2.3.1. Hóa chất, thiết bị máy móc
a, Hóa chất
Các hóa chất cần thiết dùng trong thí nghiệm được mua của các hãng nước ngoài (Amersham Pharmacia Biotech; Amersham Life Science; Euro- gen; Promega; Sigma…) có độ tinh khiết cao.
Các loại hoá chất sử dụng trong phân tích được trình bày ở bảng 2.1
Bảng 2.1. Hóa chất sử dụng cho thí nghiệm
Thứ tự Hóa chất Hãng sản xuất
1 Nitơ lỏng Việt Nam
2 Bao khí Mỹ
3 Bộ hóa chất tách DNA Sigma (Mỹ)
4 Bộ hóa chất chạy PCR Fermentas (Mỹ)
5 Cồn 100% và 70% Meck, Đức
6 Hóa chất điện di DNA Biolads (Mỹ)
7 Nước khử ion vô trùng Fermentas (Mỹ)
8 Marker 1Kb, 100bp Fermentas (Mỹ)
9 Môi trường thạch máu Biolads (Mỹ)
10 Một số hóa chất khác
b, Thiết bị máy móc
Máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.2
Bảng 2.2. Trình tự mồi 23S rARN STT Tên mồi Trình tự Số nu. Tm 1 Tm 2
1 23S-F CCA CAG CGA TGT GGT CTC AG 20 53.3 58.8
27
Bảng 2.3. Máy móc thiết bị sử dụng cho thí nghiệm
STT Thiết bị và dụng cụ Hãng sản xuất
1 Máy chu trình nhiệt PCR Eppendorf, Đức
2 Máy nghiền mẫu Mỹ
3 Nồi khử trùng và tủ sấy Nhật bản
4 Lò vi song Sam sung, Nhật
5 Bể ổn nhiệt OSI, Pháp
6 Bộ điện di Mupid-ex (Nhật)
7 Tủ lạnh -80 0
C, -20 0C, 4 0C Sanyo (Nhật)S
8 Máy ly tâm lạnh Sorvall (Mỹ)
9 Tủ cấy vô trùng Sanyo (Nhật)
10 Máy voltex Rotolab OSI (Đức)
11 Máy khuấy từ OSI (Đức)
12 Máy đo quang phổ kế Hewlett Packard (Mỹ)
13 Pipettman các loại Eppendorf (Đức)
14 Cân phân tích Mettler (Thụy Sỹ)
15 Máy soi DNA Bio Rad (Mỹ)
16 Máy hút chân không Speed Vac Se 1100A-Savant
17 Một số trang thiết bị khác
2.3.2. Địa điểm thực hiện nghiên cứu
- Soi và sinh thiết dạ dày được thực hiện tại phòng Nội soi, bệnh viện E Hà Nội
- Các phân tích về gen học được thực hiện tại Viện Công nghệ Sinh học.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Khám lâm sàng 2.4.1. Khám lâm sàng
Các bệnh nhân được khám lâm sàng, hỏi bệnh và tiền sử theo mẫu phiếu thu thập số liệu thống nhất bao gồm các thông tin: tên; tuổi; giới tính; triệu chứng lâm sàng (đau thượng vị, cồn cào nóng rát, ợ hơi, ợ chua, buồn nôn, nôn, đầy bụng, rối loạn đại tiện...); tiền sử bệnh (bản thân, gia đình); tiền
28
sử uống rượu bia, thuốc lá, uống thuốc kháng sinh hay thuốc ức chế axit; yếu tố stress; dị ứng...
2.4.2. Nội soi và lấy bệnh phẩm
Việc nội soi, chụp ảnh và lấy mẫu sinh thiết dạ dày cho các nghiên cứu được thực hiện theo thường qui bởi các bác sĩ Nội khoa tiêu hóa cùng trang thiết bị của bệnh viện. Bệnh nhân được chẩn đoán bị viêm dạ dày xuất huyết (về các mặt gồm vị trí tổn thương, hình ảnh tổn thương, mức độ tổn thương) sẽ được sinh thiết 2 mảnh, trong đó 1 mảnh ở hang vị, 1 mảnh ở thân vị. Những mẫu bệnh phẩm này được cho vào ống nghiệm vô trùng và bảo quản trong bình N2 lỏng cho đến khi sử dụng vào các nghiên cứu tiếp theo.
