Nghiên cứu thiết lập quy trình sản xuất và kiểm nghiệm vắc-xin giải độc tố Escherichia coli phòng bệnh tiêu chảy và sưng phù đầu trên lợn
MỤC LỤC
Tình hình nghiên cứu trong nước
Ngày nay, với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, bệnh tiêu chảy và phự ủầu ở lợn con ủó ủược khống chế phần nào, nhưng việc loại trừ nú trong chăn nuụi thỡ hầu hết cỏc nhà nghiờn cứu ủều cho rằng cũn rất nhiều khú khăn khụng những ở nước ta mà ở cả cỏc nước cú trỡnh ủộ khoa học tiờn tiến trờn thế giới [3], [8], [17]. Nguyễn Viết Không và cộng sự [18], bằng phản ứng ELISA phát hiện kháng thể trong huyết thanh của lợn sử dụng khỏng nguyờn F18-pili xỏc ủịnh tỷ lệ mang khỏng thể ủặc hiệu khỏng E.
Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài
Vacxin ủó làm giảm ủược tỷ lệ lợn con mắc bệnh phõn trắng 9,5 - 11,2% so với lợn ủối chứng khụng dựng vacxin. Akita và cộng sự (1993) ủó nghiờn cứu sản xuất khỏng ủộc tố ủặc hiệu qua lũng ủỏ trứng gà dựng trong phũng và chữa bệnh tiờu chảy cho lợn con [44].
Vi khuẩn Escherichia coli
Hai quỏ trỡnh trước ủược thực hiện nhờ cỏc tỏc ủộng vật lý, húa học, bước bỏm dớnh ủược thực hiện bởi cỏc sợi bỏm dớnh chuyờn biệt (pili) trờn bề mặt vi khuẩn ủảm nhiệm, ủú là quỏ trỡnh liờn kết giữa khỏng nguyờn tại yếu tố bỏm dính với các receptor tương ứng trên bề mặt của các tế bào biểu mô. Liệu phỏp dựng thuốc khỏng sinh ủể kiểm soỏt sự nhõn lờn của vi khuẩn cú hiệu quả hơn ở bệnh tiờu chảy sau cai sữa so với bệnh phự ủầu, bởi vỡ ở bệnh phự ủầu ủộc tố ủược sản sinh ở ruột gần như cao nhất khi xuất hiện cỏc triệu chứng lõm sàng.
Tìm hiểu về vacxin .1 ðịnh nghĩa
Sử dụng vacxin là ủưa vào cơ thể khỏng nguyờn cú nguồn gốc từ vi sinh vật gõy bệnh hoặc vi sinh vật cú cấu trỳc khỏng nguyờn giống vi sinh vật gõy bệnh, ủó ủược bào chế ủảm bảo ủộ an toàn cần thiết, làm cho cơ thể tự tạo ra tỡnh trạng miễn dịch chống lại tác nhân gây bệnh. Dự ủó ủược cơ quan kiểm ủịnh nhà nước kiểm tra và ủó ủược ủỏnh giỏ trờn ủộng vật, trước khi ủưa ra tiờm chủng rộng rói, vacxin ủều phải ủược thử nghiệm trờn thực ủịa (field test): Vacxin ủược tiờm chủng cho một cộng ủồng, theo dừi thống kờ tất cả cỏc phản ứng phụ và ủỏnh giỏ khả năng bảo vệ khi mựa dịch tới. Vacxin gõy miễn dịch bằng một vi khuẩn hoặc virus giảm ủộc lực, hoặc với một protein ủặc hiệu cú tớnh khỏng nguyờn ủể gõy ra một ủỏp ứng miễn dịch, rồi tạo một trớ nhớ miễn dịch ủặc hiệu, tạo ra hiệu quả ủề khỏng cho cơ thể về sau khi tỏc nhõn gõy bệnh xõm nhập với ủầy ủủ ủộc tớnh [14], [15].
Với cụng nghệ gen hiện ủại, cỏc antigen này ủược tổng hợp bằng cỏch cắt ủoạn gen tổng hợp nờn protein ủặc trưng cho vi sinh vật gõy bệnh, ghộp gen này vào bộ gen của vi khuẩn, của nấm men khỏc hay tế bào nuụi cấy ủể tạo ra protein ủặc hiệu cho mầm bệnh, dựng protein này ủề tiờm chủng tạo miễn dịch ủặc hiệu.
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương pháp nghiên cứu
Sau khi xỏc ủịnh ủược liều sử dụng của vacxin cho lợn, ủó tiến hành xỏc ủịnh chỉ tiờu an toàn của vacxin ủối với bản ủộng vật là lợn con sau cai sữa và lợn nỏi chửa (theo 10TCN 703-2006 “Quy trình kiểm nghiệm vacxin E. Một nửa hỗn hợp canh trựng ủem ly tõm (tối thiểu 4500 vũng/phỳt trong 10 phỳt) loại hết cặn (thõn vi khuẩn), lọc qua màng lọc cú ủường kớnh lỗ lọc 0,2 àm, thu phần nước trong (dịch lọc canh trựng chứa ngoại ủộc tố) rồi tiờm với cỏc liều khỏc nhau 0,4 ml/con, 0,6 ml/con, 0,8 ml/con và 1 ml/con chuột, theo cỏc ủường tiêm khác nhau (dưới da, phúc xoang và tĩnh mạch) cho chuột bạch có trọng lượng. 21 ngày sau khi tiêm lần 2 cho chuột lô miễn dịch (lô 1), toàn bộ chuột lô 1 và lụ 2 thử thỏch cường ủộc bằng cỏch tiờm dưới da lưng cho mỗi chuột 1 MLD (tương ứng với liều nước lọc canh trựng ủó xỏc ủịnh gõy chết 100% chuột thớ nghiệm) hoặc 1 MLD (cú chứa vi khuẩn cường ủộc E. coli của hỗn hợp canh trựng cỏc chủng E. coli cường ủộc).
Hiệu lực của vacxin ủược ủỏnh giỏ thụng qua tỷ lệ bảo hộ (số lợn mắc bệnh tiờu chảy và sưng phự ủầu do E. coli gõy nờn trong thời gian theo dừi 21 ngày) ủối với lợn lụ ủối chứng, lợn lụ thớ nghiệm và thụng qua kết quả kiểm tra hiệu giỏ khỏng ủộc tố của mẫu huyết thanh lợn trước và sau khi miễn dịch.
Kiểm tra vụ trựng vacxin giải ủộc tố E. coli
Theo quy ủịnh của Cục Thỳ y, vacxin nhập nội hay mới sản xuất trong nước bắt buộc phải kiểm tra 3 chỉ tiờu: Vụ trựng, an toàn và hiệu lực. Qua kết quả bảng trờn, kết luận tất cả cỏc lụ vacxin giải ủộc tố E.
Xỏc ủịnh liều sử dụng vacxin giải ủộc tố E. coli
Dựa trờn kết quả kiểm tra hiệu giỏ khỏng ủộc tố ủó thu ủược, chỳng tụi chọn liều 2 ml/con làm liều chỉ ủịnh cho vacxin giải ủộc tố E. Cũng như ủối với lợn con sau cai sữa, trong thớ nghiệm này ủó tiến hành tiờm cho lợn nỏi chửa với cỏc liều vacxin giải ủộc tố E. Qua thời gian theo dừi 7 ngày sau khi tiờm vacxin với cỏc liều khỏc nhau thấy toàn bộ lợn nhúm thớ nghiệm ủều khỏe mạnh và khụng cú bất cứ một biểu hiện khác thường nào xảy ra.
Lợn ở cỏc lụ thớ nghiệm ủược tiêm vacxin có HGKðTTB trong huyết thanh cao hơn hẳn so với HGKðTTB trước khi tiờm và lụ ủối chứng.
Xỏc ủịnh chỉ tiờu an toàn của vacxin giải ủộc tố E. coli
Vacxin hoàn toàn khụng ảnh hưởng ủến tốc ủộ tăng trưởng của lợn, cụ thể sau khi tiêm vacxin 1 tháng kiểm tra trọng lượng từng lợn kết quả cho thấy: Tăng trọng trung bỡnh của lợn thớ nghiệm và lợn ủối chứng khụng cú sự khỏc biệt, tăng trọng trung bỡnh của lợn ở 8 lụ thớ nghiệm từ 16,5 - 17 kg/thỏng và lợn ủối chứng 16,8 kg/tháng. Liều tiêm 0,6 ml/con, 100% chuột thớ nghiệm ủược tiờm bằng ủường tiờm phỳc xoang và tĩnh mạch cú phản ứng, thời gian xuất hiện chuột có phản ứng sau tiêm từ 5 - 10 phút, 60% chuột thí nghiệm có phản ứng khi tiêm dưới da, thời gian xuất hiện chuột phản ứng sau tiêm 15 phút. Liều tiêm 0,4 ml/con, thời gian xuất hiện chuột có phản ứng sau tiêm ủối với ủường tiờm phỳc xoang, tĩnh mạch là 15 phỳt, 20% chuột thớ nghiệm cú phản ứng, ủường tiờm dưới da khụng cú chuột nào bị phản ứng.
Số chuột sống (con). Kiểm tra MLD 10 Không tiêm. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp .. coli ủược kiểm tra ủều cú ủỏp ứng miễn dịch và cú tỷ lệ chuột ủược bảo hộ ở cỏc mức ủộ khỏc nhau khi tiến hành cụng cường ủộc. Cỏc lụ vacxin cú hiệu giỏ giải ủộc tố cao thỡ cho khả năng bảo hộ chuột cao và ngược lại. Sau khi tiêm hỗn hợp canh trùng E. a) Xỏc ủịnh liều gõy bệnh cho 100% lợn thớ nghiệm của dịch lọc canh trựng nuụi cấy cỏc chủng E.
Nghiờn cứu ủiều kiện bảo quản và thời gian bảo quản vacxin giải ủộc tố E. coli
Bảo quản ở ủiều kiện nhiệt ủộ từ 2 - 8°C, hiệu giỏ giải ủộc tố của vacxin giảm dần từ 1/8 ủến 1/4 sau 7 thỏng bảo quản và mức hiệu giỏ giải ủộc tố này trong vacxin vẫn tồn tại trong suốt thời gian theo dừi 12 thỏng. Vacxin bảo quản ở ủiều kiện nhiệt ủộ phũng giảm hiệu lực ngay sau thỏng ủầu tiờn, tỷ lệ bảo hộ cũn 80%, giảm dần sau thỏng thứ 3 tỷ lệ bảo hộ cũn 40% và mất hoàn toàn hiệu lực sau 9 tháng. Vacxin bảo quản ở nhiệt ủộ từ 2 - 8°C vẫn giữ nguyờn hiệu lực tốt sau thỏng thứ 6 và giảm ở các tháng tiếp theo nhưng vẫn bảo hộ 80% chuột thí nghiệm kéo dài suốt 12 tháng bảo quản.
+ Vacxin bảo quản ở nhiệt ủộ phũng: Toàn bộ 6 lụ vacxin sau khi kiểm tra hiệu lực ủối với chuột bạch chỉ cú lần kiểm tra ủầu tiờn (sau bảo quản 1 thỏng) tương ứng với hiệu giỏ giải ủộc tố của vacxin bằng 1/8, tỷ lệ bảo hộ 100%.
Thử nghiệm thực ủịa và kiểm tra hiệu lực của vacxin ngoài thực ủịa .1 Kết quả kiểm tra an toàn của vacxin ngoài thực ủịa
Kiểm tra hiệu lực của vacxin ủối với cả hai ủối tượng: Lợn con sau cai sữa và lợn nỏi mang thai, thụng qua hiệu giỏ khỏng ủộc tố trong mẫu huyết thanh của lợn trước và sau khi ủó ủược miễn dịch 21 ngày. Hiệu giỏ khỏng ủộc tố trong huyết thanh của từng lợn ủược xỏc ủịnh bằng phản ứng kết tủa nhanh trờn phiến kớnh với khỏng nguyờn vi khuẩn E. Với tổng số 150/610 mẫu huyết thanh của lợn thớ nghiệm ủược lấy ngẫu nhiờn ở cả 3 ủịa phương thử nghiệm, mỗi ủịa phương 50 mẫu sau khi tiờm vacxin 21 ngày cho HGKðTTB rất cao.
Song song với việc kiểm tra hiệu lực của vacxin trong phũng thớ nghiệm, ủó tiến hành khảo sỏt ủộ dài miễn dịch của vacxin ủối với lợn con sau cai sữa và lợn nỏi mang thai nuôi tại trại lợn giống Lạc Vệ - Tiên Du - Bắc Ninh.
