5. Điểm mới của đề tài
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
Trong công trình này tôi đã sử dụng một số phƣơng pháp nghiên cứu sau:
2.4.1. Các phương pháp vi sinh
2.4.1.1. Phương pháp phân lập tuyển chọn và bảo quản, nhân giống nấm men theo phương pháp Pasteur trên môi trường thạch đĩa.
- Phƣơng pháp mà tôi sử dụng là phƣơng pháp phân lập hộp petri, môi trƣờng phân lập là môi trƣờng Hasen
- Cách tiến hành: môi trƣờng phân lập đƣợc khử trùng và phân vào các hộp petri vô trùng và để nguội. Dịch hoa quả đƣợc pha loãng bằng nƣớc muối sinh lí 0,9% với độ pha loãng 109
-107
. Nhỏ 1-2 giọt huyền phù lên bề mặt thạch, dùng bàn trang đã vô trùng dàn đều 1 lƣợt. Sau đó gói kín và nuôi trong
tủ ấm ở 24o
C-28OC. Sau 2-3 ngày, trên bề mặt thạch xuất hiện các khuẩn lạc. Ta tiến hành chọn các khuẩn lạc to, trắng bóng có hình tròn, bề mặt nhẵn bóng, trên đỉnh có một núm nhỏ, mép có thể có răng cƣa hoặc nhẵn. Khi quan sát trên kính hiển vi điện tử các tế bào có hình ovan hoặc hình trứng. Đó là đặc trƣng của khuẩn lạc tế bào nấm men.
2.4.1.2. Phương pháp hoạt hóa giống
Các khuẩn lạc đƣợc chọn sẽ cấy vào thạch nghiêng để ở 24O
C-28OC trong 48 giờ, đƣợc giống cấp 1. Nấm men dung trong nhân giống tiếp đƣợc lấy từ thạch nghiêng. Để có số lƣợng nấm men lớn và có những tế bào trẻ, to, khỏe, tôi tiến hành hoạt hóa giống bằng cách nuôi trong môi trƣờng nhân giống ở 24O
C-28OC trong vòng 23 giờ trên máy lắc, đƣợc giống cấp 2. Dùng giống cấp 2 để lên men.
2.4.1.3. Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men
Gồm 2 phƣơng pháp sau:
Phương pháp cân bình trọng lượng:
Lên men trong các bình có thể tích 250ml, môi trƣờng có cùng một lƣợng tế bào nấm men của các giống khác nhau. Sau 24 giờ lên men đem cân trọng lƣợng bình một lần khi lệch giữa hai lần cân là 0,1 thì dừng lại.
Phương pháp xác định số lượng tế bào bằng buồng đếm Goriaev:
Cấy giống vào môi trƣờng nhân giống, nuôi ở 28, lắc đều canh trƣờng, dùng pipet chia độ loãng canh trƣờng. Sau đó dùng pipet lấy dung dịch pha loãng cho một giọt vào khe hở giữa lƣới đếm và kính.
Chú ý: tránh để rơi xuống các rãnh tạo thành bọt khí rùi đặt lá kính lên. Để yên 3-5 phút sau đó tiến hành soi trên kính hiển vi quang học ở vật kính x100 với độ phóng đại 1000 lần. Đếm số lƣợng tế bào trong 5 ô lớn chéo nhau theo công thức sau:
M=A.25.50.N
Trong đó: M: số lƣợng tế bào trong 1 ml dịch huyền phù N : độ pha loãng của dịch huyền phù
A: số lƣợng tế bào trung bình có trong 1 ô vuông
2.4.1.4. Phương pháp quan sát tế bào nấm men trên KHV quang học có độ phóng đại 1000 lần
Nấm men đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng nhân giống (MT2). Sau 24 giờ nuôi cấy ở 28o
C-300C, tiến hành nhuộm tiêu bản sống với xanhmetylen. Sau đó quan sát trên KHV quang học có độ phóng đại 1000 lần.