2.4.3. Đánh giá độ nhạy cảm với kháng sinh
2.4.3.1 Xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh của H. pylori
* Cách tiến hành
Sử dụng môi trường thạch máu sôcôla (5% máu ngựa) trên đĩa petri đường kính 9cm, chứa 30ml thạch còn mới (không quá 1 tuần).
Pha hỗn dịch vi khuẩn bằng cách hoà khuẩn lạc với nước muối sinh lý với độ đục tương ứng với độ đục chuẩn Mc Faland 0,5 (tương ứng với khoảng 108 vi khuẩn trong 1ml).
Ria cấy: láng đều hỗn dịch vi khuẩn lên khắp bề mặt đĩa môi trường, hút canh khuẩn còn thừa bỏ đi.
Dùng kẹp nhọn đầu vô trùng để E-test lên mặt thạch, đồng thời ấn nhẹ xuống để đảm bảo bám chặt vào mặt thạch.
Đặt các đĩa thạch với tư thế lộn ngược vào bình cấy kị khí của Mỹ. Đặt một ống có chứa 10ml nước vào bình cấy kị khí để tạo độ ẩm cần thiết. Đổ 10ml nước vào túi tạo khí GasPak của hãng BD, sản xuất tại Mỹ, khi thấy sủi bọt, đặt nhanh vào bình cấy, đậy chặt nắp bình và đặt vào tủ ấm 370C từ 2-3 ngày. Đối chứng cũng được tiến hành tương tự để kiểm tra chất lượng E-test và chất lượng đĩa môi trường.
29
2.4.3.2 Đánh giá độ nhạy cảm với kháng sinh
- Kháng sinh đồ đối với Clarithromycin được xác định bằng E-test, là một giải plastic mỏng, trơ, dày khoảng 0,6mm và rộng 5mm, trên đó đã được phủ nồng độ kháng sinh pha loãng liên tục (continuous antibiotic concentra- tion gradient) và nồng độ này tương đương với 15 lần pha loãng so với phương pháp pha loãng thông thường, do đó cho kết quả chính xác hơn phương pháp pha loãng thông thường (discontinuous serial dilution) với nồng độ pha loãng không liên tục.
Xác định tính nhạy cảm của H. pylori đối với Clarithromycin: S: Nhạy cảm (Susceptible) ≤ 2 μg /ml
R: Đề kháng (Resistant) > 2 μg/ml
2.4.4. Nuôi cấy chủng vi khuẩn
Hai mảnh sinh thiết dạ dày (1 mảnh lấy ở hang vị và 1 mảnh lấy ở thân vị) được lấy ra từ bình nitơ và được đặt vào trong đá khoảng 20 phút để cân bằng nhiệt độ, sau đó được nghiền kỹ trong 0,5 ml dung dịch muối sinh lý (0,9% NaCl) vô trùng. Khoảng 30 – 50 l dịch nghiền của sinh thiết được nhỏ và trải đều trên bề mặt đĩa môi trường thạch. Đặt các đĩa petri vào bình Jar với một bao khí BBL GasPak Plus (BD, Mỹ) để tạo điều kiện kị khí (10% CO2) (Hình 5). Đặt bình Jar vào tủ ấm ở 370C và đọc kết quả trong vòng 48 - 72 giờ.
30
Mỗi khuẩn lạc có hình thù đặc trưng được nhặt riêng và nuôi riêng rẽ trên các đĩa thạch khác nhau. Các đĩa nuôi được ghi tên, nguồn gốc bệnh nhân rõ ràng. Quá trình phân lập được thực hiện cho đến khi nhận được các khuẩn lạc riêng rẽ và thuần nhất về mặt hình thái.
2.4.5. Tách chiết DNA từ sinh thiết bệnh nhân
Tách chiết DNA tiến hành theo Wiliam và cộng sự với một vài cải tiến cho phù hợp với đối tượng nghiên cứu và điều kiện phòng thí nghiệm.
