Địa điểm
Cóc và ếch đồng sau khi được thu thập tại tỉnh Tiền Giang được thực hiện mỗ khám tại phòng thí nghiệm Bệnh ký sinh trùng, Bộ môn Thú Y, Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ.
Đối tượng khảo sát
Cóc và ếch đồng, không phân biệt giới tính, lứa tuổi.
b. Vật liệu
Dụng cụ
- Kính lúp, kính hiển vi, máy chụp ảnh, giấy thấm, cân tiểu ly điện tử. Hình 3.1 Bản đồ hành chính tỉnh Tiền Giang
22
- Dụng cụ thủy tinh: Cốc, lọ, bình tam giác, đũa thủy tinh, phiến kính, lá kính, đĩa petri, ống nghiệm, lọ peni đựng mẫu, ống đong.
- Dụng cụ mổ khám: Kéo, dao, kẹp, khay mổ khám, viết chì, sổ ghi chép, kim giải phẫu, bút lông, bao tay, khẩu trang.
Hóa chất
Formaldehyde 38%, cồn 70o, NaCl tinh thể, glycerin, acid HCl, KOH 10%, dung dịch Carmin, nước cất.
Cách pha hóa chất
- Cồn: Pha theo công thức sau: C1 V1 = C2 V2 với: C1: Nồng độ cồn đem pha V1:Thể tích cồn đem pha C2: Nồng độ cồn cần pha V2 : Thể tích cồn cần pha - Dung dịch barbagallo: Formaldehyde 30 ml NaCl 7,5 gram Nước cất 970 ml - Dung dịch tiêu cơ:
Men pesin 1% HCl nguyên chất 1% NaCl 0,2% Nước cất 97,8%
23 - Dung dịch Carmin: Carmin gốc 5 gram HCl đậm đặc 2 ml Cồn 90o vừa đủ 100 ml Cách tiến hành:
Nghiền 5 gram Carmin với 2 ml HCl.
Để yên 1 giờ sau đó cho cồn 90o vào lắc đều. Đun cách thủy chậm đến khi carmin tan hết. Bổ sung cồn 90o vào vừa đủ 100 ml.
Cho vào lọ màu để bảo quản. - Nước muối 0,9%
NaCl tinh thể 0,9 gram Nước cất 100 ml - KOH 10%
KOH tinh thể 10 gram Nước cất 100 ml - Glycerin 50% Glycerin đậm đặc 50 ml Nước cất 50 ml c. Mổ khám và thu thập mẫu Mổ khám
Cóc và ếch được thu mua tại các chợ thuộc các huyện khác nhau trên địa bàn tỉnh Tiền Giang, tiến hành mổ khảo sát theo phương pháp mổ khám từng phần của viện sĩ Skrjabine và thu thập giun sán tại phòng thí nghiệm Bệnh ký
24
sinh trùng, Bộ môn Thú Y, Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ.
Cóc và ếch trước tiên được hủy tủy và đem cân trọng lượng, sau đó cắt
đầu, lột da kiểm tra cơ, sau đó mổ lấy các cơ quan nội tạng ra. Tách các cơ
quan tiêu hóa, hô hấp, bài tiết, tim, chú ý không làm xáo trộn các khí quan. Sau đó kiểm tra xoang ngực, xoang bụng, lấy nước trong các xoang cho vào
đĩa petri để kiểm tra giun sán ký sinh.
Kiểm tra cơ: Trước tiên kiểm tra bằng mắt thường các cơ vùng tay, cơ
thăn, cơ hoành, cơ đùi xem có những đốm trắng nổi trên cơ hay không. Nếu có ta cắt vùng cơ có nốt trắng ép giữa 2 phiến kính và xem dưới kính hiển vi, nếu là ấu trùng giun sán ta tiến hành làm tiêu cơ. Lấy khoảng 10 – 50 gram vùng cơ có ký sinh trùng cho vào lọ thủy tinh. Cho 10 – 20 ml dung dịch tiêu cơ. Để
trong tủ ấm 37 – 38 oC trong 6 – 12 giờ. Cơ thịt bị tiêu hóa và để lộ ấu trùng. Lấy cặn kiểm tra dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 10x10 hoặc 10x40 để tìm
ấu trùng và các dạng cyst khác.