2.4.1.5. Xác định khả năng kết lắng
Hòa sinh khối nấm men vào dung dịch đệm axetat (có pH: 4,5) đƣợc đựng trong các ống nghiệm có hình dạng và kích thƣớc nhƣ nhau với thể tích dung dịch đệm và số lƣợng nấm men hòa tan bằng nhau. Lắc kỹ trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 3-5 phút, để lắng 15 phút. Lúc này toàn bộ khối dịch phân thành hai lớp (phía dƣới đáy của ống nghiệm là nấm men đã kết lắng). Ta tiến hành đo chiều cao của chủng nấm men trong từng ống nghiệm để xác định khả năng kết lắng của chủng nấm men. Ống nghiệm nào có chiều cao kết lắng cao nhất là chủng nấm men có độ kết lắng tốt nhất [11].
2.4.2. Phương pháp hóa học
2.4.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng đường bằng khúc xạ kế và xác định độ cồn bằng cồn kế
2.4.2.2. Phương pháp xác định nồng độ pH và máy đo pH
2.4.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng axit bằng chuẩn đọ với NaOH 0,1N có phenolphthalein làm chất chỉ thị màu
2.4.2.4. Phương pháp xử ly kết quả thu được bằng thống kê toán học
Giá trị trung bình số học: n Xi X n i 1
Độ lệch chuẩn: 1 ) ( 1 2 n X Xi n i (nếu n<30) n X Xi n i 1 2 ) ( (nếu n30) Sai số trung bình học: n m Hệ số biến thiên: M CV *100 Trong đó: n: số lần thí nghiệm
Xi: chỉ số thực nghiệm của lần thứ I (1 i n).
2.5. Phạm vi nghiên cứu
Chủng nấm men S.cerevisiae đƣợc phân lập trên đối tƣợng là dịch hỗn hợp quả táo mèo và quả nho Cabernet sauvignon.
2.6. Địa điểm nghiên cứu
Phòng thí nghiệm Vi sinh, khoa Sinh, trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2.
2.7. Thời gian nghiên cứu
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập chủng nấm men có khả năng lên men vang phối hợp từ táo mèo và nho Cabernet sauvignon mèo và nho Cabernet sauvignon
3.1.1. Các tỷ lệ phối hợp hai nguyên liệu táo mèo và nho Cabernet sauvignon dùng trong thí nghiệm sauvignon dùng trong thí nghiệm
Trong quá trình nghiên cứu tôi đã kết hợp thử hai nguồn nguyên liệu táo mèo và nho Cabernet sauvignon theo các tỷ lệ phối hợp khác nhau, cụ thể dƣới bảng 3.1:
Bảng 3.1. Các tỷ lệ phối hợp dịch siro táo mèo và nho Cabernet Sauvignon
Mẫu thí nghiệm Nguồn nguyên liệu Tổng số (%)
Táo mèo Nho
1 90 10 100 2 80 20 100 3 70 30 100 4 60 40 100 5 50 50 100 6 40 60 100 7 30 70 100 8 20 80 100 9 10 90 100
Trong các tỉ lệ phối hợp trên qua nghiên cứu tôi nhận thấy mẫu có tỉ lệ phối hợp 50%táo và 50%nho Cabernet sauvignon cho rƣợu có chất lƣợng cao hơn các mẫu còn lại.
3.1.2. Phân lập chủng nấm men có khả năng lên men vang phối hợp từ táo mèo và nho Cabernet sauvignon táo mèo và nho Cabernet sauvignon
Bằng phƣơng pháp phân lập nhƣ đã giới thiệu ở trên, với nguyên liệu ban đầu từ táo mèo và nho Cabernet sauvignon, tôi đã phân lập đƣợc 30
chủng nấm men. Từ những mẫu đó tôi tiến hành lựa chọn ra 3 chủng có đƣờng kính khuẩn lạc lớn nhất, trơn, nhẵn, bóng đƣa sang nghiên cứu tiếp. Tôi ký hiệu 3 chủng nấm nen này là H1, H2, H3.