Qui trình tách chiết và tinh sạch DNA được tiến hành theo các bước sau: -Sinh thiết được lấy ra từ Nitơ lỏng, sau đóđược nghiền bằng máy trong NaCl 0,9%.
- Cho thêm 400µl Lysis để phá vỡ tế bào. -Ủ mẫu ở nhiệt độ 560C-30‟
-Bổ sung 600µl phenol: choroform : isoamyl alcohol (25:24:1), dung dịch này có tác dụng làm biến tính protein nhưng không hoà tan DNA. Lắc đều và ly tâm mẫu 13000 vòng/phút trong 20 phút. Khi đó protein biến tính sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha dịch DNA và pha phenol: choroform : isoamyl alcohol. Pha nước có chứa DNA sẽ được thu nhận lại bằng cách hút chuyển dịch sang ống eppendorf mới.
-Bổ sung 450µl chloroform: isoamyl alcohol rồi tiến hành các bước giống như khi cho phenol: chloroform vào. Cuối cùng thu được dịch chứa DNA.
- Dịch DNA thu được ở trên cho vào eppendorf chứa 850µl ethanol 100% và 40µl CH3COONa, đảo đều và để tủa trong ngăn đá qua đêm.
-Ly tâm 13000vòng/phút trong 20 phút, thu tủa DNA
-Rửa trong 400µl cồn 70% để loại bỏ muối và chloroform: isoamyl al- cohol còn sót lại trong mẫu.
-DNA thu được làm khô trong máy Speed Vac khoảng 10 phút. -Bảo quản DNA trong TE ở -12 oC
2.4.6. Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế
Sau khi thu nhận DNA ở dạng sạch, tiếp tục tiến hành phân tích định tính và định lượng DNA bằng quang phổ kế.
31
Nguyên tắc của phương pháp quang phổ kế
Phương pháp định lượng DNA bằng quang phổ kế dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ = 260nm của các bazơ purine và pyrimidine. Dựa trên nguyên tắc này, cho phép xác định được nồng độ và độ tinh sạch của DNA được tách chiết.
- Nồng độ DNA
Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260nm (OD260nm - Optical Density 260nm) của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ DNA trong mẫu dựa vào tương quan :
Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ là : 50µg/ml cho một dung dịch sợi đôi.
Nồng độ tương đối của DNA được tính theo công thức :
C = OD260nm × d0 × So (1) C : Nồng độ tương đối của DNA
d0 : Độ pha loãng S0 : Hằng số, S0 = 50 - Độ sạch của DNA
Để kiểm tra độ sạch của DNA trong dung dịch, cần đo thêm OD ở 280nm đây là bước sóng các protein có mức hấp thụ cao nhất, nhưng các pro- tein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260nm như các DNA và do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ DNA. Tiếp theo tính tỷ số OD260nm/OD280nm (2), DNA được xem là sạch khi tỷ số OD260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1,8 - 2,0.
2.4.7. Phƣơng pháp điện di trên gel Agarose
Nguyên tắc điện di
Điện di là kỹ thuật được sử dụng trong thí nghiệm để phân tích các đại phân tử tích điện. Trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử người ta thường sử dụng phương pháp điện di để tách ly, phát hiện phân tử DNA tổng số, DNA bị cắt hạn chế và DNA của sản phẩm PCR.
Acid nucleotide là một phân tử tích điện âm, vì vậy, chúng có thể dịch chuyển qua bản gel từ cực âm sang cực dương dưới tác động của điện trường.
32
Trên cùng một bản gel, có cùng một dòng điện những phân tử DNA khác nhau về trọng lượng nên khác nhau về điện tích và chạy được những quãng đường khác nhau sau một thời gian như nhau. Sau khi phân tách bằng điện di, để phát hiện phân tử DNA người ta dùng phương pháp làm hiện hình bằng nhuộm. Đối với gel agarose, nhuộm bằng ethidium bromide, sẽ gắn xen các bazơ của phân tử DNA và phát quang dưới tia tử ngoại. Khi điện di kiểm tra DNA, thường sử dụng thang DNA chuẩn cùng với mẫu nghiên cứu, từ đó có thể biết trọng lượng phân tử của các DNA khác nhau [35].
