Biểu hiện kháng nguyên HA của virus cúm AH5N1 trên cây thuốc lá và đánh giá khả năng sinh miễn dịch

MỤC LỤC

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Thiết kế các cấu trúc vector biểu hiện ở thực vật mang gen mã hoá kháng nguyên HA và đánh giá sự biểu hiện tạm thời kháng nguyên HA của virus cúm

Trong đó, dạng HA trimer được tạo thành nhờ sự dung hợp HA với motif GCN4pII, dạng HA oligomer ELP được tạo thành nhờ sự dung hợp HA với motif GCN4pII-ELP-IgMFc, còn dạng HA oligomer được tạo thành nhờ sự dung hợp HA với motif GCN4pII-IgMFc. Để có thể chọn lọc dòng khuẩn mang vector chứa gen mã hóa protein H5TG oligomer ELP và có chiều biểu hiện của protein đích ngược chiều với chiều biểu hiện của gen mã hóa kháng sinh chọn lọc nptII, phản ứng cắt bởi enzyme giới hạn NcoI đã được thực hiện. Để tạo vector tách dòng pRTRA mang HA oligomer TP, đầu tiên vector pRTRA_ H5-pII-IgMFc (do IPK cung cấp) và trình tự các đoạn gen HA được cắt mở vòng bởi hai enzyme giới hạn BamHI và BspOMI.

Bản đồ vector biểu hiện kháng nguyên HA oligomer ELP Bằng cách tương tự, các cấu trúc HA oligomer TP khác (gồm. oligomer TP) cũng đã được thiết kế và chuyển thành công vào chủng A. Agroinfiltration hút chân không là một trong những phương pháp đang được nhiều nhà khoa học quan tâm và sử dụng cho nghiên cứu khả năng biểu hiện tạm thời protein tái tổ hợp trong cây trồng. 5 g của dịch chiết protein tổng số từ lá thuốc lá biến nạp HApII được điện di biến tính SDS-PAGE 10% polyacrylamide và phát hiện bằng và western blot (WB) thông qua kháng thể anti-cmyc (A).

Tinh sạch, đánh giá trạng thái oligomer hoá và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các kháng nguyên HA tái tổ hợp

Hình 3.29 cho thấy quá trình làm giàu protein đích sau vòng mITC thứ nhất có PEG, trong khi protein đích phân bố tương đương nhau trong mỗi vòng của mITC khi không sử dụng PEG. Sau khi đã tìm được những điều kiện thích hợp nhất cho tinh sạch kháng nguyên HA ELP hoá bằng mITC, quy trình này được sử dụng để tinh sạch các kháng. Để phát hiện chính xác chức năng và cấu trúc của các protein HA nghiên cứu, dịch chiết xuất thô của mỗi protein HA đã được sử dụng cho phương pháp tinh chế bằng IMAC.

Bằng SDS-PAGE ở điều kiện không biến tính, đặc tính cấu trúc trimer và oligomer của kháng nguyên H5TG tinh sạch cũng được xác định và phát hiện thông qua phương pháp lai miễn dịch dựa trên kháng thể đơn dòng anti-c-myc (Hình 3.33A). Các kết quả tương tự cũng thu được khi mô tả trạng thái oligomer hoá của protein HACOBRA1 trimer nhân tạo và H5TG trimer tự nhiên tinh sạch thông qua sắc kí lọc gel (size exclusion chromatography, SEC) như biểu diễn trong Hình 3.35. Các protein HA trimer tinh sạch từ các phân đoạn B1 đến B6 đã được thu nhận và sau đó được sử dụng cho ELISA và Western blot nhằm phát hiện việc sản sinh kháng thể IgG chuột hoặc IgY gà đặc hiệu HA ở động.

Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên HA tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm

Trong nghiên cứu này, bốn loại thí nghiệm HI (bao gồm một thí nghiệm HI cho chính protein HA tương đồng (hay gọi là đồng kháng nguyên HA hay đồng gen) và ba thí nghiệm HI cho các dị chủng (heterologous strain)) đã được sử dụng để phát hiện kháng thể trung hòa trong huyết thanh chuột sau khi tiêm kháng nguyên lần thứ hai và thứ ba. Mười hai con gà mỗi nhóm được tiêm kháng nguyên theo 5 nhóm kháng nguyên khác nhau (gồm 3 nhóm nghiên cứu H5TG trimer, H5TG oligomer TP và H5TG oligomer ELP; 1 nhóm đối chứng dương NAVETCO là vaccine bất hoạt Navet- Vifluvac và 1 nhóm đối chứng âm là đệm PBS). Như vậy, kháng thể trung hoà đã được tạo ra khá mạnh trong huyết thanh gà của ba nhóm kháng nguyên nghiên cứu, trong đó H5TG oligomer TP có thể tạo ra kháng thể trung hoà mạnh hơn hai kháng nguyên còn lại (H5TG trimer và H5TG oligomer ELP).