H1 đƣợc phân lập từ mẫu thí nghiệm 6 (40% Táo 60% Nho). H2 đƣợc phân lập từ mẫu thí nghiệm 4 (60% Táo 40% Nho). H3 đƣợc phân lập từ mẫu thí nghiệm 5 (50% Táo 50% Nho).
Dƣới đây là hình ảnh chụp khuẩn lạc, thạch nghiêng và tế bào nấm men
S.cerevisiae :
Hình 3.1. Ảnh chụp nấm men H1 trên môi trường thạch nghiêng
Hình 3.3.Ảnh chụp tế bào nấm men H1 trên kính hiển vi quang học
3.2. Tuyển chọn và xác định tên khoa học của chủng nấm men có khả năng lên men vang phối hợp táo mèo và nho Cabernet sauvignon năng lên men vang phối hợp táo mèo và nho Cabernet sauvignon
3.2.1. Xác định tên khoa học của chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo và nho Cabernet sauvignon vang táo mèo và nho Cabernet sauvignon
Dựa vào khóa luận phân loại của Lodder năm 1972 tôi nhận thấy 3 chủng nấm men nghiên cứu trên đều có các đặc tính sau: sinh sản bằng nảy chồi nhiều phía, không đồng hóa nitrat, tế bào hình trứng, hình ovan hoặc hình cầu, lên men glucozo mạnh, lên men đƣợc saccarozo, galactozo, mantozo, trong điều kiện không thuận lợi hình thành từ 1 đến 8 bào tử. Vì vậy, tôi tạm thời đặt tên cho 3 chủng nấm men đã đƣợc lựa chọn là
Saccharomyces cerevisiae H1, H2, H3.
3.2.2. Tiêu chuẩn chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang phối hợp táo mèo và nho Cabernet sauvignon hợp táo mèo và nho Cabernet sauvignon
Nấm men có ảnh hƣởng tới toàn bộ quy trình sản xuất và chất lƣợng của rƣợu vang. Vì vậy, phải tuyển chọn ra chủng tốt nhất để lên men. Nấm men sử dụng để lên men rƣợu vang từ dịch trái cây (trong đó có dịch táo mèo và nho Cabernet sauvignon) phải đạt đƣợc những yêu cầu cơ bản sau [12]:
Lên men tốt trong điều kiện có hàm lƣợng đƣờng cao.
Chịu độ cồn và độ axit cao.
Có hiệu suất lên men cao.
Tốc độ phát triển nhanh, chu kỳ lên men ngắn.
Tạo hƣơng thơm đặc trƣng, không có vị lạ, không sinh độc tố.
Dễ lắng trong, ổn định lâu dài trong sản xuất.
3.2.2.1. Nghiên cứu hoạt lực lên men của cả 3 chủng nấm men đã tuyển chọn
Hoạt lực lên men đƣợc đánh giá bằng hàm lƣợng CO2 thoát ra trong quá trình lên men, lƣợng CO2 thoát ra càng nhiều thì chứng tỏ hoạt lực lên men càng lớn. Tôi đã tiến hành nghiên cứu hoạt lực lên men trên môi trƣờng dịch siro phối hợp táo mèo và nho Cabernet sauvignon (50% táo và 50% nho
Cabernet sauvignon). Tiến hành lên men trong 3 bình tam giác với dung tích
150 ml trong thời gian là 48h tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Bảng 3.2. Thử hoạt lực lên men của 3 chủng nấm men H1, H2, H3
Tên chủng Trọng lƣợng bình ban đầu(m1)(g) Trọng lƣợng bình sau 2 ngày(m2)(g) Trọng lƣợng bình sau khi CO2 thoát ra(m3)(g) Hàm lƣợng CO2 thoát ra(m2- m3)(g) H1 130,78 130,7 130,65 0,13 H2 108,08 108,07 108 0,08 H3 1131,70 131,5 131,68 0,02
Từ kết quả trên tôi nhận thấy chủng nấm men có hoạt lực lên men mạnh nhất là chủng H1.
