Đa dạng hệ vi khuẩn đường tiêu hóa và mối liên quan với ung thư đại trực tràng

ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊNCỨU 1. Địađiểm

Thu thập dữ liệu lâm sàng và các mẫu mô đại trực tràng từ các BN được chẩn đoán xác định polyp và UTĐTT các giai đoạn vào điều trị trong khoảng thời gian từ tháng 03 năm 2015 đến tháng 12 năm 2020.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU 1. Thiếtkế nghiêncứu

Trong phân tích metagenomics, chỉ số beta thể hiện sự khác biệt quần thể sinh vật giữa các môi trường khác nhau, tập trung chủ yếu vào sự khác biệt về thànhphầnvàphânbốvisinhvậtgiữacácmẫukhácnhau.Chúngtôithựchiện phân tích. Giá trị % thể hiện ở mỗi trục (PcoA1 và PcoA2) thểhiệntỷlệ%sựbiếnđộngcóthểgiảithíchbỡitrụcđó.Cácmẫucóđặcđiểm tương tự nhau, sẽ có khoảng cách gần nhau hơn so với các mẫu có đặc điểm khác tạo thành cáccụmcluster trên đồthị. LefSe thực hiện hai kiểm định: kiểm tra các đặc trưng có ý nghĩa thống kê giữa các nhóm hay không và kiểm tra sự phù hợp với giả thuyết sinh học hay không (nếu có nhiều hơn 2 nhómthôngtinmetadata).LefSeđưarakháiniệm“effectsize”giúpnhànghiên cứu tập trung vào các đặc trưng có sự khác biệt đáng kể.

Các trình tự 16S rRNA sau khi giải trình tự hoàn tất, sẽ được tinh sạch về chất lượng giải trình tự, kích thước đoạn giải trình tự (read)(phụ lục 2).Các đoạn trình tự 16S rRNA sẽ được định danh dựa trên cơ sở dữ liệu SILVA để phân loại vi khuẩn.

ĐẠO ĐỨC NGHIÊNCỨU

Đầu tiên phân tích hồi quy logistic đơn biến tuổi, giới, nhiễmF.nucleatumvàB.fragilis,vịtríuđểtínhORthôcủacácmốiliênquan.Mốiliên quan có ý nghĩa thống kê khi KTC 95% không chứa 1 và p<0,05. Sau đó phân tích hồi quy logistic đa biến để xác định các biến là yếu tố tương tác hay yếu tố nhiễu.

ĐẶC ĐIỂMCHUNG 1. Đặc điểm tuổi vàgiới

Đặc điểm mô bệnh học của bệnh nhân ung thư đại trực tràng Đặc điểm mô bệnh học Số lượng (n) Tỷ lệ (%). Ung thư biểu mô tuyến biệt hóa vừa chiếm tỷ lệ cao nhất (85,6%), tiếp theolàungthưbiểumôtuyếnchếnhầy(9,4%),tổnthươnguhắctốítgặpnhất(0,6%). Đặc điểm nồng độ CEA huyết tương tại thời điểm chẩn đoán Nồng độ CEA.

Trong số 213 bệnh nhân tham gia nghiên cứu, có 163 bệnh nhân có định lượngnồngđộ CEA,kếtquảchothấy trongcả2nhómpolypvàUTĐTTđasố bệnh nhân có nồng độ CEA < 5 ng/ml (chiếm tỷ lệ tương ứng là 90,7% và 62,5%).

TÍNH ĐA DẠNG HỆ VI KHUẨN TẠI MÔ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG, MÔ GAN VÀ HẠCH DICĂN

Các chi chiếm tỷ lệ cao nhất ở cả ba loại mẫu mô đại trực tràng, gan, hạch gồm:Enhydrobacter, Acinetobacter, Janibacter, Aeribacillus, paracoccus,Thermus và Pseudomonas, Sphingomonas, Corynebacterium, Cutibac,Staphylococcus. Ở nhóm mô đại trực tràng (FCD), có thể chia thành các nhóm nhỏcósựtươngđồngvềtỷlệvàthànhphầnvisinhvật.Ởnhómmôgandicăn (FCG) và hạch di căn (FCH) có sự biến động giữa các mẫu trong cùng một nhóm tương đối lớnhơn. Sựkhácbiệtvềchỉsốđadạngsinhhọcbetagiữacácnhómmẫuđạitrực tràng và gan di căn, đại trực tràng và hạch di căn dựa trên Bray–Curtis dissimilarity và Jaccard distance là có ý nghĩa thống kê (p<0,05).

