Chúng tôi lựa chọn phƣơng pháp phân tích bằng LCMS/MS vì đây là phƣơng pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phù hợp để phân tích các mẫu dƣ lƣợng trong môi trƣờng. Bên cạnh đó, phƣơng pháp này đảm bảo có thể phân tích đồng thời nhiều chất, đảm bảo phân tách tốt các kháng sinh đã chọn.
50
Trong phƣơng pháp phân tích bằng LCMS/MS, tùy theo tính chất và cấu trúc phân tử của chất phân tích mà chúng ta lựa chọn kỹ thuật ion hóa khác nhau. Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn ion hóa theo kỹ thuật phun sƣơng tĩnh điện (ESI) tạo ion dƣơng. Sản phẩm của quá trình ion hóa này thông thƣờng là [M+H]+
. Mỗi ion phân tử này, qua quá trình bắn phá ở tứ cực thứ hai với các điều kiện khác nhau sẽ tạo ra nhiều ion con khác nhau. Tuy nhiên, với phƣơng pháp định lƣợng bằng LCMS/MS, chúng ta lựa chọn hai ion con có cƣờng độ lớn và ổn định nhất để tiến hành phân tích. Số lƣợng các ion mẹ và ion con nhƣ vậy đã đáp ứng yêu cầu của AOAC và Châu Âu.
Mặt khác, với việc sử dụng detector MS, phƣơng pháp đã xây dựng không yêu cầu các chất phân tích phải tách nhau hoàn toàn bởi sắc ký lỏng nhƣ khi sử dụng các detector khác nhƣ DAD hay RF đã đƣợc sử dụng trong các nghiên cứu trƣớc đây về dƣ lƣợng kháng sinh [10]. Các kháng sinh có thể tách nhau hoàn toàn bởi ion phân tử và các ion con đặc trƣng mặc dù thời gian lƣu có thể rất gần nhau. Quá trình tách bằng sắc ký lỏng có tác dụng tách các chất phân tích ra khỏi ảnh hƣởng của các tạp chất có trong nền mẫu.
Việc sử dụng cột và pha động sắc ký lỏng có vai trò phân tách và loại bỏ ảnh hƣởng của nền mẫu đối với quá trình ion hóa của các chất. Chúng tôi tiến hành khảo sát và lựa chọn hệ pha động theo chế độ gradient với tỷ lệ nƣớc và acetonitril thay đổi theo thời gian nhằm mục đích tách các chất phân tích khỏi các chất có trong nền mẫu có tính phân cực cao hơn và thấp hơn so với chúng.
Về lựa chọn cột sắc ký, trong nghiên cứu này chúng tôi chỉ sử dụng cột C18 với các kích thƣớc khác nhau do đây là loại cột pha đảo phù hợp để phân tích đối với đa số kháng sinh. Các thông số về kích thƣớc hạt, chiều dài và đƣờng kính của cột sẽ ảnh hƣởng đến hiệu suất tách của cột. Sử dụng
51
cột Agilent SB C18 (50mm x 2,1mm; 1,8 μm), các chất phân tách tốt hơn và thời gian phân tích ngắn hơn so với cột Agilent Zorbax Eclipse XDB- C18 (150mm x 3mm; 3,5 μm) nhƣng dung lƣợng thấp hơn, không thể sử dụng để phân tích với thể tích tiêm mẫu lớn.
Phổ khối của các kháng sinh nghiên cứu ở điều kiện phân tích và sắc ký đồ hai ion con của từng chất đƣợc phân tách rõ ràng mặc dù thời gian lƣu khá gần nhau.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn sử dụng chuẩn nội đồng vị Trimethoprim 13C3. Chất chuẩn nội này đáp ứng yêu cầu phân tích do: ít bị ảnh hƣởng bởi nền mẫu và có tính chất tƣơng tự các chất phân tích. Đây là chuẩn nội chƣa đƣợc sử dụng trong các nghiên cứu về dƣ lƣợng kháng sinh trong nƣớc, khó khăn trong việc mua và sử dụng do giá thành cao; tuy nhiên, lại là chất chuẩn nội yêu cầu đƣợc khuyến cáo nên sử dụng đối với các nghiên cứu về dƣ lƣợng trong các mẫu môi trƣờng, sử dụng phƣơng pháp LCMS/MS.
Về quy trình xử lý mẫu, qua tham khảo các tài liệu, chúng tôi chọn phƣơng pháp chiết pha rắn sử dụng cột chiết HLB (hydrophilic lipophilic balance). Đây là loại cột chiết thích hợp với đa số kháng sinh do có cả phần thân nƣớc và thân dầu, phù hợp với cấu tạo của các chất phân tích. Chúng tôi tiến hành khảo sát quy trình xử lý mẫu với hai thông số: thể tích mẫu chiết và loại dung môi rửa giải do đây là hai yếu tố ảnh hƣởng quyết định đối với hiệu suất chiết mẫu.