3.2.2.2. Xác định khả năng kết lắng của 3 chủng nấm men đã tuyển chọn
nào tốt nhất để sử dụng vào việc lên men cho sản phẩm vang có chất lƣợng tốt. Tôi tiến hành hòa sinh khối nấm men vào dung dịch đệm axetat (có pH=4,5) đƣợc đựng trong 3 ống nghiệm có hình dạng và kích thƣớc nhƣ nhau với thể tích của dung dịch đệm và số lƣợng nấm men hoàn toàn bằng nhau. Lắc kỹ trên máy với tốc đọ 200 vòng/phút trong thời gian 5 phút, để lắng 30 phút. Lúc này toàn bộ khối dịch phân thành 2 lớp (phía dƣới đáy của ống nghiệm là nấm men đã kết lắng). Tôi tiến hành đo chiều cao lớp kết lắng của 3 chủng nấm men H1, H2, H3 thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Bảng 3.3. Khả năng kết lắng của 3 chủng nấm men H1, H2, H3
Tên mẫu nấm
men H1 H2 H3
Chiều cao cột
sinh khối (mm) 16 14 13.5
Theo kết quả ở bảng trên tôi nhận thấy chủng H1 có khả năng kết lắng tốt nhất tiếp theo là mẫu H2, kém nhất là mẫu H3.
Vậy chủng nấm men S.cerevisiae H1 có khả năng kết lắng tốt nhất. 3.2.2.3. Nghiên cứu khả năng lên men đường
Tôi tiến hành nghiên cứu trên môi trƣờng dịch siro táo mèo và nho
Cabernet sauvignon (50% táo và 50% nho Cabernet sauvignon) hàm lƣợng
đƣờng đạt 250g/l, pH:4, nhiệt lên lên men từ 25-280C, số lƣợng giống ban đầu là 3,2 x 106 tế bào/ml. Xác định các chỉ tiêu cần thiết thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Bảng 3.4. Khả năng lên men đường của 3 chủng nấm men H1, H2, H3 STT Chỉ tiêu đánh giá Tên chủng nấm men H1 H2 H3 Đƣờng tổng số g/l 250±0,2 250±0,2 250±0,2 HL đƣờng sót % 5,5±0,01 6,25±0,03 6,5±0,2 HL cồn %V 9,2±0,03 9,0±0,02 8,7±0,01
Qua bảng trên tôi nhận thấy chủng nấm men H1 cho hàm lƣợng cồn cao nhất tiếp đó là chủng H2 và H3.
3.2.2.4. Khả năng lên men ở các độ pH khác nhau
Để xác định khả năng lên men của 3 mẫu nấm men H2, H2, H3 ở các độ pH khác nhau, tôi tiến hành lên men trong môi trƣờng dịch siro phối hợp táo mèo và nho Cabernet sauvignon (50% táo và 50% nho Cabernet sauvignon),
nhiệt độ 25-280
C, với số lƣợng giống ban đầu 3,2 x 106 TB/ml, pH biến đổi ở các mức: 3: 3,5: 4: 4,5: 5. Xác định hàm lƣợng CO2/l môi trƣờng sau 24h nuôi cấy tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Bảng 3.5. Khả năng lên men ở các độ pH khác nhau của 3 chủng nấm men H1, H2, H3 Mẫu pH 3 3,5 4 4,5 5 H1 + +++ +++ +++ ++ H2 + ++ ++ +++ +++ H3 + ++ ++ +++ ++
Trong đó: +++: Hàm lƣợng CO2 tạo ra trên 40g/l dịch lên men ++: Hàm lƣợng CO2 tạo ra từ 30-40g/l dịch lên men +: Hàm lƣợng CO2 tạo ra dƣới 30g/l dịch lên men
Phân tích kết quả trên tôi thấy ở pH=5 hàm lượng CO2 thoát ra mạnh nhất nên chủng H2 có khả năng lên men mạnh nhất tại đó, nhưng pH phù hợp với dịch quả là từ 3,5-4,5. Vì vậy tôi khẳng định rằng: chủng H1 có khả năng lên men tốt nhất trong môi trường dịch quả (pH=3,5-4,5).
