Thử nghiệm điều chế auto-vaccine phòng tiêu chảy do E.coli trên heo con sau cai sữa

Thử nghiệm điều chế auto-vaccine phòng tiêu chảy do E.coli trên heo con sau cai sữa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THỬ NGHIỆM ĐIỀU CHẾ AUTO-VACCINE

PHÕNG TIÊU CHẢY DO E coli TRÊN

HEO CON SAU CAI SỮA

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007

Sinh viên thực hiện: CAO VĂN HÕA

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

************************

THỬ NGHIỆM ĐIỀU CHẾ AUTO-VACCINE

PHÕNG BỆNH TIÊU CHẢY DO E coli

TRÊN HEO CON SAU CAI SỮA

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007

iii

LỜI CẢM TẠ

Đề tài nghiên cứu này tuy Con làm còn nhiều thiếu sót và chưa tốt nhưng Con cũng xin dành tặng ba mẹ Đây là kết quả mà 22 năm ba mẹ làm lụng để nuôi dạy con Con hy vọng món quà bé nhỏ này sẽ làm vui và vơi bớt phần nào nỗi khổ cực, lo âu của ba mẹ Con trai của ba mẹ yêu ba mẹ nhiều lắm

Em xin chân thành cảm tạ Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trường

Và người có ảnh hưởng rất lớn đến sự hoàn thành đề tài này là thầy Hải (TS

Nguyễn Ngọc Hải) Em cám ơn thầy rất nhiều về những gì mà thầy đã dành cho

em Em đến với thầy trong một hoàn cảnh rất khác với các bạn, nhưng với sự quan tâm hướng dẫn ân cần của thầy đã giúp em có nhiều nghị lực và niềm vui mà vượt qua các giai đoạn khó khăn Khi làm việc với thầy, em không chỉ học hỏi được ở thầy kiến thức, kỹ năng mà em còn thấy ở thầy nhiều đức tính cao đẹp để em học tập Thầy có lối sống thật đơn giản, nhưng thầy rất giàu tình cảm và đức hy sinh Thầy là một Nhà Giáo mẫu mực đầu tiên mà em được gặp

Em xin cảm ơn TS Lê Anh Phụng, ThS Trần Thị Bích Liên, cô Lê Thị Hà và BSTY Nguyễn Thị Kim Loan đã giúp đỡ và cho em điều kiện thực hiện đề tài

iv

TÓM TẮT

CAO VĂN HÕA Đề tài: “Thử Nghiệm Điều Chế Auto-Vaccine Phòng Bệnh

Tiêu Chảy Do E coli Trên Heo Con Sau Cai Sữa” Thời gian: 01/05/2007 -

02/08/2007 Địa điểm: phòng thí nghiệm vi sinh, Bộ môn Vi Sinh – Truyền Nhiễm, khoa Chăn Nuôi – Thú Y, trường đại học Nông Lâm TPHCM và công ty TNHH Gia Nam, huyện Bến Cát, tỉnh Bình Dương

Hội đồng hướng dẫn: TS NGUYỄN NGỌC HẢI

Bước 1, phân lập vi khuẩn E coli từ các mẫu phân tiêu chảy ở trại heo, các

chủng E coli này sẽ được kiểm tra sinh hóa bằng nghiệm pháp IMViC và được

định type kháng nguyên F4, F5, F6

Bước 2, lựa chọn 5 chủng E coli có kết quả phản ứng rõ ràng để sản xuất

auto-vaccine

Bước 3, bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu quả auto-vaccine:

Lô 1: 3 bầy heo con, được tiêm auto-vaccine 1 lần Lô 2: 3 bầy heo con, được tiêm auto-vaccine 2 lần Lô đối chứng: 2 bầy heo con, được tiêm chất bổ trợ

Việc đánh giá hiệu quả auto-vaccine dựa vào hiệu giá kháng thể, tỷ lệ heo tiêu chảy, tăng trọng trung bình tuyệt đối và các phản ứng phụ sau tiêm,

