Xác định môi trường tối ưu cho sản xuất sinh khối và enzyme vi khuẩn Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus phục vụ thử nghiệm chế phẩm sinh học
MỤC LỤC
Đối với Lactobacillus acidophilus 1. Nhu cầu sinh trưởng
Lactobacillus acidophilus là loài vi hiếu khí nên có thể phát triển trong điều kiện hiếu khí và trong điều kiện nuôi cấy tĩnh không lắc, ở điều kiện kị khí thì sự phát triển thích hợp hơn. Môi trường nuôi cấy chuẩn thường rất giàu acid amin và vitamin như pepton, trypton, dịch chiết nấm men, dịch chiết thịt bò, ngoài ra còn chứa sorbitol, monooleat (Tween 80), sodium acetat và muối magie kích thích sự tăng trưởng. Trong đậu nành có chứa rất nhiều chất dinh dưỡng nhưng người ta quan tâm nhiều nhất là hàm lượng protein và lipid, nhóm glucid của đậu nành không thuộc loại có giá trị cao về dinh dưỡng.
Trong đậu nành còn chứa các vitamin A, E, K, B1, B2 chiếm khoảng dưới 1% và các khoáng chất chiếm khoảng 5% nhưng chất lượng dinh dưỡng của các khoáng chất từ đậu nành thấp hơn so với các khoáng chất của động vật.
GIỚI THIỆU CHUNG VỀ PROBIOTIC (Trích dẫn của Lã Văn Kính, 1998)
Chateau et al (1993) phân lập được 103 chủng Lactobacillus ssp từ hai sản phẩm DFM (cho ăn trực tiếp) thương mại và kiểm tra khả năng ức chế hai chủng Salmonella. Khoảng 47% Lactobacillus của sản phẩm A và 70% của sản phẩm B có thể ức chế tất cả 6 serotype E. faecium) có thể ức chế sự phát triển của của 6 serotype Salmonella. Mặc dù một vài tác giả đưa ra một số cơ chế giải thích tại sao vi sinh vật có lợi trong đường ruột có thể ức chế sự thâm nhập của vi sinh vật có hại (Rolfe, 1991) nhưng cơ chế chính xác của sự loại trừ cạnh tranh của vi sinh vật gây bệnh bằng probiotic vẫn chưa được khẳng định. Những enzyme này có hoạt tính phân giải tinh bột, lipid và protein (Moon và Kim, 1989;. • Ngăn chặn sản sinh amoniac. Ngăn chặn sự sản sinh amoniac và hoạt động của urease có thể là có lợi để cải thiện sức khỏe gia súc và làm tăng cường sinh trưởng của gia súc bởi vì amoniac được sản sinh do sự phân giải urê trong màng nhày ruột non có thể gây nên một sự thiệt hại đáng kể đến bề mặt của tế bào. subtilis) làm giảm nồng độ amoniac trong phân và chất độn chuồng của gà Broiler.
• Tạ Thị Vịnh và cộng tác viên (2002) đã nghiên cứu sử dụng chế phẩm Vitom3 (Bacillus subtilis chủng VKPMV – 7092) để phòng trị bệnh phân trắng cho heo con ghi nhận rằng Vitom3 có tác dụng kích thích tăng trọng, phòng bệnh heo con phân trắng, tỷ lệ mắc bệnh giảm 11%, tỷ lệ khỏi bệnh 100% và không có heo bị tái phát.
KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME
Enzyme amylase
Ngoài ra nhóm nghiên cứu còn kết luận chế phẩm Bioplus 2B có ảnh hưởng đến tình trạng sức khỏe và tính năng sinh sản của heo nái và làm tăng phẩm chất quầy thịt ở heo đang lớn. Hệ enzyme amylase là một trong số các hệ enzyme được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực khác trong đời sống. Hiện nay người ta đã biết enzyme amylase được vi khuẩn và nấm sợi tổng hợp nhiều nhất, còn ở các loài vi sinh vật khác khả năng này yếu hơn.
Các loại enzyme amylase thường gặp khi nuôi cấy vi sinh vật gồm: α-amylase (α- 1,4 glucan-4-glucanhydrolase), ò-amylase (α-1,4glucan-4-maltohydrolase), γ-amylase (glucoamylase). Dưới tác dụng của α-amylase tinh bột sẽ mất khả năng tạo màu với iod và độ nhớt bị giảm rất nhanh, α-amylase thường bền nhiệt hơn các loại amylase khác. Khi α-amylase tác dụng vào tinh bột, sản phẩm tạo thành của phản ứng này bao gồm: dextrin (trong đó chủ yếu là dextrin phân tử lượng thấp), maltose, glucose.
Hoạt độ của chúng có liên quan mật thiết với sự có mặt của ion calci trong phân tử vì ion này được dùng để duy trì hình thể hoạt động của enzyme, từ đó nó có vai trò quan trọng trong việc ổn định hoạt tính của enzyme và tăng cường độ bền của α-amylase trước các tác nhân gây biến tính và tác dụng phân hủy protease. Theo số liệu của Liphsis, pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm amylase từ Bacillus subtilis là giống nhau và nằm trong vùng pH 5,6 – 6,2. Amylase là một trong những enzyme quan trọng nhất trong ngành công nghệ sinh học hiện nay do có những ứng dụng hết sức rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, lên men, công nghiệp dệt, sản xuất giấy và trong nông nghiệp.