Nhóm mô UTĐTT có tỷ lệ các ngành Ascomycota, Bacteroidota, Deinococcota,Myxococcota,Nitrospirota,proteobacteriacaohơnsovớinhóm mô gan và hạch di căn.

Đặc điểm vị trí ung thư đại trựctràng

Trong nghiên cứu của chúng tôi, ung thư đại tràng trái chiếmtỷlệcaonhất(36,9%),tiếptheolàungthưđạitràngphảivàungthưtrực tràng chiếm tỷ lệ lần lượt là 35,6% và 27,5%). Nghiên cứu của Wong và cộng sự(2017)trên104bệnhnhânUTĐTT,ungthưđạitràngtráichiếmtỷlệ69,7%, trong khi đó ung thư đại tràng phải và trực tràng chiếm tỷ lệ 30,3%[66]. Mima và cộng sự(2015)nghiêncứutrên598BNUTĐTTtạiMỹ,ungthưđạitràngphảichiếm tỷ lệ cao nhất (50%), ung thư đại tràng trái và trực tràng chiếm tỷ lệ thấp hơn (28%và22%)[74].MộtnghiêncứukhácdoMimavàcộngsự(2016)trên1102.

BN UTĐTT tại Mỹ, gặp 49% ung thư đại tràng phải, ung thư đại tràng trái chiếmtỷlệ29%,ungthưtrựctràng chiếmtỷlệthấpnhất (22%)[75].Nhưvậy, qua tổng hợp các nghiên cứu ở nhiều nước trên thế giới nhận thấy UTĐTT có thể gặp ở nhiều vị trí khác nhau.

Đặc điểm mô bệnh học của bệnh nhân ung thư đại trựctràng

Trên nhóm BN UTĐTT tại Mỹ, ung thư đại tràng phải hay gặp hơn ung thư đại tràng trái và trực tràng. Tuy nhiên, ung thư ở đại tràng hay gặp hơn so với trực tràng, ung thư đại tràng trái phổ biến hơn đại tràng phải trên nhóm BN UTĐTT ở các nước Châu Á. Có sự khác biệt này có thể là do liên quan đến chế độ ăn, lối sống và chủng tộc khác nhau giữa các nước.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng cho kết quả tương tự như các nghiên cứu tại các nước ChâuÁ.

Đặc điểm nồng độ CEA huyết tương tại thời điểm chẩnđoán

Như vậy, nồng độ CEA rất khác nhau giữa các nghiên cứu và giữa các giai đoạn UTĐTT, điều này có thể là do tăng nồng độ CEA không đặc hiệu trong UTĐTT, nồng độ CEA có thể tăng trong các bệnh ung thư ngoài đường tiêu hoá[118].

Thành phần hệ vi khuẩn (taxonomicprofilling)

Wei và cộng sự (2016), nghiên cứu trên 180 bệnh nhân UTĐTT các giai đoạn I-IV, sử dụng kỹ thuật 16S rRNA metagenomics khuếch đại vùng gen V4 để mô tả đặc điểm hệ vi khuẩn tại mô ungthưvàmôlànhcạnhungthư.TỷlệpháthiệnF.nucleatumtạimẫumôungthư ở nhóm tái phát cao hơn nhóm không tái phát và tỷ lệ này tương quan với tình trạng xâm lấn khối u (p<0,015). Acar và cộng sự (2023) tiến hành nghiên cứu hệ vi khuẩn tại mẫu mô từ 20 bệnh nhân UTĐTT và mẫu mô đại tràng ở 10 bệnh nhân viêm ruột, có so sánh với nhóm chứng là 18 người khoẻ mạnh bằngkỹthuật 16S rRNA metagenomics thu được kết quả như sau. Ở mức chi, thành phần hệ vikhuẩnkhácnhaugiữamôtươivàmôkhốinến.Ởmẫumôtươi,gặpchủyếu các chiFusobacterium(16%),Escherichia-Shigella(12,5%) vàStreptococcus(7,7%), trong khi đó tại mẫu mô khối nến gặp chủ yếu cácchiArthrobacter(18%),Bacteroides(9,5%)vàFaecalibacterium(9.4%).

