 Thời gian lưu và noăng đoơ cụa các chuaơn phađn tích được Chất chuẩn C (g/l) Tr S Glucose 0,96 7,558 786.892 Mannose 7,36 7,878 5.172.249 Arabinose 5,345 8,525 3.414.149 Xylose 5,86 7,993 3.799.992 Cellobiose 5,96 6,506 3.088.465 Saccharose 4,825 7,722 7.695.230 Galactose 5,086 7,97 2.958.850 Acid lactic 16,168 9,759 7.721.543 Acid citric 9,85 9,689 2.913.131 Acid oxalic 3,856 5,958 2.541.980 Acid maleic 7,058 8,111 2.504.161 Acid axetic 6,74 11,108 1.992.774 Ethanol 10,55492 15,565 3.656.818
Đoă thị đường chuaơn glucose giữa noăng đoơ và dieơn tích đo được
Hình 3.4 Đoă thị bieơu dieên noăng đoơ glucose theo dieơn tích
Trong đó x : noăng đoơ glucose (g/l)
Chart Title y = 786637x - 54489 R2 = 0.9961 0.00 500,000.00 1,000,000.00 1,500,000.00 2,000,000.00 2,500,000.00 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 C S C - S 1 Linear (C - S 1)
Noăng đoơ glucose: C = (S + 54.489)/ 786.637
Quá trình thụy phađn và leđn men đoăng thời
Khạo sát quá trình theo hai yêu tô : maơt đoơ nâm men và tư leơ enzyme. Đo đường và coăn baỉng phương pháp saĩc kí HPLC
Xác định noăng đoơ coăn theo đoă thị Tính toán
Noăng đoơ ethanol: C = (S + 126.371) / 316.430
Hình 3.5 : Đoă thị bieơu dieên noăng đoơ ethanol theo dieơn tích
3.14.CÁC PHƯƠNG PHÁP VI SINH NUOĐI CÂY, BẠO QUẠN
Đeơ thực hieơn vieơc nuođi cây, bạo quạn vi sinh baơt, chúng tođi tiên hành mođi trường dinh dưỡng đeơ vi sinh vaơt phát trieơn. Mođi trường dinh dưỡng chúng tođi chĩn là mođi trường Hansen
Cách pha mođi trường Hansen dùng đeơ nuođi cây nâm men
Bạng 3.2. Thành phaăn mođi trường Hansen đeơ nuôi cây nâm men
Teđn hóa chât Khôi lượng Nơi sạn xuât
Glucose 50g Trung Quôc
K2HPO4 3g Trung Quôc
Peptone 10g Difco
MgSO4.7H2O 2.5g Trung Quôc
Agar 20g Vieơt Nam
Chart Title y = 316430x - 126371 R2 = 0.9999 0.00 500,000.00 1,000,000.00 1,500,000.00 2,000,000.00 2,500,000.00 3,000,000.00 3,500,000.00 0 2 4 6 8 10 12 C S C - S Linear (C - S)
Nước cât 1000mL Vieơt Nam
Vì nguoăn boơ sung Nitơ sử dúng dịch chiêt nâm men neđn sẽ được cho vào sau cùng đeơ tránh sự hư hỏng dịch chiêt nâm men. Lượng dịch chiêt cho vào là 10g. Trước khi tiên hành thụy phađn và leđn men đoăng thời, caăn boơ sung theđm chât dinh dưỡng vào dung dịch thụy phađn, leđn men. Theơ tích dung dịch caăn thực hịeơn 100 ml, lượng dinh dưỡng boơ sung tương ứng
Bạng 3.3. Thành phaăn dinh dưỡng boơ sung
Teđn hóa chât Khôi lượng Nơi sạn xuât
K2HPO4 0.3g Trung Quôc
MgSO4.7H2O 0.25g Trung Quôc
Dịch chiêt nâm men 1g Difco
Phương pháp cây và bạo quạn giông nâm men
Tiên hành gieo cây giông nâm men từ ông giông gôc cụa phòng thí nghieơm sang ông mođi trường thách nghieđng đã được chuaơn bị sẵn từ trước (mođi trường Hansen có boơ sung thách với hàm lượng 2%). Cođng vieơc này được tiên hành trong đieău kieơn vođ trùng (tôt nhât là trong tụ cây) đeơ tránh bị nhieêm các vi sinh vaơt khác có ạnh hưởng xâu đên men giông và quá trình leđn men sau này.
