21 T No 1 B1 Bộ môn cây lương thực 22 T22 Ve 1-1-1-1-1311 Bộ môn di truyền giống
3.4.3. đánh giá ựa dạng di truyền của các dòng bố mẹ theo chỉ thị phân tử RAPD
RAPD
3.4.3.1. Kỹ thuật PCR- RADP
- Phương pháp RADP ựược Wiliam, Welsh, McCleland ựề xuất vào năm 1990. Phương pháp này thực chất là quá trình nhân bản các ựoạn AND bằng kỹ thuật PCR có sử dụng các mồi ựược thiết kế ngẫu nhiên. Các mồi này sẽ bắt cặp một cách ngẫu nhiên vào AND khuôn ở bất kỳ vị trắ nào mà tại ựó có trình tự bổ sung với nó.
- Phương pháp RADP phù hợp cho phân tắch ựa dạng di truyền và phân tắch các dòng gần ựồng gen ( các dòng chỉ khác nhau ở một tắnh trạng).
3.4.3.2. Các bước tiến hành
* Chuẩn bị mẫu, tách chiết AND
- Chuẩn bị mẫu lá ngô: Mẫu lá của các dòng ngô ựược thu từ những cây treo biển ựánh dấu cho vào ống eppendort 2ml, sau ựó nhanh chóng cho vào ni tơ lỏng. Mẫu lá ựược dùng ngay hoặc bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt ựộ - 85 oC.
- Tách chiết AND tổng số theo phương pháp Nobou Kobabayshi( 1998) cải tiến.
+ Bước 1: Nghiền mô lá non bằng 1000ộl buffer 1 ựến khi thành dung dịch ựồng thể, chuyển vào ống ependorff 1,5ml.
+ Bước 2: Ly tâm 12000 rpm trong 5 phút ở 4oC, loại bỏ lớp dịch phắa
trên.
+ Bước 3: Bổ sung 300 ộl buffer 2 và 200 ộl buffer 3, lắc nhẹ và ủ
650C trong vòng 15 phút.
+ Bước 4: Bổ sung 700 ộl dung dịch với tỷ lệ 24:1, ựảo trộn thành dung dịch ựồng nhất, ựể ở nhiệt ựộ phòng 15 phút.
+ Bước 5: Ly tâm 12000 rpm trong 15 phút. Chuyển dịch trong sang ống mới (có thể lặp lại vài lần Bước 4-Bước 5).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 26
+ Bước 6: Bổ sung 350 ộl Isopropanol lạnh, ựảo trộn nhẹ. để trong tủ lạnh sâu 30 phút hoặc lâu hơn.
+ Bước 7: Ly tâm 12000 rpm trong vòng 15 phút ở 40C ựể thu tủa.
+ Bước 8: Rửa tủa bằng 700 ethanol và ựể khô trong không khắ.
+ Bước 9: Hòa tan tủa bằng 50 ộl TE, bảo quản ở -200C.
* Phương pháp PCR- RADP + Các mồi sử dụng:
Sử dụng 9 mồi theo bảng 3.2
Bảng 3.2 Tên và trình tự các mồi sử dụng trong thắ nghiệm
STT Tên mồi Trình tự mồi
1 OPA-03 AGTCAGCCAC 2 OPA-12 TCGGCGATAG 3 OPB-07 GGTGACGCAG 4 OPB-17 AGGGAACGAG 5 OPC-05 GATGACCGCC 6 OPC-11 AAAGCTGCGG 7 OPF-05 GTGATCGCAG 8 OPL-11 ACGATGAGCC 9 OPM-02 ACAACGCCTC + Cách thực hiện
Phản ứng RAPD ựược tiến hành với các mồi ngẫu nhiên theo phương pháp của Foolad và cộng sự (1990).
Phản ứng RAPD ựược thực hiện trong 25 ộl dung dịch với thành phần trong bảng 3.3. Tiến hành nhân bản DNA trong máy PCR với chu trình nhiệt của phản ứng RAPD là 1 chu kì 94oC trong 5 phút; 45 chu kì với nhiệt ựộ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 27
(92oC trong 1 phút, 36oC trong 1 phút, 72oC trong 1 phút 30 giây); 1
chu kì 72oC trong 10 phút; lưu giữ ở 4oC.
* điện di sản phẩm RAPD
Pha agarose 2% trong TAE 1X. Chạy ựiện di với hiệu ựiện thế 100V trong 90 phút. Nhuộm bản gel bằng ethidium bromide 0,5 ộg/ml trong 15 phút, rửa sạch bằng nước, soi gel trên ựèn UV và chụp ảnh.
Bảng 3.3 Thành phần phản ứng RAPD Số thứ tự Thành phần Thể tắch (ộl) 1 H2O 16.5 2 Buffer PCR 2.5 3 MgCl2 (25 mM) 2 4 dNTP (2.5 mM) 1 5 Primer (10 mM) 1 6 DNA 1 7 Enzyme 1 Tổng 25
* Phân tắch số liệu RAPD
Dựa trên sự xuất hiện hay không xuất hiện của các phân ựoạn DNA khi ựiện di sản phẩm RAPD của các giống ngô nổ với các ựoạn mồi ngẫu nhiên ựể làm cơ sở cho sự phân tắch số liệu theo quy ước: Số 1: xuất hiện phân ựoạn DNA, số 0: không xuất hiện các phân ựoạn DNA.
Các số liệu này ựược xử lý trên máy vi tắnh theo chương trình NTSYSpc version 2.0 ựể xác ựịnh quan hệ di truyền của các giống ngô ở mức ựộ phân tử.