Quy trình định lượng e.coli bằng phương pháp đếm đĩa

Hiện nay, thế giới đang đối mặt với rất nhiều loại bệnh nguy hiểm, có khả năng lây lan cao do các chủng virus, vi khuẩn khác nhau gây ra. Tùy theo nhiều mức độ mà hậu quả của chúng để lại cũng khác nhau. Tuy nhiên, nếu không có những kiến thức cần thiết thì việc phòng tránh, ngăn ngừa cũng như để kịp thời nhận biết và xử lí sẽ gặp không ít khó khăn. Và trong số những vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm ấy, E.coli cũng là 1 chủng vi khuẩn mang lại cho con người không ít rắc rối. Vì những lí do kể trên mà suốt những năm qua con người luôn cố gắng sử dụng nhiều biện pháp khác nhau để định lượng được E.coli, trong đó có 1 phương pháp được sử dụng khá phổ biến là phương pháp đếm đĩa. Trước khi, tìm hiểu sâu về phương pháp trên, nhóm làm tiểu luận sẽ giới thiệu đôi nét về vi khuẩn E.coli cũng như vài phương pháp định lượng E.coli khác nhau

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM BÁO CÁO TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM(Sáng Thứ 4_Tiết 3-4) Đề tài: QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM ĐĨA Nhóm: 01 Sinh viên thực hiện: Đỗ Thị Kim Anh (2005170003) Trần Nguyễn Bảo Châu (2005170017) Văn Thị Dung (2005170026) TP HỜ CHÍ MINH, NĂM 2019 PHÂN CƠNG NHIỆM VỤ TÊN MSSV NHIỆM VỤ Đỗ Thị Kim Anh 2005170003 Tính toán kết quả, soạn Word Power point Trần Nguyễn Bảo Châu 2005170017 Tổng quan quy trình, soạn Power point Văn Thị Dung 2005170026 Các phương pháp phân tích, quy trình MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH ẢNH MỞ ĐẦU Hiện nay, giới đối mặt với nhiều loại bệnh nguy hiểm, có khả lây lan cao chủng virus, vi khuẩn khác gây Tùy theo nhiều mức độ mà hậu chúng để lại khác Tuy nhiên, khơng có kiến thức cần thiết việc phòng tránh, ngăn ngừa để kịp thời nhận biết xử lí gặp khơng khó khăn Và số vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm ấy, E.coli chủng vi khuẩn mang lại cho người khơng rắc rối Vì lí kể mà suốt năm qua người cố gắng sử dụng nhiều biện pháp khác để định lượng E.coli, có phương pháp sử dụng phổ biến phương pháp đếm đĩa Trước khi, tìm hiểu sâu phương pháp trên, nhóm làm tiểu luận giới thiệu đơi nét vi khuẩn E.coli vài phương pháp định lượng E.coli khác I TỔNG QUAN VỀ E.COLI Escherichia coli Theodore Escherich (1857-1911), nhà vi khuẩn học người Áo, phát lần năm 1885 Chi Escherichia thuộc họ vi khuẩn đường ruột loài thuộc chi này, E.coli chọn làm điển hình có vai trị quan trọng y học E.coli thành viên hệ vi khuẩn bình thường ruột nguyên nhiều bệnh nhiễm trùng, có bệnh nguyên đứng đầu E.coli sử dụng làm mơ hình nghiên cứu sinh học phân tử lĩnh vực vi sinh học nói riêng sinh học nói chung Hình 1: Vi khuẩn E.coli Cấu tạo vi khuẩn E.coli E.coli trực khuẩn gram âm, có hai đầu trịn, kích thước từ 0,5 – micromet Di động tiêm mao, khơng bào tử, loại có độc lực có capsul Đặc điểm sinh học 2.1 Hình thái Kích thước trung bình từ 2-3m x 0,5m; điều kiện khơng thích hợp (ví dụ mơi trường có kháng sinh) vi khuẩn dài sợi Rất chủng E.coli có vỏ, hầu hết có lơng có khả di động Hình 2: Cấu tạo vi khuẩn E.coli 2.2 Tính chất ni cấy E.coli phát triển dễ dàng môi trường nuôi cấy thông thường Một số sống mơi trường tổng hợp nghèo chất dinh dưỡng Hiếu kỵ khí tuỳ ý Có thể phát triển nhiệt độ từ 5-400C Nhiệt độ thích hợp xung quanh 370C Trong điều kiện thích hợp E.coli phát triển nhanh, thời gian hệ khoảng 2030 phút Cấy vào môi trường lỏng (như canh thang) sau – làm đục nhẹ môi trường, sau 24 làm đục đều; sau hai ngày mặt mơi trường có váng mỏng Những ngày sau, đáy ống thấy lắng cặn E.coli không mọc canh thang Selenit Trên môi trường thạch thường, sau khoảng - 10 giờ, dùng kính lúp quan sát khuẩn lạc Sau 24 khuẩn lạc có kích thước khoảng 1,5mm Hình thái khuẩn lạc điển hình dạng S, gặp dạng R M Trên môi trường phân lập, tuỳ theo chất thị màu, E.coli có khuẩn lạc màu vàng (như thạch lactose) màu đỏ (như thạch MacConkey) Không mọc môi trường SS Một số loại E.coli có tính chất ni cấy riêng có giá trị sàng lọc nhanh EAEC tạo thành váng đặc trường nuôi cấy canh thang Muller-Hinton 2.3 Tính chất hố sinh E.coli có khả lên men nhiều loại đường có sinh Hầu hết E.coli lên men lactose sinh trừ E.coli trơ (inactive) (trong có EIEC) khơng lên men chậm Một số chi khác họ vi khuẩn đường ruột có khả lên men lactose (như Klebsiella, Enterobacter, Serratia Citrobacter) gộp vào nhóm vi khuẩn có tên chung Colifom E.coli có khả sinh indole Không sinh H 2S Không sử dụng nguồn cacbon citrate môi trường Simmons Có decarboxylase, có khả khử carboxyl lysine, ornithin, arginin acid glutamic Betagalactosidase dương tính Thử nghiệm VP (Voges Proskauer) sau 24 âm tính, sau 48 dương tính 2.4 Kháng ngun Kháng nguyên O: người ta biết tới 160 yếu tố kháng nguyên O E.coli Kháng nguyên K: khoảng 100 yếu tố kháng nguyên K xác định chia thành ba loại: A, B L; A dạng vỏ quan sát kính hiển vi quang học thông thường, B L dạng màng mỏng quan sát nhờ kính hiển vi điện tử Kháng nguyên H: 50 yếu tố kháng nguyên H xác định Phân loại Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, E.coli chia thành loại huyết Với tổ hợp yếu tố kháng nguyên O, K H có nhiều loại huyết khác Mỗi loại huyết ký hiệu kháng nguyên O K ví dụ O86B7 (yếu tố kháng nguyên O số 86, yếu tố kháng nguyên K số loại B) Dựa vào vị trí gây bệnh E.coli có khả gây bệnh người chia thành hai nhóm: thứ nhóm gây bệnh đường ruột (IPEC – intestinal pathogenic E.coli) hay E.coli gây bệnh tiêu chảy (DEC - dierrheagenic E.coli), thứ hai nhóm gây bệnh đường ruột (ExPEC – extraintestinal pathogenic E.coli) Các loại E.coli gây bệnh đường ruột (IPEC) biết gồm:  EPEC (Enteropathogenic E.coli): E.coli gây bệnh đường ruột  ETEC (Enterotoxigenic E.coli): E.coli sinh độc tố ruột  EIEC (Enteroinvasive E.coli): E.coli xâm nhập ruột  EAEC (Enteroaggregative E.coli): E.coli ngưng tập ruột  DAEC (Diffusely adherent E.coli): E.coli bám dính phân tán  EHEC (Enterohaemorrhagic E.coli): E.coli gây xuất huyết ruột Hình 3: EPEC (Enteropathogenic E.coli): E.coli gây bệnh đường ruột Hai loại E.coli gây bệnh đường ruột quan trọng là:  MAEC (Meningitidis-associated E.coli): E.coli gây viêm màng não  UPEC (Uropathogenic E.coli): E.coli gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu II CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Phương pháp truyền thống 1.1 Phương pháp đếm đĩa (đếm khuẩn lạc) Tế bào sống xác định tế bào có khả phân chia, sinh sản Cách thường để tính tế bào sống xác định số tế bào sống mẫu có khả tạo thành khuẩn lạc mơi trường thạch thích hợp Vì lẽ nên phương pháp xác định số tế bào sống gọi phương pháp đếm đĩa hay phương pháp đếm khuẩn lạc Trong phương pháp cần thực pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng bậc 10 liên tiếp cho có độ pha lỗng với mật độ tế bào thích hợp để xuất khuẩn lạc riêng lẻ bề mặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số đếm tính tốn Mật độ tế bào lớn làm khuẩn lạc chồng chéo lên tạo thành màng sinh khối Ngược lại số khuẩn lạc một9 đĩa nhỏ khơng có giá trị thống kê Số lượng khuẩn lạc tối ưu đề nghị quan uy tín FDA, AOAC 25-250 khuẩn lạc/ đĩa 10 Số lượng khuẩn lạc xuất đĩa phụ thuộc vào lượng mẫu sử dụng, môi trường điều kiện ủ Các tế bào đĩa không tăng trưởng hình thành khuẩn lạc với tốc độ nhau, nhiều tế bào chưa kịp hình thành khuẩn lạc thời gian ủ không đủ dài Thông thường điều kiện nuôi cấy ( môi trường, nhiệt độ, thời gian) cần đảm bảo cho số khuẩn lạc xuất tối đa Phương pháp đếm khuẩn lạc dễ cho sai số lớn nên cần thực nồng độ nhiều nồng độ Phương pháp sử dụng rộng rãi kiểm nghiệm vi sinh vật nước, thực phẩm bệnh phẩm Có phương pháp đếm đĩa là: - Phương pháp cấy trang; Phương pháp đỗ đĩa Ưu điểm  Cho phép xác định số tế bào sống  Định lượng chọn lọc vi sinh vật  Có thể xác định vi sinh vật mật độ thấp Nhược điểm û Mất nhiều thời gian, hóa chất cơng sức 1.2 Phương pháp MPN (Most Possible Number) Phương pháp MPN dùng để đánh giá lượng vi sinh vật theo số có xác suất lớn lượng vi sinh vật có đơn vị thể tích mẫu với độ xác tương đối cao dựa thao tác trang thiết bị đơn giản Phương pháp MPN ( phương pháp có số xác suất cao nhất) gọi phương pháp pha lỗng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ Quy trình định lượng theo phương pháp MPN: cho vào ống nghiệm có chứa mơi trường thích hợp cho tăng trưởng đối tượng vi sinh vật cần định lượng thể tích xác dung dịch mẫu nồng độ pha lỗng bậc 10 liên tiếp ( ví dụ: 1/10, 1/100, 1/1000) Ủ nhiệt độ thời gian thích hợp Dựa vào kết biểu kiến chứng minh 10 tăng trưởng vi sinh vật ống nghiệm ( thường tượng sinh hơi, đổi màu, đục…) ghi nhận số lượng ống nghiệm dương tính độ pha lỗng Sử dụng số liệu dựa vào bảng Mac Crady suy mật độ vi sinh vật trình 12 1.3 Phương pháp màng lọc (Membrane Filter Method) Phương pháp màng lọc dùng để định lượng vi sinh vật thị mẫu nước tiến hành thử nghiệm mơi trường nơi có mật độ vi sinh vật tương đối thấp Bản chất phương pháp tập trung số vi sinh vật ỏi mẫu nước có khối lượng lớn màng lọc khuẩn định lượng chúng theo số khuẩn lạc đếm sau đặt màng lọc lên mơi trường thạch có thành phần dinh dưỡng thích hợp cho loại vi sinh vật cần kiểm Dựa mẫu nước ban đầu quy ước coi lạc khuẩn hình thành từ vi khuẩn mà người ta quy số lượng vi sinh vật có đơn vị thể tích nước Về thực chất kết hợp phương pháp lọc vô khuẩn (thường dùng để lọc trùng số dung dịch chịu nhiệt, dễ bị biến chất phân hủy khử trùng nhiệt độ cao) phương pháp đếm khuẩn lạc đĩa Màng lọc có kích thước lỗ vào khoảng 0,2-1μm Những vật liệu thường dùng để chế tạo màng lọc khuẩn sợi thủy tinh siêu mảnh, sợi amiante, sợi polypropylen… vật liệu có khả chịu nhiệt độ áp suất cao nồi hấp tiệt trùng Màng lọc loại thường cung cấp trạng thái vơ trùng Ngồi màng lọc bình thường người ta cịn sử dụng màng lọc lưới kỵ nước có in vuông vật liệu kỵ nước Các vạch chia ô vật liệu ngăn cản mọc lan khuẩn lạc chia bề mặt màng lọc thành có kích thước xác định Số vng có khuẩn lạc mọc đếm quy số có xác suất lớn ( MPN) lượng vi sinh vật có thể tích mẫu theo cơng thức: MPN = N.ln (N/N – x) Trong : - N tổng số ô vuông x số ô có khuẩn lạc mọc Ưu điểm: Xác định mật độ vi sinh vật cụ thể thể tích mẫu lớn: 10ml, 100ml Nhược điểm: Khơng thích hợp 12 cho việc phân tích mẫu thực phẩm rắn Phương pháp đại 2.1 Phương pháp PCR ( Plymerase Chain Reaction) 13 Phương pháp PCR phương pháp in vitro để tổng hợp DNA dựa khn trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng khuôn thành hàng triệu nhờ hoạt động enzyme polymerase cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA Kỹ thuật Karl Mullis phát minh năm 1985 Phương pháp cho phép tổng hợp nhanh xác đoạn DNA riêng biệt Đây thực phương pháp đại thuận tiện cho việc xác định có mặt gen tế bào với độ xác cao Phương pháp dựa khám phá hoạt tính sinh học nhiệt độ cao DNA polymerase tìm thấy sinh vật ưa nhiệt ( vi khuẩn sống suối nước nóng) Phần lớn DNA polymerase làm việc nhiệt độ thấp Nhưng nhiệt độ thấp DNA xoắn chặt DNA polymerase khơng có nhiều khả làm biến tính phần lớn phần phân tử Nhưng polymerase chịu nhiệt hoạt động nhiệt độ cao, lên đến 1000 C Ở nhiệt độ DNA ( dạng thẳng) bị biến tính Ưu điểm:  Thời gian cho kết nhanh  Có thể nhận diện vi sinh vật khó ni cấy Việc nuôi cấy tăng sinh đơn giản có khơng cần thiết  Hóa chất cần cho phản ứng PCR sẵn có dễ tồn trữ so với trường hợp huyết lọc Không cần dụng cụ mơi trường chuẩn đốn phức tạp  Ít tốn mặt nhân sự, tự động hóa làm giảm chi phí phát vi sinh vật gây bệnh thực phẩm Nhược điểm: û Thực phẩm chứa chất ức chế enzyme polymerase û Mật độ vi sinh vật mẫu thường thấp, cần tăng sinh û Không phân biệt tế bào sống tế bào chết, dẫn đến dương tính giả DNA từ tế bào chết (tuy phát bào tử , tế bào chết vi sinh vật gây độc) 2.2 Phương pháp ELISA ( Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) 13 Phương pháp ELISA phương pháp hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme Nguyên tắc kỹ thuật ELISA sử dụng kháng thể đơn dịng (kháng thể sơ cấy) phủ bên ngồi giếng (well) nhỏ nhằm mục đích thu giữ kháng nguyên mục tiêu Những kháng 14 nguyên mục tiêu thu giữ phát cách sử dụng kháng thể thứ hai có gắn với enzyme có phát tín hiệu ( thường horseradish peroxidase hay alkaline phosphatase) Khi cho vào hỗn hợp phản ứng chất đặc hiệu enzyme, phản ứng xảy tạo sản phẩm làm đổi màu phản ứng Như phát diện kháng nguyên Hiện ELISA sử dụng rộng rãi phân tích Salmonella, E coli gây bệnh( EHEC, STEC, IEHEC,…), Listeria, độc tố Staphylococus, thuốc trừ sâu, dư lượng kháng sinh… vi sinh vật, phương pháp ELISA sử dụng phát định lượng vi sinh thực phẩm sau vài tăng sinh nhằm tăng độ nhạy phương pháp Ưu điểm:  Độ nhạy cao  Cho kết nhanh Nhược điểm: û Không phân biệt tế bào sống chết III TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 7924-2 : 2008 Phạm vi áp dụng: Tham chiếu theo TCVN 7924-2-2008 Tiêu chuẩn qui định phương pháp định lượng Escherichia coli dương tính βglucuronidaza thực phẩm thức ăn chăn nuôi Phương pháp sử dụng kỹ thuật đếm khuẩn lạc 440C mơi trường đặc có chứa thành phần để phát enzyme β-glucuronidaza Cảnh báo Một số chủng Escherichia coli không phát triển 440C cụ thể Escherichia coli âm tính β-glucuronidaza Escherichia coli O157 không phát Cấy lượng mẫu thử xác định với lượng xác định huyền phù ban đầu lên đĩa kép chứa môi trường trypton-mật-glucuronid (TBX) 14 Sử dụng dung dịch pha loãng thập phân mẫu thử huyền phù ban đầu cấy vào hai đĩa cho dung dịch pha lỗng, điều kiện 15 Mơi trường ni cấy dịch pha lỗng 1.1 Dịch pha loãng: tham chiếu theo TCVN 6507-1-2005  Thành phần: Pepton từ casein 1,0g Natriclorua 8,5g Nước 1000ml  Chuẩn bị: Hồ tan thành phần nước, đun nóng cần Chỉnh pH cho sau khử trùng, pH 0,2 250C cần  Mục đích : Dùng để pha lỗng mẫu 1.2 Mơi trường nuôi cấy: tham chiếu theo TCVN 7924-2-2008 Thạch trypton-mật-glucuronid (TBX)  Thành phần: Sản phẩm thuỷ phân casein enzyme 20,0g Muối mật No.3 1,5g Acid 5-bromo-4-clo-3-indolyl-β-glucuronid (BCIG) 144μmola Dimetyl sulfoxit (DMSO)b 3ml Thạch (agar) 9g đến 18g c Nước 1000ml a Ví dụ: 0,075g muối xyclohexylamoni b Dimetyl sulfoxit độc hít tiếp xúc phải Cần phải sử dụng tủ hút khói Vì độc tính nên nhà sản xuất khuyến cáo dùng dung dịch pha lỗng c Phụ thuộc vào sức đơng thạch 15 16 Các sản phẩm thuỷ phân casein enzyme nguồn cung cấp nitrogen, vitamin, amino acid môi trường TBX Muối mật nhiệt độ ủ cao 44 0C ức chế phần lớn vi khuẩn gram dương, đặc biệt trực khuẩn (bacillus) liên cầu khuẩn (fecal streptococcus) Bởi có diện enzyme β-glucuronidaza giúp phân biệt hầu hết E.coli từ Coliforms khác E.coli hấp thụ chất BCIG, enzyme β-glucuronidaza tách liên kết 5-bromo-4-clo-3-indol β-glucuronid, E.coli tạo màu xanh lam Agar tác nhân làm cứng hố mơi trường Nước có tác dụng hịa tan chất có mơi trường  Chuẩn bị: Hoà tan BCIG Dimetyl sulfoxit dung dịch lỗng theo khuyến cáo nhà sản xuất Hồ tan tất thành phần nước đun đến sôi Khử trùng môi trường nhiệt độ 121 0C 15 phút nồi hấp áp lực Làm nguội môi trường nồi cách thuỷ đến khoảng từ 44 đến 470C Chỉnh pH để sau khử trùng, pH phải 7,2 0,2 250C cần Môi trường nuôi cấy chuẩn bị suốt có màu vàng Được bảo quản 2-80C khỏi ánh sáng đặt chai vòng tuần Chuẩn bị các đĩa thạch Rót lượng từ 12 đến 15 ml môi trường vào đĩa Petri vô trùng để đông đặc Làm khơ đĩa thạch Các đĩa bảo quản đến ngày 2-3 0C Các đĩa thạch cần phải đủ khô để nước không xuất 15 phút dàn dịch cấy (1ml)  Mục đích: Dùng làm mơi trường ni cấy chọn lọc 16 17 Hình 4: TBX Agar - BK146HA Hình 5: Muối mật No.3 17 Hình 6: CTHH Acid 5-bromo-4-clo-3-indolyl-β-glucuronid (BCIG) 18 Quy trình phân tích 2.1 Lấy mẫu Điều quan trọng mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải mẫu đại diện Mẫu không bị hư hỏng thay đổi thành phần trình vận chuyển bảo quản Việc lấy mẫu không qui định tiêu chuẩn Nên lấy mẫu theo tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm Nếu khơng có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm bên tự thỏa thuận vấn đề 2.2 Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử theo tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm Nếu khơng có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm bên tự thỏa thuận vấn đề  Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng Tham chiếu theo TCVN 6507-1-2015 tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm cần xác định  Phần mẫu thử huyền phù ban đầu Cân lượng 10g với sai số cho phép ± 5% đong thể tích 10ml với sai số cho phép ± 5%, phần mẫu thử đại diện (xem điều 8) cho vào chén đựng vô trùng túi chất dẻo vô trùng Cho lượng dịch pha loãng 90 ml Lượng thêm cân đong với sai số cho phép ± 5% CHÚ THÍCH 1: Trong số trường hợp cụ thể, đặc biệt đối sản phẩm có huyền phù ban đầu + sánh q đặc cần phải tăng thêm dịch pha lỗng Điều phải tính đến thao tác và/hoặc phải tính đến phần tính kết CHÚ THÍCH 2: Dung dịch pha loãng ban đầu định phần giá trị giới hạn 18 phép định lượng, điều phụ thuộc vào kỹ thuật sử dụng (ví dụ, kỹ thuật rót đĩa với ml chất cấy huyền phù 1/10, có giới hạn 10 vi sinh vật gam) Nếu cần, số sản phẩm cụ thể để số đếm thấp giới hạn sử 19 dụng lượng dịch pha loãng nhỏ 1) Cần ý việc cấy huyền phù ban đầu gặp khó khăn khơng cân tỷ lệ chất cấy/môi trường cấy (ức chế phát triển vi sinh vật nồng độ thành phần thực phẩm tăng) Để vi sinh vật không bị tổn thương thay đổi nhiệt độ đột ngột, nhiệt độ dịch pha lỗng suốt q trình thao tác mô tả phải giữ xấp xỉ nhiệt độ phòng, trừ trường hợp sản phẩm cụ thể (xem tiêu chuẩn riêng) Đồng hóa hỗn hợp theo khuyến cáo TCVN 6404 (ISO 7218) Để hạt to lắng xuống 15 phút, cần Có thể sử dụng hệ thống lọc để có kết tương đương Trong trường hợp định lượng bào tử, việc xử lý nhiệt huyền phù ban đầu, ví dụ 10 phút 800C cần thực sau chuẩn bị làm nguội nhanh  Các dung dịch pha loãng thập phân Dùng pipet vô trùng lấy ml huyền phù ban đầu với sai số đo ± 5% cho vào ống nghiệm chứa ml dung dịch pha lỗng vơ trùng nhiệt độ thích hợp CHÚ THÍCH: Nếu cần thể tích lớn hơn, thêm thể tích xác định (lớn ml) huyền phù ban đầu với sai số đo ± 5%, vào ống nghiệm chứa thể tích dịch pha lỗng vơ trùng lớn gấp lần Để có độ xác tối ưu, không nhúng pipet vào huyền phù ban đầu sâu cm Không để pipet chứa chất cấy tiếp xúc với dịch pha lỗng vơ trùng Trộn kỹ, tốt dùng máy khuấy để trộn giây đến 10 giây để thu dung dịch pha loãng 10-2 Nếu cần, lặp lại thao tác sử dụng dung dịch pha loãng 10 -2 dung dịch pha lỗng tiếp theo, dùng pipet vơ trùng độ pha lỗng để thu dung dịch pha loãng 10-3, 10-4.v.v thu số lượng vi sinh vật thích hợp 2.3 Cấy ủ 19 1)1) Trong trường hợp thể tích dịch pha lỗng dùng phải ghi lại báo cáo thử nghiệm 20 Dùng pipet micropipet vô trùng chuyển 1ml mẫu thử (nếu mẫu thử dạng lỏng) 1ml dịch pha loãng ban đầu (10-1) (nếu sản phẩm dạng khác vào đĩa petri vô trùng) Cấy vào hai đĩa nồng độ pha lỗng Lặp lại q trình cho dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo, sử dụng pipet vơ trùng cho độ pha lỗng, cần Rót vào đĩa petri khoảng 15ml mơi trường TBX mà trước làm nguội đến khoảng từ 44 – 470C nồi cách thuỷ Trộn cẩn thận dịch cấy với môi trường để yên cho hỗn hợp đông lại, để đĩa petri mặt phẳng mát nằm ngang Thời gian tính từ phân phối dịch cấy vào đĩa đến rót mơi trường không 15 phút Lật ngược đĩa để vào tủ ấm để 44 0C khoảng từ 18-24 Tổng thời gian ủ không 24 Cảnh báo: nghi ngờ có mặt tế bào bị ức chế ủ giai đoạn đầu khoảng khoảng 370C sau tăng nhiệt độ lên 44 0C ủ khoảng 18-24 Nhiệt độ ủ không 450C 2.4 Đếm đơn vị hình thành khuẩn lạc Sau giai đoạn ủ ấm quy định, đếm CFU điển hình Escherichia coli dương tính βglucuronidaza đĩa thạch chứa 150 CFU điển hình 300 CFU tổng số (điển hình khơng điển hình) Nếu dịch cấy tách riêng quan sát khuẩn lạc điển hình, đĩa chứa CFU điển hình cần xem xét theo phương pháp tính khác điều 10 2.5 Biểu thị kết 20 21 2.5.1 Yêu cầu chung Việc tính tốn cần tính đến trường hợp thường gặp tiến hành theo thực hành phịng thí nghiệm tốt Cũng có số trường hợp đặc biệt xảy (ví dụ số lượng CFU khác hai đĩa từ dung dịch pha loãng, tỷ lệ khác nhiều từ hệ số pha loãng đĩa từ hai độ pha loãng liên tiếp) Các kết đếm cần người phân tích có lực kiểm tra, giải thích kết bị loại bỏ 2.5.2 Tính tốn Để có kết đúng, cần đếm CFU điển hình đĩa chứa 15 CFU màu xanh điển hình Tính N, số lượng CFU Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza có mặt mẫu thử mililit gam sản phẩm từ hai độ pha loãng liên tiếp sử dụng cơng thức (1): (1) đó: : tổng số khuẩn lạc đếm tất đĩa giữ lại sau hai độ pha lỗng liên tiếp có đĩa chứa tối thiểu 15 CFU màu xanh; n1 : số đĩa giữ lại độ pha loãng thứ nhất; V : thể tích dịch cấy dùng đĩa, tính mililit; n2 : số đĩa giữ lại độ pha loãng thứ hai; d : hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ giữ lại [d = trường hợp (các mẫu dạng lỏng) mẫu thử cấy trực tiếp] 21 Làm tròn kết đến hai chữ số có nghĩa [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] 22 Lấy kết số lượng Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza mililit (sản phẩm dạng lỏng) gam (sản phẩm dạng khác) biểu thị theo số nguyên đến hai chữ số có nghĩa (dưới 100) theo số từ 1,0 đến 9,9 nhân lũy thừa 10 2.5.3 Ước tính số lượng nhỏ  Nếu có hai đĩa [của mẫu thử (nếu sản phẩm dạng lỏng) huyền phù ban đầu (nếu sản phẩm dạng khác) độ pha loãng thứ cấy giữ lại] chứa 15 CFU màu xanh, tính NE, số CFU Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza có mặt mẫu thử trung bình hai đĩa song song theo cơng thức (2): (2) : tổng CFU màu xanh điển hình đếm hai đĩa; V : thể tích dịch cấy dùng đĩa, tính mililit; N : số đĩa giữ lại (trong trường hợp n = 2); d : hệ số pha loãng tương ứng với dung dịch huyền phù ban đầu độ pha loãng thứ cấy giữ lại [d = trường hợp (sản phẩm dạng lỏng) mẫu thử cấy trực tiếp] Làm tròn kết đến hai chữ số có nghĩa [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] Biểu thị kết sau: Số lượng Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza ước tính mililit (đối với sản phẩm dạng lỏng) miligam (sản phẩm dạng khác): NE = Y 22  Nếu hai đĩa mẫu thử [(sản phẩm dạng lỏng) huyền phù ban đầu (sản phẩm dạng khác) độ pha loãng thứ cấy giữ lại] không chứa CFU màu xanh nào, biểu thị kết sau: 23 Ít 1/d Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza mililit (sản phẩm dạng lỏng) gam (sản phẩm dạng khác); Trong d hệ số pha loãng huyền phù ban đầu độ pha loãng thứ cấy giữ lại [d = 1] trường hợp (sản phẩm dạng lỏng) mẫu thử cấy trực tiếp  Nếu tất CFU điển hình khơng điển hình hai đĩa độ pha lỗng thứ d1 chứa nhiều 300, có CFU màu xanh nhìn thấy, hai đĩa độ pha loãng d2 chứa 300 khuẩn lạc, khơng có CFU màu xanh cần đếm, biểu thị kết sau: Ít 1/d2 nhiều 1/d1 Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza có mililit (sản phẩm dạng lỏng) gam (sản phẩm dạng khác); Trong d1 d2 hệ số pha loãng tương ứng với dung dịch pha loãng d1 d2  Nếu tất CFU điển hình khơng điển hình hai đĩa độ pha lỗng thứ d1 chứa nhiều 300, khơng có CFU màu xanh nhìn