Gemella,PeptostreptococcusvàParvimonas[37].Halevàcộngsự(2018),ứngdụng16S rRNA metagenomics nghiên cứu mô tả đặc điểm hệ vi khuẩn tại mẫu mô ung thư và mô lành cạnh ung thư từ 83 bệnh nhân UTĐTT, nghiên cứu kết luận rằngF.nucleatumvàB.fragilischiếmtỷlệcaonhấttạimẫumôungthưvàmô.

Chỉ số đa dạng sinh học alpha (Alphadiversity)

Các loài chiếm tỷ lệ cao nhất ở cả ba loại mẫu mô đại trực tràng, gan, hạch gồm:Kocuria palustris, Burkholderia multivorans, Moraxella osloensis,Acinetobacterbaumannii,Fusobacteriumnecrophorum,Pseudomonasstutzeri và Bacteroidesfragilis. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy số chỉ số shannon cao nhất ở nhóm mẫu mô đại trực tràng, tiếp theo là nhóm mô hạch và gan di căn cho thấy độ đa dạng vi sinh ở nhóm mô đại trực tràng là cao nhất và thấp nhất ở nhóm mô gan di căn. Chỉ số đa dạng sinh học Shannon và số lượng observed OTUs cao nhất ở nhóm mô ung thư, tiếp theo là nhóm mô lành cạnh ung thư và thấp nhất là nhóm u tuyến, cho thấy độ đa dạng vi sinh ở nhóm mô ung thư là cao nhất, thấp nhất là nhóm mô u tuyến, tuy nhiên sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) [71].

Acar và cộng sự (2023) tiến hành nghiên cứu hệ vi khuẩn tại mẫu mô từ 20 bệnh nhân UTĐTT và mẫu mô đại tràng ở 10 bệnh nhân viêm ruột, có so sánh với nhóm chứng là 18 người khoẻ mạnh bằng kỹ thuật 16S rRNA metagenomics.

Chỉ số đa dạng sinh học beta (Betadiversity)

Trong nghiên cứu của chúng tôi không có sự so sánh chỉ số đa dạng alpha tại mô UTĐTT so với mô lànhcạnhungthưcũngnhưtạimẫumôUTĐTTchưacódicănsovớimẫumô UTĐTT có dicăn. NghiêncứucủaBundgaardvàcộngsự(2019)trên10mẫumôUTĐTT,6 mẫu mô lành cạnh ung thư và 9 mẫu mô u tuyến bằng kỹ thuật 16S rRNA metagenomics. Khi thực hiện kỹ thuật 16S rRNA metagenomics trên các mẫu mô UTĐTT từ 2 nhóm, chỉ số đa dạng sinh học beta giữa 2 nhóm mẫu mô UTĐTT có di căn và không di căn là không có sự khác biệt[149].

Như vậy, chỉ số đa dạng sinh học beta là khác nhau giữa các mẫu mô UTĐTT và gan di căn, giữa mẫu mô UTĐTT và hạch dicăn.

Chỉ thị sinh học (Biomarkeranalysis)

ChiFusobacteriumxuất hiện phổ biến hơn ở mô ung thư so với mô u tuyến (p<0,01), nhưng không có sự khác biệt giữa mô ung thư và mô lành cạnh ung thư (p>0,05). Phân tích ANCOM-BC đánh giá sự thay đổi cấp log2 về tỷ lệ vi sinh vật giữacác2nhómmẫuvàthanhkhoảngtincậy95%.Dựatrêntỷlệtuyệtđốicủa vi sinh (đơn vị là đoạn đọc - read) để tìm vi sinh có sự khác biệt có ý nghĩa thôngkêgiữa2nhómmẫu.Trongnghiêncứucủachúngtôi,nhómmôUTĐTT có tỷ lệ các ngành Ascomycota, Bacteroidota, Deinococcota, Myxococcota, Nitrospirota, Proteobacteria cao hơn so với nhóm mô gan và hạch di căn. Nghiên cứu của Zhou và cộng sự (2023) trên mẫu mô ung thư và môlành cạnh ung thư từ 48 bệnh nhân UTĐTT có di căn và nhóm 44 bệnh UTĐTT chưa có di căn.