Phương pháp gieo cây như sau:
• Phại đạm bạo tay sách sẽ, có theơ rửa baỉng coăn
• Dùng que cây vòng và vođ khuaơn tređn đèn coăn.
• Tháo nút bođng ở ông canh trường giông và ông mođi trường.
• Đôt nóng mieơng 2 ông nghieơm tređn đèn coăn.
• Đưa que cây vào ông canh trường và lây moơt ít canh trường nâm men.
• Đưa đaău que cây vào đáy ông mođi trường, hòa giĩt canh trường vào giĩt nước ngưng ở đáy.
• Nhé nhàng và từ từ kéo đaău que cây leđn tređn maịt thách, từ đáy leđn theo hình sin.
• Lây que cây ra, vođ khuaơn tređn đèn coăn.
• Hơ nóng nút bođng và mieơng 2 ông nghieơm (canh trường và mođi trường). Đaơy nút bođng vào ông nghieơm.
cứu. Nêu muôn tiêp túc bạo quạn thì thời gian sau này caăn cây truyeăn sang mođi trường mới, khoạng 2-3 tuaăn đeơ giữ giông khoẹ mánh
Phương pháp nhađn giông
Giông nâm men trước khi đưa vào leđn men caăn được nhađn giông nhaỉm taíng sinh khôi, taíng hốt lực giông. Ở quy mođ phòng thí nghieơm, chúng tođi tiên hành nhađn giông qua hai giai đốn:
¾ Giai đốn 1: sau khi nâm men đã phát trieơn tređn mođi trường thách nghieđng, chúng tođi cây vào ông nghieơm chứa 10mL dịch mođi trường Hansen đã được hâp tieơt trùng, tiêp đó nuođi ở nhieơt đoơ thường (28-300C) trong 24 giờ.
¾ Giai đốn 2: lây 50 mL dịch mođi trường Hansen coơng với 50 mL dịch thụy phađn rơm rá cho vào erlen 250mL, hâp tieơt trùng, đeơ nguoơi, cho ông nghieơm đã nuođi giông (giai đốn 1) vào erlen và nuođi ở đieău kieơn 300C, 130 rpm, 24 giờ.
Đêm sô tê bào nâm men trong 1ml canh trường
Khi đánh giá chât lượng canh trường nâm men, ngoài vieơc tính tỷ leơ tê bào naơy choăi còn caăn đêm sô tê bào trong 1mL. Trong 1mL canh trường nâm men phát trieơn bình thường phại có ít nhât 12-14 trieơu tê bào.
Chúng tođi đêm trực tiêp baỉng buoăng đêm hoăng caău.
1/ Tiên hành
- Đaịt lá kính leđn khu vực buoăng đêm.
- Laĩc đeău dịch tê bào nâm men và dùng pipet đeơ lây moơt giĩt cho vào khe ở mép buoăng đêm, tránh táo bĩt khí. Dịch huyeăn phù sẽ đi vào buoăng đêm nhờ cơ chê mao dăn.
- Đaịt buoăng đêm vào bàn kính hieơn vi và đeơ yeđn vài phút.
- Chưnh kính hieơn vi với vaơt kính x40, tìm máng ođ đêm ở khu vực buoăng đêm. Chưnh thị trường sao cho moơt thị trường chứa trĩn moơt ođ lớn (4 x 4 = 16 ođ nhỏ).
- Đêm sô tê bào trong 5 ođ vuođng lớn đái dieơn cho 25 ođ vuođng lớn trong ođ trung tađm.
2/ Cách tính
Sô lượng tê bào trong 1 mL mău nghieđn cứu được tính baỉng cođng thức: N = [(a/b) x 400/0,1] x 103 x 10n
Trong đó:
N : sô lượng tê bào trong 1 mL mău nghieđn cứu a : sô tê bào trong 5 ođ vuođng lớn (80 ođ vuođng nhỏ)
b : sô ođ vuođng nhỏ trong 5 ođ vuođng lớn 400 : toơng sô ođ vuođng nhỏ trong ođ trung tađm 0,1 : theơ tích dịch tê bào chứa trong ođ trung tađm 103 : sô chuyeơn mm3 thành mL
KÊT QUẠ VÀ BÀN LUAƠN