Các bước điện di được tiến hành như sau
- Đổ gel: Với DNA tổng số chuẩn bị gel 0,8%, sản phẩm PCR chuẩn bị gel 1,2%.
- Chuẩn bị mẫu cho vào từng giếng: Điện di DNA tổng số, tra 3µl mẫu đã trộn đều cùng 1µl loading dye. Với sản phẩm PCR, 6µl trộn với 1µl load- ing dye. Mix đều, rồi tra mẫu vào giếng điện di. Marker được sử dụng để xác định kích thước của DNA là marker lambda DNA/EcoRI + HindIII hoặc marker 1kb và 100bp cho sản phẩm PCR.
- Tiến hành điện di: Đặt các thông số cho điện di (hiệu điện thế U = 100V; thời gian khoảng 30 - 45 phút).
- Nhuộm ethidium bromide, đem soi dưới tia UV xem băng vạch, DNA bắt màu thuốc nhuộm sẽ hiện lên dưới dạng các băng vạch màu da cam, quan sát và chụp ảnh sản phẩm điện di.
2.4.8 Phƣơng Pháp PCR
Thành phần của phản ứng
Thành phần Thể tích (µl)
Nước khử ion vô trùng 5,5
Master Mix 12,5
Primer 23S R 7pM 3
Primer 23S F 7pM 3
DNA mẫu 1
33
Các thành phần trên được trộn nhẹ nhàng trong ống eppendorf . Sau khi trộn đều, các ống eppendorf chứa hỗn hợp các thành phần của phản ứng được xếp vào máy chu kỳ nhiệt. Chu trình nhiệt theo tài liệu của Zhou Zheyang và cộng sự [36].
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Bước Chu trình Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian
1 Biến tính ban đầu 940C 3 phút
Biến tính 940C 30 giây
Gắn mồi 560C 30 giây
2 Lặp lại 40 chu kỳ Kéo dài mạch 720C 1 phút
Hoàn tất kéo dài
mạch 720C 8 phút
3 Kết thúc phản ứng 80C 10 phút →
∞
2.4.9. Phân tích trình tự đoạn gen 23S rARN
Sản phẩm PCR được làm sạch bằng Bộ sinh phẩm QIAquick PCR Pu- rification của hãng Qiagen (Đức) và được giải trình tự tại hãng Macrogen (Hàn Quốc).
Kết quả giải trình tự của gen có thể mang lỗi như đọc thiếu nucleotide; không xác định được nucleotide... Vì vậy cần tiến hành phân tích những sai sót đó, căn cứ vào trình tự trên hai mạch đơn theo nguyên tắc bổ sung giữa hai mạch. Phân tích được thực hiện bằng chương trình Blast và Clustal -W Mul- tiple-Sequence Alignment Program, phiên bản 2.0.11
34
CHƢƠNG III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Đặc điểm chung của các bệnh nhân
Trong nghiên cứu, chúng tôi lựa chọn được 30 bệnh nhân đồng thuận tham gia nghiên cứu. Có 17 bệnh nhân được xác định nhiễm H. pylori được điều trị bằng kháng sinh Clarithromycin và Amocicillin. Các bệnh nhân, sau điều trị quay lại lần hai để xét nghiệm sau 4-5 tháng
3.1.1. Đặc điểm về tuổi và giới
Đồ thị 3.1 là sự phân bố tuổi tác của 17 bệnh nhân nhiễm H. pylori.
Trong số 17 bệnh nhân được lựa chọn vào nghiên cứu có 10 là nam chiếm 58.8% 7 là nữ chiếm khoảng 42, 12%. Sự phân bố tuổi tác bệnh nhân được biểu thị ở đồ thị N01 . Các bệnh nhân có tuổi thọ trung bình 41,64
Như vậy, các bệnh nhân có độ tuổi tập trung chủ yếu từ 29-50. Đây là lứa tuổi phải chịu nhiều áp lực công việc, gia đình cũng như những thói quen sinh hoạt như hút thuốc, rượu chè...