3.2.2.5. Khả năng tạo hương thơm và độ trong của sản phẩm
Sau khi kết thúc lên men, tôi xác định khả năng tạo hƣơng thơm và độ trong của sản phẩm bằng phƣơng pháp cảm quan: mở nút từng bình lên men với 3 chủng nấm men H1, H2, H3 rồi đƣa lên mũi để so sánh hƣơng thơm và đƣa gần lên mắt hơn để quan sát kỹ độ trong của các bình.
Bảng 3.6. Khả năng tạo hương thơm và độ trong của 3 chủng nấm men
STT Chỉ tiêu đánh giá
Tên chủng nấm men
H1 H2 H3
1 Độ thơm Thơm Ít thơm Ít thơm
2 Độ trong Trong Trong Trong
Kết quả cho thấy chủng H1 và chủng H2 đạt hương thơm tốt hơn chủng H3. Tổng hợp tất cả các chỉ tiêu về kết quả nghiên cứu của 3 chủng nấm men,
tôi thu đƣợc kết quả dƣới bảng 3.7 sau:
Bảng 3.7. Tổng hợp kết quả tuyển chọn chủng nấm men
STT Chỉ tiêu đánh giá Chủng
H1 H2 H3
1 Độ trong của sản phẩm 3 2 1
2 Khả năng lên men ở pH thấp 3 2 1
3 Hàm lƣợng cồn cao 3 2 1
4 Đánh giá chung 3 2 1
5 Tổng điểm 12 8 4
Như vậy, chủng mang nhiều đặc tính tốt nhất là H1. Do đó tôi quyết định chủng H1 cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.3. Nghiên cứu động thái phát triển của chủng nấm men H1 trong môi trƣờng nhân giống
Việc nghiên cứu động thái sinh trƣởng, phát triển của chủng H1 chiếm một phần quan trọng trong quá trình sản xuất rƣợu vang. Để xác định động thái sinh trƣởng của chủng nấm men tôi tiến hành nuôi cấy trên môi trƣờng nhân giống trong điều kiện nhiệt độ 280C, số lƣợng tế bào ban đầu là 3,2 x 106 tế bào. Cứ sau 4h tôi lại kiểm tra số lƣợng tế bào một lần. Tôi thu đƣợc kết quả nhƣ bảng 3.8 và hình 3.4 dƣới đây:
Bảng 3.8. Động thái phát triển của chủng nấm men H1 trong môi trường nhân giống TG (h) SLTB (H x 106) 0 3,2 ± 1,1 4 6 ± 0,2 8 12 ± 1 12 40 ± 0,8 16 85 ± 0,45 20 120 ± 0,38 24 129 ± 0,35 28 133 ± 0,3 32 130 ± 0,28 36 128 ± 0,2 40 123 ± 0,2 44 120 ± 0,2 48 120±0,2
Hình 3.4. Đồ thị động thái phát triển của chủng nấm men H1 trong môi trường nhân giống
Dựa vào bảng 3.8 và hình 3.4 ta thấy số lƣợng tế bào trong 8h đầu tăng chậm. Lƣợng tế bào tăng nhanh nhất từ 8h đến 12h. từ 24-28h số lƣợng tế bào tăng chậm, ổn định và đạt giá trị cực đại là 133x106
TB/ml. Từ 28h-48h số lƣợng tế bào bắt đầu giảm. Qua đó có thể chia quá trình sinh trƣởng của chủng nấm men H1 thành 4 giai đoạn:
Giai đoạn 1: từ 0h – 8h ứng với pha tiềm phát. Giai đoạn 2: từ 8h – 24h ứng với pha logarit. Giai đoạn 3: từ 24h – 28h ứng với pha cân bằng. Giai đoạn 4: từ 28 – 48h ứng với pha suy vong.
Thí nghiệm này nhằm mục đích xác định thời điểm số lƣợng tế bào đạt cực đại qua đó chọn đƣợc thời gian nhân giống thích hợp. Như vậy tôi xác định được rằng thời gian nhân giống thích hợp nhất cho chủng nấm men H1 là 24h – 28h. Kết quả này phù hợp với các kết quả nghiên cứu của tác giả