Kết quả:

Auto-vaccine thực nghiệm tạo đáp ứng miễn dịch cao và kéo dài

Auto-vaccine thực nghiệm không gây tác dụng phụ sau tiêm và không ảnh hưởng đến tăng trọng heo con

Chưa thể đánh giá chính xác được hiệu quả bảo hộ tiêu chảy do E coli của

auto-vaccine

v

SUMMARY

CAO VAN HOA, Nong Lam University, HCM city Graduating thesis topic: “The experiment of auto-vaccine production to protect the post – weaning

piglet from the diarrhoea caused by E coli” The thesis was carried out at

Microbiology lab, Microbiology and Infectious Diseases Dept of Faculty of Animal Science and Veterinary, Nong Lam University and Gia Nam Ltd Company, Binh Duong province from 5/2007 to 8/2007

Supervisor: Dr NGUYEN NGOC HAI

First, isolate E coli from the diarrhoea feces and identify them by IMViC test,

then serotype with F4, F5, F6 antiserum

Second, selecte 5 E coli isolates of serotype F4 or F5 to produce the vaccine

auto-Third, set up the experiment to evaluate the efficiency of auto-vaccine (the

experiment was repeated in 2 times):

The first group: 3 litters (28 piglets, from 14 to 20 days aged), vaccine injection one times

The second group: 3 litters (28 piglets, from 14 to 20 days aged), vaccine injection two times with 10 days interval

The control group: 2 litters (22 piglets, from 14 to 20 days aged), adjuvant injection two times with 10 days interval

The efficacy of auto-vaccine was evaluated by antiody titers, medium daily gain and the side effects

Result:

The auto-vaccine made a high antibody titers and long immunization

The auto-vaccine did not bring neither the bad effects to piglets vaccinated

health nor the gain weight of piglet

The results could not conclude exactly the efficacy of auto-vaccine on E

Coli diarrhoea control

2.1.3.1 Kháng nguyên thân O 4

2.1.3.2 Kháng nguyên bề mặt hay kháng nguyên K 5

2.1.3.3 Kháng nguyên F (fimbriae) 5

2.1.3.4 Kháng nguyên H hay kháng nguyên lông roi (flagella) 6

2.2 Bệnh tiêu chảy 6

2.2.1 Khái niệm 6

2.2.2 Nguyên nhân gây tiêu chảy 7

2.2.2.1 Điều kiện ngoại cảnh bất lợi 7

2.2.2.2 Nuôi dƣỡng không đúng kỹ thuật 7

2.2.2.3 Vi sinh vật 8

2.3 Sự miễn dịch 9

2.3.1 Khái niệm miễn dịch 9

2.3.2 Phân loại miễn dịch 9

2.3.2.1 Miễn dịch không đặc hiệu 9

2.3.2.2 Miễn dịch đặc hiệu 10

2.3.3 Khái niệm về kháng nguyên (antigen) và kháng thể (antibody) 11

2.4.2 Phân loại vaccine 16

2.4.2.1 Vaccine giảm độc lực (attenuated) 16

2.4.2.2 Vaccine bất hoạt (inactivated) 16

2.4.2.3 Các “toxoid” 17

2.4.2.4 Vaccine từng phần hay vaccine dưới đơn vị (subunit) 17

2.4.2.5 Một số loại vaccine mới đang nghiên cứu 17

2.4.3 Định nghĩa auto-vaccine 18

2.4.4 Quy trình sản xuất auto-vacine 18

2.4.5 Ưu điểm và nhược điểm của việc sản xuất, sử dụng auto-vaccine 18

2.5.3 Chất bổ trợ MONTANIDE (chất bổ trợ được sử dụng trong đề tài này) 20

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 21

3.4.1 Phương pháp lấy mẫu 22

3.4.2 Nghiên cứu vi sinh vật 23

3.4.2.1 Nuôi cấy phân lập 23

3.4.2.2 Kiểm tra sinh hóa 23

3.4.3 Điều chế auto-vaccine 28

3.4.4 Kiểm tra độ vô trùng của auto-vaccine 30

3.4.5 Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu quả auto-vaccine 30

3.4.5.1 Yếu tố thí nghiệm 30

3.4.5.2 Phân phối heo vào các lô thí nghiệm 30

3.4.6 Phương pháp kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng phản ứng ngưng kết chậm trong ống nghiệm 32

3.4.6.1 Lấy mẫu máu và bảo quản 32

3.4.6.2 Chuẩn bị dịch kháng nguyên 33

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

4.1 Kết quả lựa chọn chủng E coli làm auto-vaccine 37

4.3.3 Kết quả tổng kết hiệu giá kháng thể 46

4.4 Tỷ lệ heo tiêu chảy 47

4.4.1 Thí nghiệm 1 47

4.4.2 Thí nghiệm 2 48

xii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

E coli: Escherichia coli

EMB: Eosin Methylene Blue Lactose

IMViC: Indol – Methyl Red – Voges Proskauer – Citrate

xiii

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 3.1 Lấy mẫu phân tiêu chảy ở heo con 22

Hình 3.2 Phân lập E coli trên môi trường EMB 23

Hình 3.3 Vi khuẩn E coli lên men lên men đường sinh hơi trong

xiv

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Tỷ lệ các vi sinh vật gây tiêu chảy trên heo 8

Bảng 3.1 Phân lô và liều tiêm heo con 31

Bảng 4.1 Hiệu giá kháng thể của 3 lô qua 3 lần rút máu (thí nghiệm 1) 39

Bảng 4.2 Hiệu giá kháng thể của 3 lô qua 3 lần rút máu (thí nghiệm 2) 43

Bảng 4.3 Tổng kết hiệu giá kháng thể của 2 thí nghiệm 46

Bảng 4.4 Kết quả heo bị tiêu chảy ở thí nghiệm 1 47

Bảng 4.5 Kết quả heo bị tiêu chảy ở thí nghiệm 2 48

Bảng 4.6 Tỷ lệ tiêu chảy của heo toàn thí nghiệm 49

Bảng 4.7 Kết quả thống kê tăng trọng trung bình tuyệt đối của 3 lô (TN1) 50

Bảng 4.8 Kết quả thống kê tăng trọng trung bình tuyệt đối của 3 lô (TN2) 51

Bảng 4.9 Tăng trọng trung bình tuyệt đối của các lô qua cả 2 TN 52

Biểu đồ 4.4 Hiệu giá kháng thể trung bình của 3 lô qua 3 lần rút máu (TN1) 42

Biểu đồ 4.5 Hiệu giá kháng thể trung bình của 3 lô ở lần rút máu

Biểu đồ 4.8 Hiệu giá kháng thể trung bình của 3 lô qua 3 lần rút máu (TN2) 45

Biểu đồ 4.9 Tỷ lệ heo bị tiêu chảy ở thí nghiệm 1 47

Biểu đồ 4.10 Tỷ lệ heo bị tiêu chảy ở thí nghiệm 2 48

Biểu đồ 4.11 Tăng trọng trung bình tuyệt đối của 3 lô (thí nghiệm 1) 50

Biểu đồ 4.12 Tăng trọng trung bình tuyệt đối của 3 lô (thí nghiệm 2) 51

xvi

xvii

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3.1 Quy trình phân lập và định danh vi khuẩn E coli 27