Kiểm tra mắt: Dùng dao rạch theo khóe mắt, sau đó dùng kẹp để tách mắt ra cho vào cốc có mỏ hay cho vào đĩa petri, đồng thời dùng bình tia xịt vào hốc mắt, nước từ hốc mắt chảy ra cho vào cốc, bóp nát hai mắt sau đó gạn rửa sa lắng nhiều lần để tìm giun tròn hay sán lá có hiện diện trong đó không
Kiểm tra cơ quan tiêu hóa: Tách các bộ phận gồm dạ dày, ruột, gan. Dạ dày được cắt dọc theo đường cong nhỏ hay đường cong lớn, cho chất chứa vào cốc, dùng phương pháp gạn rửa sa lắng nhiều lần để tìm giun sán.
Ruột được cắt dọc theo chiều dài của ruột, sau đó cho vào cốc với dung dịch nước muối NaCl 0,9% khấy mạnh để cho giun sán tách ra, rồi dùng phương pháp gạn rửa sa lắng để tìm giun sán.
Gan được bóp nất gạn rửa sa lắng để kiểm tra.
Kiểm tra cơ quan hô hấp: Bóc phổi cho vào cốc và bóp nát, sau đó gạn rửa sa lắng để kiểm tar giun sán.
Kiểm tra hệ tuần hoàn: Bóc tim cho vào cốc và bóp nát, sau đó gạn rửa sa lắng để kiểm tra.
Kiểm tra hệ bài tiết: Thận được cho vào cốc, bóp nát và gạn rửa sa lắng
25
Thu thập
Thu thập và tính số giun sán khi mổ khám. Lấy kim giải phẫu hoặc ống hút để lấy giun sán.
Đối với sán lá dùng ống hút hút sán lá cho vào đĩa petri chứa nước sạch, sau đó hút cho vào ống nghiệm thủy tinh có nút mài, sau đó cho cồn 70o vào và ghi nhãn. Do sán lá rất mỏng nên không cần ép mỏng.
Đối với giun tròn cũng thực hiện như sán lá nhưng được trữ trong dung dịch barbagallo.
Muốn tính số giun sán, ta cho giun sán vào đĩa petri có sơn đen ½ đĩa petri rồi cứ đếm dần và chuyển số giun sán đã đếm sang một bên, đếm xong cho vào ống nghiệm có dung dịch bảo quản mẫu và ghi nhãn hiệu bằng giấy bóng mờ hoặc giấy tập bình thường và được viết bằng bút chì.
Lập sổ mổ khám để ghi nhận kết quả trong quá trình mổ khám, ghi rõ các chi tiết ngày mổ khám, số thứ tự, trọng lượng, vị trí ký sinh, lớp giun sán ký sinh. Sau đó ghi nhãn các mẫu giun sán thu thập được.
Cách ghi nhãn trước và sau khi định danh
Trước khi định danh: Ghi rõ số thứ tự ếch được mổ khám, trọng lượng,
địa điểm lấy mẫu, ngày mổ.
Sau khi định danh: Ghi tên giun sán đã được dịnh danh, số lượng giun sán, vị trí ký sinh, người mổ khám, ngày mổ khám.
Ếch số Trọng lượng Địa điểm lấy mẫu Ngày mổ khám Sơ bộđịnh danh Số lượng Vị trí ký sinh Người lấy mẫu Ngày lấy mẫu
26
Giun sán được bảo quản trong các dung dịch sau:
- Đối với giun tròn được bảo quản trong dung dịch barbagallo. - Đối với sán lá, sán dây được bảo quản trong cồn 70o.
d. Phương pháp xử lý giun sán đểđịnh danh.
Trong quá trình mổ khám, có một số loài giun sán có thể phân loại được bằng mắt thường. Nhưng phần nhiều các loài giun sán phải được nhuộm, làm trong suốt rồi quan sát dưới kính lúp hoặc kính hiển vi để phân loại tùy theo từng lớp giun sán mà ta có cách xử lý khác nhau.
Đối với giun tròn.
Làm trong suốt mẫu giun tròn bằng cách cho giun tròn vào ống nghiệm chứa cồn 70o và glycerin 5% trong một vài ngày cồn bốc hơi, glycerin còn lại sẽ ngấm vào tổ chức của giun tròn, làm trong suốt và không gây biến dạng đột ngột như khi ta đặt giun tròn trong glycerin.