thấy, hai đĩa độ pha lỗng d chứa 300 khuẩn lạc, khơng có CFU màu xanh cần đếm, biểu thị kết sau: Ít 1/d2 CFU Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza có mililit (sản phẩm dạng lỏng) gam (sản phẩm dạng khác); Trong d2 hệ số pha loãng tương ứng với dung dịch pha lỗng d2 2.5.4 Phương pháp tính: Các trường hợp đặc biệt  Trong trường hợp hai đĩa độ pha loãng d chứa nhiều 150 CFU màu xanh, hai đĩa độ pha loãng d2 chứa 15 CFU màu xanh: -Nếu số lượng CFU màu xanh đĩa độ pha loãng d nằm khoảng từ 150 23 tin cậy giá trị trung bình 150), sử dụng đến 167 (giới hạn khoảng phương pháp tính trường hợp chung 24 -Nếu số lượng CFU màu xanh đĩa độ pha loãng d nhiều 167 (giới hạn khoảng tin cậy giá trị trung bình 150 CFU), tính đến kết số đếm độ pha loãng d2 thực tiếp với việc đếm số lượng nhỏ  Trong trường hợp số đếm CFU màu xanh đĩa tất độ pha loãng cấy có nhiều 150, biểu thị kết sau: Nhiều 150/d Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza có mililit (sản phẩm dạng lỏng) gam (sản phẩm dạng khác) Trong d hệ số pha lỗng dung dịch pha loãng cấy sau  Trong trường hợp có hai đĩa độ pha lỗng thấp (nồng độ cao nhất) chứa 150 CFU điển hình, tính số N' Escherichia coli dương tính βglucuronidaza có mặt mẫu thử trung bình số khuẩn lạc đếm hai đĩa, sử dụng cơng thức (3): (3) : tổng số khuẩn lạc màu xanh đếm hai đĩa, có đĩa chứa tối thiểu 15 CFU điển hình; V : thể tích dịch cấy cấy đĩa, tính mililit; n : số đĩa giữ lại (trong trường hợp n = 2); d : hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng giữ lại Làm trịn kết đến hai chữ số có nghĩa [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] 2.5.5 Các giới hạn tin cậy Xem TCVN 6404 (ISO 7218) 2.6 Báo cáo thử nghiệm 24 25 Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:  Mọi thông tin cần thiết nhận biết đầy đủ mẫu thử;  Phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết;  Phương pháp thử sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;  Tất điều kiện thao tác không quy định tiêu chuẩn này, xem tùy ý, với tình bất thường ảnh hưởng đến kết quả;  Kết thử nghiệm thu được, nêu rõ phương pháp biểu thị sử dụng  Nếu đáp ứng yêu cầu độ lặp lại nêu kết cuối thu 25 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO “Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm”,Trần Linh Phước, Nhà xuất giáo dục Môi trường Tryptone Bile Glucuronic Agar Công ty TNHH thương mại dịch vụ công nghệ Nguyên Dương Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN7924-2:2008 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN6507-1:2015 Merck Microbiology Manual 12th Edition 26 ... E. coli) : E. coli sinh độc tố ruột  EIEC (Enteroinvasive E. coli) : E. coli xâm nhập ruột  EAEC (Enteroaggregative E. coli) : E. coli ngưng tập ruột  DAEC (Diffusely adherent E. coli) : E. coli bám dính... (ExPEC – extraintestinal pathogenic E. coli) Các loại E. coli gây bệnh đường ruột (IPEC) biết gồm:  EPEC (Enteropathogenic E. coli) : E. coli gây bệnh đường ruột  ETEC (Enterotoxigenic E. coli) : E. coli. ..  EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli) : E. coli gây xuất huyết ruột Hình 3: EPEC (Enteropathogenic E. coli) : E. coli gây bệnh đường ruột Hai loại E. coli gây bệnh đường ruột quan trọng là:  MAEC (Meningitidis-associated