3.1.2. Hình ảnh chụp nội soi dạ dày của các bệnh nhân
Hình ảnh nội soi dạ dày của 17 bệnh nhân cho thấy niêm mạc dạ dày bị phùnề, trượt và xuất huyết lan tỏa khắp niêm mạc. Các tổn thương thường nằm trên đỉnh các nếp gấp của niêm mạc dạ dày.
1 2 3 4 5
35
11 12 13 14 15
16 17
Hình 3.1. Ảnh chụp nội soi dạ dày xuất huyết của 17 bệnh nhân
3.2. Tách chiết DNA sinh thiết
Kết quả tách chiết DNA của các mẫu sinh thiết dạ dày của các bệnh nhân nhiễm H.pylori được trình bày trong hình 3.5. Như thấy trên hình 3.2, DNA tổng số được phân tách trên gel Agarose 1% hệ TAE cho một băng gọn, có kích thước khoảng 21,6 kb. Mẫu thu được không chứa RNA.
Hình 3.2. Ảnh điện di DNA tổng số
M: MarkerLambda DNA/EcoRI + HindIII 1-8: Một số mẫu DNA vi khuẩn
Tiếp theo, độ tinh sạch của mẫu DNA được xác định bằng đo OD ở hai bước sóng 280 và 280 nm. Kết quả đo cho thấy, các mẫu DNA có các giá trị C=OD260/OD280 biến thiên từ 1,82 - 2,00. Nồng độ DNA của mẫu nhận được
M 1 2 3 4 5 6 7 8
36 từ 2,2 µg/µl đến 2,9 µg/µl
Bảng 3.1. Độ sạch và nồng độ DNA của một số mẫu
TT Tên mẫu Độ sạch DNA (OD260 /OD280) Nồng độ DNA (µg/µl) TT Tên mẫu Độ sạch DNA (OD260 /OD280) Nồng độ DNA (µg/µl) 1 1A 1,91 2,80 19 9B 1,94 2,50 2 1B 1,85 2,75 20 10A 1,86 2,90 3 2A 1,86 2,80 21 10B 1,84 2,50 4 2B 1,89 2,58 22 11A 1,88 2,20 5 2C 1,88 2,46 23 11B 1,85 2, 39 6 3A 1,95 2,68 24 11C 1,75 2,20 7 3B 1,98 2,80 25 12A 1,96 2,50 8 4A 1,89 2,19 26 12B 1,87 2,40 9 4B 1,85 2,52 27 13A 1,92 2,20 10 5A 1,88 2,48 28 13B 1,98 2,70 11 5B 1,86 2,30 29 14A 1,86 2,40 12 6A 2,00 2,90 30 14B 1,96 2,35 13 6B 1,92 2,50 31 15A 1,82 2,40 14 7A 1,86 2,80 32 15B 1,98 2,20 15 7B 1,97 2,54 33 16A 1,86 2,50 16 8A 1,85 2,80 34 16B 1,84 2,70 17 8B 1,91 2,75 35 17A 1,80 2,30 18 9A 1,85 2,80 36 17B 1,81 2,50
3.3. Khuếch đại đoạn gen 23S rARN của H. pylori bằng PCR
DNA chiết xuất từ bệnh phẩm của 17 bệnh trước và sau điều trị kháng sinh được khuếch đại bằng cặp mồi 23S rARN bằng phương pháp PCR . Hình 3.3 giới thiệu một số kết quả nhận được.
Các phân tích điện di cho thấy, trong số 17 bệnh nhân có 10 người có kết quả PCR dương tính với H. pylori trước khi điều trị và âm tính vớiH. pylori
sau khi điều trị kháng sinh, trong khi đóH. pylori không được tiệt trừ trong 7 bệnh nhân có kết quả PCR dương tính cả trước và sau điều trị (bảng 3.2).
37
Hình 3.3. Ảnh điện di sản phẩm PCR
M: Marker 100bp
1,2,3,4,5,6,8,10: Sản phẩm PCR (+) 6,9: Sản phẩm PCR (-)