Vài chục năm trở lại đây chế phẩm amylase từ nấm mốc (Aspergillus oryzae, Asp. awamori,…) hoặc từ vi khuẩn (Bacillus subtilis, Bacillus diastaticus) được thay thế malt (đại mạch nảy mầm) làm tác nhân đường hóa tinh bột trong sản xuất rượu, bia từ nguyên liệu có tinh bột. Để làm vải mềm, có khả năng nhúng ướt, tẩy trắng và bắt màu tốt thì phải tách tinh bột và người ta thường sử dụng enzyme amylase từ vi khuẩn (Bacillus subtilis, Bacillus mesentricus) hay từ nấm mốc.
Enzyme protease
Có rất nhiều nghiên cứu trong y học và lâm sàng học liên quan đến ứng dụng của amylase. Một dung dịch bền vững chứa α-amylase cho phép phát hiện các oligosaccharide phân tử lượng lớn với độ nhạy rất cao. Trong bốn nhóm kể trên, các protease-xerin và protease-tiol có khả năng phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của amino acid.
Ngược lại các protease kim loại, protease acid thường không có hoạt tính esterase và amidase đối với các dẫn xuất của aminoacid. Trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật ngoài gốc amino acid đặc trưng cho từng nhóm còn có một số gốc aminoacid khác. Ví dụ histidin thường tham gia trong trung tâm hoạt động của các proteae-xerin, protease tiol còn tyrosin là trung tâm hoạt động của các protease kim loại.
P1 – là sản phẩm đầu tiên của phản ứng (với nhóm amine tự do mới được tạo thành) P2 – là sản phẩm thứ hai của phản ứng (với nhóm carboxyl tự do mới được tạo thành).
Phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme
• Tiến hành xác định thời gian cần thiết để thu nhận được một lượng biến đổi nhất định của lượng cơ chất hay lượng sản phẩm tương ứng với một lượng enzyme nhất định. • Tiến hành chọn nồng độ enzyme cần thiết để trong một thời gian nhất định sẽ thu được sự biến đổi nhất định về cơ chất hay sản phẩm. Khả năng xúc tác của enzyme được xác định thông qua hoạt độ hoạt động của enzyme.
Hoạt độ hoạt động của enzyme được xác định thông qua đơn vị hoạt độ. • Ngoài ra còn có nhiều cách biểu thị đơn vị hoạt độ của enzyme như: đơn vị Wohgemuth cải tiến (MWU), đơn vị SKB, GAU, NU, HU, AU. Các đơn vị hoạt độ này được trình bày chi tiết ở mục 3.7 phần phụ lục.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
- VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 1. Giống vi khuẩn
- PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 1. Đối với Bacillus subtilis
• Môi trường nhân giống cấp1: môi trường Frage, môi trường pepton – gelatin, môi trường chứa mật rỉ đường + 2 % tinh bột, môi trường Edward và môi trường Nomura. Giống gốc chứa Baclillus subtilis được tăng sinh trong môi trường NB có pH = 7 trong thời gian 24 giờ ở nhiệt độ 37oC. Sau khi kiểm tra số lượng và hoạt độ enzyme trên từng loại môi trường chúng tôi chọn được môi trường nhân giống cấp 1 tối ưu nhất để tiếp tục nhân giống trên môi trường nhân giống cấp 2.
Sau khi chọn lọc được môi trường nhân giống cấp 1 tốt nhất chúng tôi tiến hành xác định môi trường nhân giống cấp 2 tối ưu nhất. Sau thời gian 72 giờ nuôi bắt đầu thu hoạch sau đó đem sản phẩm này kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn và hoạt độ enzyme amylase, protease. Sau khi kiểm tra trên tất cả các môi trường A, B, C, D và E chúng tôi tìm được môi trường nhân giống cấp 2 cho sinh khối và hoạt độ enzyme cao nhất để tiến hành sản xuất.
Sau khi tìm được môi trường nhân giống cấp 2 tối ưu nhất chúng tôi tiến hành sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis. Chế phẩm chứa Bacillus subtilis sau khi sấy khô tiến hành kiểm tra số lượng và hoạt độ enzyme amylase, protease và sau thời gian bảo quản 10, 20, 30 ngày ở nhiệt độ phòng. Những khuẩn lạc nghi ngờ này được tăng sinh trong môi trường MRSB trong 24 giờ ở nhiệt độ 37oC để tiến hành thử các phản ứng sinh hóa.
Sau thời gian nuôi 24 giờ với pH = 6,5 - 7 ở nhiệt độ phòng chúng tôi tiến hành kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn và độ chua Therne của từng loại môi trường. Từ kết quả khảo sát độ chua và số lượng tế bào vi khuẩn ở hai loại môi trường sữa đặc có đường và sữa đậu nành chúng tôi chọn được môi trường tối ưu nhất để tiến hành sản xuất thử chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus. Sản phẩm sau khi sấy khô chúng tôi tiến hành kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn có trong 1 gam sản phẩm và sau thời gian bảo quản 10 và 20 ngày bằng phương pháp đếm số lượng tế bào sống trên thạch (được trình bày chi tiết ở mục 3.5 phần phụ lục).
Môi trường sữa đặc có đường dùng trắc nghiệm một yếu tố để xem ảnh hưởng của nồng độ sữa lên số lượng và độ chua của L.