Những giun tròn bảo quản trong dung dịch nay có thể trữ mẫu nhiều năm trong ống nghiệm có nút mài. Để phân loại giun tròn, ta lấy giun ra cho lên phiến kính, nhỏ một giọt glycerin và đậy lá kính lên, quan sát dưới kính hiển vi để phân loại, hoặc có thể làm trong giun tròn trong dung dịch glycerin 50%, cho giun tròn lên phiến kính rồi nhỏ glycerin 50% lên trên đậy lá kính lại, đợi 6 – 24h, giun trong quan sát dưới kính hiển vi đểđịnh danh.
Đối với sán lá.
Để làm rõ các bộ phận bên trong giúp công tác định danh được dễ dàng, sán lá rất mỏng và nhỏ nên chỉ cần làm trong mẫu sán.
Đối với sán lá rất mỏng và nhỏ, chỉ cần làm trong sán lá bằng dung dịch glycerin 50% mà không cần ép, rồi xem dưới kính hiển vi để định danh phân loại.
Đối với mẫu ấu trùng sán lá, cho ấu trùng lên phiến kính, nhỏ glycerin 50% lên trên và xem dưới kính hiển vi để phân loại mà không cần đậy lá kính vì sẽ làm vỡ cơ quan bên trong của ấu trùng.
Đối với sán lá trưởng thành, những loài sán lá hơi dày được ép giữa hai phiến kính với dung dịch glycerin 50%, đợi 24 giờ, sán trong, xem dưới kính hiển vi và phân loại.
27
Phương pháp nhuộm tiêu bản sán lá
Muốn xem thật chi tiết cấu tạo bên trong phải tiến hành nhuộm mẫu với thuốc nhuộm Carmin theo trình tự sau:
Sán dây cần ép được ngâm trong dung dịch KOH 10% trong 5-15 phút cho đến khi thấy sán trong là được.
Vớt sán dây ra rửa sạch với nước cất 5 lần mỗi lần 5-15 phút.
Rút nước trong mẫu sán dây bằng cách lần lượt ngâm sán trong các lọ
cồn 50o, 60o, 70o, mỗi lọ ngâm khoảng 30 phút.
Sau đó cho mẫu sán vào dung dịch Carmin từ 5-15 phút tùy theo sán dày hay mỏng.
Tiếp theo bảo quản lần lượt trong cồn 70o, 80o, 85o, 90o, 95o, 99,9o. Cho mẫu sán vào xylen thời gian tùy theo sán dày hay mỏng, tránh để
mẫu bị giòn.
Chú thích:
- Mỗi giai đoạn trên đều phải qua giấy thấm.
- Sau đó dán mẫu lên phiến kính bằng Baume Canada, để khô tự nhiên. - Sau đó xem mẫu lên kính hiển vi với độ phóng đại 10x10 hoặc 10x40 để
định danh phân loại.
e. Định danh phân loại
Khi mẫu trong, dễ quan sát hoặc các mẫu đã nhuộm, ta tiến hành định danh phân loại. Việc định danh phân loại dựa vào sự khác biệt về vị trí ký sinh, một sốđặc điểm về kích thước, hình thái và cấu tạo bên ngoài cũng như
bên trong các bộ phận của các loài giun sán được các tác giả mô tả.
f. Các chỉ tiêu khảo sát
- Định danh phân loại các loài giun sán ký sinh trên cóc nhà và ếch đồng tại vùng điều tra.
- Tỷ lệ nhiễm chung, tỷ lệ nhiễm ghép và cường độ nhiễm theo lớp và loài giun sán.
28
g. Phương pháp xử lý số liệu
Cách tính tỷ lệ nhiễm và cường độ nhiễm giun sán:
- Tỷ lệ nhiễm (%) = (sốếch nhiễm/ sốếch khảo sát) * 100 - Cường độ nhiễm = X ±SE
X : số giun sán nhiễm trung bình trên một ếch SE : là sai số của số trung bình (standard error)
- Phân tích các dữ liệu bằng phần mềm MS – Excel để tính số trung bình, độ
lệch chuẩn (SD: Standard deviation), sai số chuẩn (SE: Standard error). - So sánh các tỷ lệ nhiễm: Dùng trắc nghiệm χ2
(Chi square) bằng phần mềm Minitab 16.
29