Có 30% bệnh nhân trong số 10 BN UTĐTT di căn gan phát hiệncóngànhFusobacteriatrongcảmẫumôUTĐTTvàmôgandicăn.Không có trường hợp nào có sự hiện diện của ngành Fusobacteria trong cả 3 loại mẫu môUTĐTT,môganvàhạchdi cănở11BNUTĐTTdicănganvàhạch.Acar và cộng sự (2023) nghiên cứu hệ vi khuẩn tại mẫu mô UTĐTT, mẫu mô viêm đạitràng,cósosánhvớinhómchứnglà18ngườikhoẻmạnhbằngkỹthuật16S rRNA metagenomics.

MỐI LIÊN QUAN GIỮAF. NUCLEATUMVỚI UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

Nồng độ của FadA trong tổ chức đại tràng ở những bệnh nhân u tuyến và ung thư biểu mô tuyến cao hơn 10-100 lần so với ngườikhỏemạnh.TăngbiểuhiệncủaFadAtrongungthưđạitrựct r à n g tương. Người ta nhận thấy rằng các chủng fusobacteria thiếu yếu tố Fap2 hoặc bị bất hoạt Fap2 bằng đột biến cho thấy giảm gắn với Gal-GalNAc và giảm hình thành UTĐTT trên mô hìnhchuột[15].Điềuthúvịlà,F.nucleatumcónhiềutrongcácmôungthưđạitrực tràng ở những bệnh nhân tái phát sau hóa trị. Trong nghiên cứu của chúng tôi, trung vị tải lượng tương đốiF.nucleatumở nhóm ung thư giai đoạn III cao hơn giai đoạn II và I, tại mô ung thư giai đoạn II và III cao hơn mô lành cạnh ung thư (p<0,05).

Nghiên cứu của Mima và cộng sự (2016) trên 1102 bệnh nhân UTĐTT, có mối liên quan giữa tỷ lệ nhiễmF.nucleatumvới vị trí u và các giai đoạn tiến triển của UTĐTT (p<0,05), không có mối liên quan giữa tỷ lệ nhiễmF.

MỐI LIÊN QUAN GIỮAB. FRAGILISVỚI UNG THƯ ĐẠI TRỰCTRÀNG

Chính điều này cho phép vi sinh vật và độc tố của chúng nhưfragilysintương tác với các tế bào miễn dịch và kích hoạtphảnứngviêm[19].Độctốfragilysinđãđượcchứngminhlàlàmthayđổi nhanh chóng cấu trúc và chức năng của các tế bào biểu mô đại tràng, bao gồm cảsựphâncắtproteinứcchếkhốiuvàE-cadherin.SựphâncắtE-cadherinbởi độc tốfragilysinlàm tăng nồng độβ-catenintrong tế bào chất, cho phép nó chuyển vị trí vào nhân làm tăng sinh tế bào biểu mô cũng như tăng biểu hiện củagengâyungthư[20].Trongnghiêncứucủachúngtôi,tỷlệnhiễmB.fragilistại mẫu mô đại trực tràng không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nhóm Polyp với nhau, các nhóm ung thư với nhau, giữa mô lànhvàmô ung thư,tuynhiêntỷlệnhiễmB.fragilistạimẫumôđạitrựctràngở nhómungthư (71,2%) cao hơn nhóm polyp (34%), sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê(p<0,05). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng cho kết quả tương tự, tuy nhiên không có sự khác biệt về tỷ lệ phát hiệnB.fragilistại mẫu mô ung thư và mô lành cạnh ung thư ở cùng một giai đoạn bệnh. Nghiên cứu đã phân tích hệ vi sinh vật tại niêm mạc đại trực tràng của những bệnh nhân được sàng lọc UTĐTT và ghi nhận tỷ lệ nhiễmB.

Kết quả phân tích đa biến sau khi hiệu chỉnh mô hình đơn biến (Bảng 3.23) với các yếu tố như tuổi, giới và vị trí u, cho thấy nhiễmB.