Tóm lại, ba kháng nguyên HA (gồm H5TG trimer, H5TG oligomer TP và H5TG oligomer ELP) đã kích thích sản sinh kháng thể IgY đặc hiệu H5TG và kháng thể trung hoà virus cúm clade 1.1 khi được gây miễn dịch trên gà thí nghiệm. Trong đó, kháng nguyên H5TG oligomer TP có tính sinh miễn dịch cao nhất so với hai kháng nguyên còn lại, và mở ra triển vọng ứng dụng kháng nguyên H5TG oligomer TP này trong nghiên cứu sản xuất vaccine phòng bệnh cúm A/H5N1 nhóm clade 1 cho gia cầm. a) Tiêm bởi kháng nguyên H5HT tinh sạch. Điều này cho thấy các kháng nguyên H5HT trimer và H5HT oligomer TP có khả năng gây đáp ứng miễn dịch bảo vệ gà chống lại chủng virus đồng chủng tốt hơn so với H5HT oligomer ELP, nên có tiềm năng để sử dụng làm nguồn vaccine phòng chống virus cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1c trong tương lai. Kết quả tương tự cũng đã phát hiện được sự xuất hiện các kháng thể IgY đặc hiệu sản sinh chống lại kháng nguyên H5HT từ dịch chiết thô thực vật chứa H5HT trimer và H5HT oligomer TP bằng phương pháp Western blot (xem Phụ lục 4).

THẢO LUẬN

HA trimer dung hợp ELP làm tăng cường sự biểu hiện protein trong thực vật, đơn giản hoá trong tinh sạch nhưng không làm tăng cường hoạt tính sinh

Trong nghiên cứu này, HA một kháng nguyên chính của virus cúm A/H5N1 dung hợp với motif pII-ELP-IgMFc để tạo thành HA oligomer ELP đã được biểu hiện thành công trong thuốc lá. Khi phân tích trên SDS- page biến tính và Western blot cho thấy có sự biểu hiện mức độ cao và HA đã được oligomer hoá với những phân đoạn protein kích thước lớn hơn kích thước của protein HA không dung hợp ELP và IgMFc. Việc kết hợp giữa biểu hiện tạm thời HA trimer và tinh sạch qua màng mITC cho thấy một phương pháp linh hoạt để đáp ứng với biến đổi liên tục của kháng nguyên, một đặc tính của virus cúm.

Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch trên gà và chuột bằng phản ứng ELISA gián tiếp cho thấy rằng cả hai loại protein HA dung hợp ELP và không dung hợp ELP đều có hoạt tính kháng nguyên. Nhiều nghiên cứu trước đây cũng cho thấy việc dung hợp ELP vào protein đã kích thích tạo ra các kháng thể ở chuột và lợn kháng lại kháng nguyên Mycobacterium tuberculosis [87] hay HA trimer gắn ELP đã kích thích tạo ra kháng thể trên chuột kháng lại kháng nguyên HA [3]. Với kết quả này cho thấy rằng ELP hoá đã làm tính sinh miễn dịch của HA trimer dung hợp ELP-IgMFc (HA oligomer ELP) giảm đi mạnh hơn so với HA trimer dung hợp IgMFc (HA oligomer TP).

HA COBRA đã kích thích tạo ra kháng thể trung hoà phổ rộng trên động vật thí nghiệm

HA COBRA đã kích thích tạo ra kháng thể trung hoà phổ rộng trên động. Điều này đã mở ra một triển vọng trong việc ứng dụng kháng nguyên HACOBRA1 nhân tạo làm vaccine cúm tiềm năng phổ rộng chống lại nhiều chủng A/H5N1 khác nhau trên gia cầm ở Việt Nam.

HA oligomer có hoạt tính sinh miễn dịch cao trên động vật

Sự biểu hiện kháng nguyên HA tái tổ hợp trong hệ thống biểu hiện của sinh vật nhân chuẩn tạo ra các kháng nguyên vượt trội so với các hệ thống biểu hiện khác về các biến đổi sau dịch mã như hình thành liên kết disulfide, glycosyl hóa, gấp khúc protein và trimer hóa. Trong luận án này, mặc dù cấu hình N-glycan của cả HA trimer và oligomer TP không được phân tích nhưng các kháng nguyên HA oligomer TP có khả năng cảm ứng sinh kháng thể trung hòa mạnh hơn so với các kháng nguyên HA trimer. Mặc dù tất cả động vật trong nghiên cứu của chúng tôi đều khỏe mạnh và sống sót sau khi tiêm vaccine chiết xuất từ thực vật, hàm lượng nicotine có trong chiờ́t xuṍt thực vật võ̃n cõ̀n được theo dừi trong các nghiên cứu trong tương lai phụ thuộc vào phương pháp chiết xuất để cải thiện hơn nữa chiến lược tiêm phòng này.

Những phát triển và thử nghiệm trong nghiên cứu này ở Việt Nam đã củng cố giá trị của những dữ liệu này trong cuộc chiến chống lại bệnh cúm gia cầm như một mục tiêu quốc tế. Các vector biểu hiện mang gen mã hoá kháng nguyên HA dạng trimer, oligomer TP và oligomer ELP đã được thiết kế và các kháng nguyên HA tái tổ hợp được biểu hiện thành công trên cây thuốc lá. Đây là công trình nghiên cứu nhằm lựa chọn những kháng nguyên HA tiềm năng chưa từng được nghiên cứu trước đây cho mục đích sản xuất vaccine phòng bệnh cúm A/H5N1 trên gia cầm có tính bảo hộ cao, phổ rộng và đóng góp vào nguồn gen vacine phòng bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam.