* Phân đoạn cDNA qua cột
- Dừng phản ứng lai ở bƣớc trên bằng cách chuyển ống phản ứng từ 16oC lên 70oC trong 10 phút sau đó chuyển lên đá lạnh.
- Chuẩn bị dung dịch đệm TEN (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 0,1 mM EDTA; 25 mM NaCl).
- Chuẩn bị cột lọc (cDNA size fractionation columns): cố định cột lọc lên một ống falcon 15 ml, sau đó dựng ống falcol lên giá đỡ.
- Rửa cột lọc: Bỏ nắp trên và nắp dƣới của cột lọc để cho dung dịch trong cột (cồn) chảy ra hoàn toàn (chảy vào ống falcon). Sau khi cồn đã chảy hết hoàn toàn,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
bổ sung 0,8 ml đệm TEN vào cột để rửa cột. Để có thể đảm bảo cồn trong cột lọc đã đƣợc loại ta hoàn toàn ta lặp lại bƣớc rửa thêm 3 lần nữa.
- Trong khi chờ dịch trong cột chảy hết hoàn toàn, chuẩn bị 20 ống Eppendorf 1,5 ml đánh số từ 1 đến 20 đặt lên 1 giá đỡ.
- Bổ sung 100 µl dịch đệm TEN vào 50 µl dung dịch cDNA đã gắn đoạn attB1 đã dừng phản ứng, trộn đều và ly tâm nhẹ. Chuyển cột lọc lên ống Eppendorf 1 rồi đƣa toàn bộ hỗn hợp dung dịch trên (150 µl) vào cột lọc. Để dịch trong cột lọc chảy hết vào ống Eppendorf 1, chuyển cột sang ổng Eppendorf 2 rồi bổ sung 100 µl dịch đệm TEN và để dịch trong cột chảy hết. Chuyển cột lọc sang ống Eppendorf 3 rồi tiếp tục bổ sung 100 µl dich đệm TEN. Bắt đầu từ ống 3 cứ mỗi giọt dịch chảy xuống sẽ chuyển cột lọc sang ống tiếp theo cho đến hết 18 ống còn lại. Nếu dịch trong cột chảy hết trƣớc khi chuyển sang ống thứ 20 thì tiếp tục bổ sung 100 µl dịch đệm TEN lên cột và tiếp tục cho đến ống thứ 20 thì dừng. Trong quá trình lọc qua cột, những đoạn cDNA có kích thƣớc lớn sẽ qua trƣớc, sau đó sẽ đến những đoạn nhỏ hơn.
* Xác định nồng độ cDNA
- Chuẩn bị đĩa thạch agarose 1% có chứa ethidium bromide nhƣ sau: Hòa 1mg agarose vào 100 ml đệm TAE 1X, đun nóng cho thạch agarose tan hoàn toàn, rồi để nguội trong ít phút. Bổ sung 10 µl ethidium bromide (nồng độ 10 mg/ml) vào dung dịch agarose đạt nồng độ cuối cùng là 1 µg/ml. Trộn đều hỗn hợp. Đổ thạch agarose vào đĩa petri (khoảng 15 ml cho đĩa có kích thƣớc 100 x 15 mm), để ở nhiệt độ phòng cho tới khi đĩa thạch đông lại (lưu ý: để đĩa thạch ở chỗ tối để tránh sự phân hủy của ethidium bromide).
- Chuẩn bị mẫu DNA pEXP7-tet đối chứng theo thang nồng độ chuẩn: 50 ng/ µl; 25 ng/ µl; 10 ng/ µl; 5 ng/ µl và 1 ng/ µl.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 2. 5. Đánh dấu đĩa thạch agarose 1% dùng để xác định nồng độ cDNA
- Nhỏ 1 µl mẫu DNA đối chứng (pEXP7-tet) ở các nồng độ khác nhau vào đúng ô theo kí hiệu. Tiếp theo, nhỏ 1 µl mẫu cDNA từ các ống đã đánh số 1 đến 20 thu đƣợc ở bƣớc trên vào các ô tƣơng ứng đã đánh dấu trên đĩa. Để các giọt dịch khô tự nhiên trên đĩa thạch (khoảng 10 - 15 phút). Sau đó, đƣa đĩa thạch lên soi trên tia UV và chụp ảnh ghi lại kết quả. Căn cứ vào nồng độ chuẩn của mẫu đối chứng để dự đoán nồng độ của các ống mẫu chứa cDNA thu đƣợc.