Sơ đồ 3.2 Quy trình tạo dịch huyền phù kháng nguyên E coli 29

Sơ đồ 3.3 Tóm tắt bố trí thí nghiệm 31

Sơ đồ 3.4 Lịch trình thực hiện của 1 lần thí nghiệm 31

Sơ đồ 3.5 Quy trình tạo dịch huyền phù kháng nguyên E coli 34

Sơ đồ 3.6 Cách tiến hành phản ứng ngƣng kết xác định

hiệu giá kháng huyết thanh 35

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Trong chăn nuôi nói chung và chăn nuôi heo nói riêng, việc phòng chống dịch bệnh là vô cùng cần thiết đối với đàn vật nuôi Và với mô hình chăn nuôi công nghiệp, nếu không chú ý kiểm soát thì dịch bệnh rất dễ xảy ra và dễ bùng phát thành đại dịch

Tiêu chảy là một trong số các bệnh xảy ra nhiều và rộng, gây tổn thất không nhỏ cho đàn heo Và một trong những nguyên nhân của bệnh, đặc biệt ở heo con sau cai

sữa, là vi khuẩn Escherichia coli, với đặc điểm xảy ra lẻ tẻ quanh năm và bùng phát

mạnh lúc giao mùa, khi thời tiết không ổn định (Nguyễn Khả Ngự & ctv, 1998) Bệnh có tử số không cao nhưng tăng trọng hằng ngày có thể giảm và gây thiệt hại đáng kể cho nhà chăn nuôi (Taylor, 1995)

Trong thực tế hiện nay, việc phòng trị tiêu chảy do E coli chủ yếu dựa vào thuốc

kháng sinh, liệu pháp này đang bộc lộ những hạn chế như hiện tượng đề kháng kháng sinh và có thể ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng Nghiên cứu tìm kiếm

vaccine hiệu quả cho việc phòng tiêu chảy trên heo sau cai sữa do E coli là hết sức cần thiết Vi khuẩn E coli có nhiều type kháng nguyên nên việc nghiên cứu điều

chế một loại vaccine phù hợp với trại chăn nuôi luôn mang lại hiệu quả cao

Được sự hướng dẫn của TS Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“THỬ NGHIỆM ĐIỀU CHẾ AUTO-VACCINE PHÕNG BỆNH

TIÊU CHẢY DO E coli TRÊN HEO SAU CAI SỮA”

1.2 Mục đích và yêu cầu

1.2.1 Mục đích

Thử điều chế auto-vaccine phòng tiêu chảy do E coli trên heo con sau cai sữa

cho trại chăn nuôi

1.2.2 Yêu cầu

- Phân lập thành công chủng E coli gây bệnh tiêu chảy cho heo con

- Sản xuất auto-vaccine và tiêm thử nghiệm trên heo con sau cai sữa

- Theo dõi đáp ứng miễn dịch trên heo thí nghiệm đối với auto - vaccine điều chế

- Theo dõi ảnh hưởng của auto-vaccine lên sức khỏe và tăng trưởng của heo thí nghiệm trong suốt thời gian thực hiện từ khi bắt đầu thí nghiệm 14 ngày tuổi đến 60 ngày tuổi

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Vi khuẩn Escherichia coli

2.1.1 Định nghĩa

Escherichia thuộc họ Enterobacteriaceae, bao gồm các loại trực khuẩn Gram âm

có kích thước khoảng 2-3µm x 0,5µm, di động nhờ các tiêm mao, không tạo bào tử, hiếu khí hoặc hiếu khí tùy nghi Các nhóm vi khuẩn này có mặt thường xuyên trong ruột của động vật, ở phần cuối của ruột non hoặc ruột già, cần thiết trong quá trình tiêu hóa thức ăn và là thành phần của khuẩn lạc ruột Chúng chiếm đến 80% trong thành phần của hệ vi sinh vật hiếu khí đường ruột (Intervet, 1997)

Chi Escherichia bao gồm 5 loài: E coli, E fergusonii, E hermanie, E vulneris,

E blattae

Nguồn gốc tên gọi: năm 1885, tại Munich, Theodor Escherich - một bác sĩ nhi

khoa trẻ phát hiện một loài vi khuẩn từ trong tã lót của trẻ em và được công bố với

tên gọi đầu tiên là Bacterium coli commune, bốn năm sau, được giới chuyên môn đổi tên thành Escherich nhằm tri ân người có công khám phá Năm 1895, người ta lại gọi bằng tên Bacillus coli và năm 1896, gọi thành Bacterium coli Sau nhiều kiểu gọi, đến năm 1991, vi khuẩn kia được định danh thống nhất toàn cầu là Escherichia

coli

Phân loại

Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria

Lớp: Gamma Protebacteria Bộ: Enterobacteriales

Họ: Enterobacteriaceae Chi: Escherichia

Loài: Escherichia coli

2.1.2 Đặc tính sinh hóa

Nuôi cấy: vi khuẩn hiếu khí hoặc hiếu khí tùy nghi Nhiệt độ thích hợp là 370

C (có thể tăng trưởng ở 100C– 460C), pH thích hợp 6,4 - 7,5 E coli mọc tốt trên môi

trường thạch dinh dưỡng; sau 24 giờ hình thành khuẩn lạc S có dạng tròn, ướt, trắng đục; nếu để lâu trở thành khuẩn lạc R có dạng khô, rìa hơi nhám

Một số hóa chất ngăn chặn được sự phát triển của E coli như: chlorin và các dẫn

xuất, muối mật, sodium deoxycholate, sodium tetrathionat, selenite…

Vi khuẩn E coli lên men sinh hơi đường glucose, galactose, lactose, maltose,

xylose, rhamnose, mannitol, fructose Lên men saccharose không đều, không lên men dextrin và glycogen, không sử dụng phenylalanin, ure, gelatin, malonate, adonitol, inositol, không sinh H2S

Để phân biệt E coli với các vi khuẩn đường ruột khác, người ta dùng nghiệm

pháp IMViC (++ )

2.1.3 Yếu tố kháng nguyên

2.1.3.1 Kháng nguyên thân O

Các kháng nguyên O có bản chất lipopolysaccharide (LPS), thường đặc trưng cho từng loài Chúng bền với nhiệt độ và cồn, khi đun ở nhiệt độ 1200C trong 2 giờ vẫn giữ được tính kháng nguyên, có khả năng ngưng kết và kết hợp Kháng nguyên O giữ một vai trò nhất định đối với khả năng gây bệnh của các dòng vi khuẩn và

một trong số các kháng nguyên này có tính chất chuyên biệt cho từng loài vật chủ Ví dụ như các type kháng nguyên sau đây:

 Ở người: O2, O4, O75, O9, O18, O22, O1  Ở bò: O8, O15, O20, O35, O86, O101, O115  Ở heo: O8, O45, O54, O138, O139, O141, O147  Ở gia cầm: O1, O2, O8, O11, O78

2.1.3.2 Kháng nguyên bề mặt hay kháng nguyên K

Kháng nguyên K là kháng nguyên giáp mô, che phủ hoàn toàn kháng nguyên O nên không cho kháng thể O gắn kết với các epitop trên kháng nguyên O, làm cho hiện tương ngưng kết không xảy ra (Lê Huy Chính và ctv, 2001) Kháng nguyên K gồm 3 type A, L, B

2.1.3.3 Kháng nguyên F (fimbriae)

Là kháng nguyên tiêm mao, có hình sợi, dài 4 µm, thẳng hay xoắn, đường kính 2,1 - 7 nm Chúng tạo nên đặc tính kết dính của vi khuẩn đối với tế bào, đặc biệt là đối với tế bào niêm mạc ruột Kháng nguyên này cũng chính là yếu tố tạo nên khả năng gây bệnh và khả năng ngưng kết hồng cầu cho những vi khuẩn có mang chúng Tuy nhiên khả năng ngưng kết hồng cầu này lại bị ức chế bởi đường mannose

Gần đây, để tránh nhầm lẫn với cách gọi tên của kháng nguyên giáp mô, người ta đã dùng danh pháp chuẩn hơn cho các yếu tố kết dính, được ký hiệu F Trong đó, K88 thành F4 , K99 thành F5, 987P thành F6 (Orskov, 1992; trích dẫn Broes và Fairbrother, 1993)

Kháng nguyên F là kháng nguyên mạnh, khi xâm nhập vào trong cơ thể nó sẽ kích thích cơ thể tạo nên kháng thể đặc hiệu và là cơ sở cho việc chẩn đoán huyết

thanh học và xác định type huyết thanh của các dòng E coli, cũng như xác định các

kháng thể bảo vệ Vì vậy, các kháng nguyên này được dùng để chế tạo vaccine

phòng bệnh E coli trên heo con Các tiêm mao liên quan đến E coli gây bệnh tiêu

chảy trên heo con là F4, F5, F6 và F41

2.1.3.4 Kháng nguyên H hay kháng nguyên lông roi (flagella)

Kháng nguyên H có bản chất protein, bị hủy bởi cồn, có tính chịu nhiệt, tuy nhiên khi đun 1000C trong 2 giờ thì các tính kháng nguyên, tính ngưng kết đều bị

phá hủy Kháng nguyên này có ở những dòng E coli di động Hiện nay, người ta đã

phát hiện được 56 loại kháng nguyên H

2.2 Bệnh tiêu chảy trên heo

2.2.1 Khái niệm

Tỷ lệ nước trong phân bình thường chiếm 80%, phân táo bón dưới 70%, phân

nhão 85%, phân lỏng trên 85% (tiêu chảy) Roux đã định nghĩa: “tiêu chảy là một

hội chứng đặc trưng bởi sự tống phân nhanh và phân nhiều nước” (Nguyễn Thị

Minh An và ctv, 2001) Trên thực tế, tiêu chảy là một biểu hiện lâm sàng của quá trình bệnh lý đặc thù ở đường tiêu hóa, thú đi phân lỏng, đôi khi có máu, bọt khí, chất nhầy… Hậu quả quan trọng của tiêu chảy là suy dinh dưỡng và gây thiệt hại về kinh tế, vì khi bị tiêu chảy bệnh súc sẽ ăn ít; đồng thời, khả năng hấp thu chất dinh dưỡng cũng giảm và có thể chết thú

Tiêu chảy xảy ra trên mọi lứa tuổi heo Tuy nhiên, bệnh thường gặp và gây nguy hiểm ở giai đoạn heo con theo mẹ, heo vừa mới cai sữa hoặc tách bầy Các biểu hiện của tiêu chảy:

Tính đàn hồi của da kém, khô niêm mạc hầu họng Huyết áp hạ

Nước tiểu có ít Cl- và Na+

Giảm thể tích huyết tương

Máu đặc, huyết tương có hàm lượng Cl

và Na+ giảm, hàm lượng urea tăng

Tiêu chảy có 4 cơ chế chính, đó là: tiêu chảy do phân tiết, tiêu chảy do thẩm thấu, tiêu chảy do rối loạn vận động ruột và tiêu chảy do tổn thương niêm mạc ruột

Tiêu chảy do vi khuẩn E coli thường theo cơ chế phân tiết, phân nhiều và lỏng

(Buddle và Bolton, 1992) Thang thẩm thấu do sự tích tụ của Na+ và Cl- trong lòng ruột làm cho một lượng lớn nước di chuyển từ máu vào lòng ruột Phân đẳng trương (isotonic) so với huyết thanh và có khuynh hướng kiềm vì chứa nhiều bicarbonate (đây là một trong các cách giúp phân biệt với bệnh tiêu chảy do tiêu hóa/hấp thu

kém ở nhiễm trùng Rotavirus) Hậu quả là thú mất nước và toan huyết

2.2.2 Nguyên nhân gây tiêu chảy

Tiêu chảy là một hiện tượng bệnh lý liên quan đến rất nhiều yếu tố, có yếu tố là nguyên nhân nguyên phát, có yếu tố là nguyên nhân thứ phát Vì vậy phân biệt thật rõ ràng nguyên nhân gây tiêu chảy không giản đơn Đa số các nhà nghiên cứu trong và ngoài nước đề nghị phân chia các nguyên nhân gây tiêu chảy thành 3 nhóm chính như sau:

2.2.2.1 Điều kiện ngoại cảnh bất lợi

Chủ yếu do thời tiết khí hậu quá nóng, quá lạnh hoặc ẩm ướt kéo dài

2.2.2.2 Nuôi dưỡng không đúng kỹ thuật

Thiếu sót đầu tiên là do heo con không được cho bú sữa đầu Thức ăn, nước uống kém phẩm chất như dơ bẩn, ôi mốc, nhiễm trùng, thiếu vitamin (nhất là vitamin A, D) hoặc thiếu chất khoáng (nhất là Fe)

2.2.2.3 Vi sinh vật

Vi khuẩn: gồm 2 nhóm, đó là vi khuẩn khu trú thường xuyên trong ống tiêu hóa

(Enterobacteriaceae) như E coli, Salmonella, Klebsiella, Proteus… và nhóm vi

khuẩn tạp nhiễm cùng với thức ăn, nước uống vào đường tiêu hóa như

Staphylococci, Streptococci… loạn khuẩn đường ruột là nguyên nhân chủ yếu gây

bệnh ở đường tiêu hóa

Virus: người ta đã chứng minh được virus là một tác nhân gây tiêu chảy, thường

thấy là Rotavirus, Enterovirus, Coronavirus…

Ký sinh trùng: tác động thông qua việc tranh chấp chất dinh dưỡng với ký chủ, tiết độc tố, làm giảm sức đề kháng và làm tổn thương niêm mạc đường tiêu hóa, tạo điều kiện cho các tác nhân khác gây bệnh

Bảng 2.1 Tỷ lệ các vi sinh vật gây tiêu chảy trên heo (Bergeland, 1980)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Escherichia coli Isospora

Rotavirus T.G.E virus Enterovirus Parvovirus

Coronavirus (khác T.G.E) Calicivirus

Salmonella

Treponema hyodysenteriae Không chẩn đoán được

45,6 23,0 20,9 11,2 2,0 0,7 0,5 0,2 0,1 0,1 14,0

Qua đó, chúng ta thấy rằng vi khuẩn E coli đóng một vai trò quan trọng trong

các nguyên nhân gây tiêu chảy trên heo

2.3 Sự miễn dịch

2.3.1 Khái niệm miễn dịch

Miễn dịch là khả năng đề kháng của sinh vật chống lại một sinh vật khác và các chất mang trên bản thân chúng những dấu hiệu thông tin di truyền ngoại lai Tính

miễn dịch được hình thành trong quá trình tiến hóa của sinh vật (Petrov, 1978)

2.3.2 Phân loại miễn dịch

Hệ thống miễn dịch trong cơ thể sinh vật được chia làm hai nhóm: miễn dịch tự nhiên (miễn dịch không đặc hiệu) và miễn dịch thu được (miễn dịch đặc hiệu)

2.3.2.1 Miễn dịch không đặc hiệu

Là phương tiện bảo vệ của cơ thể không nhằm chống lại một loại kháng nguyên cụ thể nào mà chống lại nhiều tác nhân có tính chất khác nhau.

Miễn dịch

Miễn dịch không đặc hiệu

Miễn dịch đặc hiệu

Miễn dịch thụ động

Miễn dịch chủ động Miễn dịch thụ

động tự nhiên

Miễn dịch thụ động nhân tạo

Miễn dịch chủ động tự nhiên

Miễn dịch chủ động nhân tạo

Miễn dịch không đặc hiệu được qui định bởi đặc tính của giống, loài sinh vật Loại miễn dịch này đã có sẵn khi cơ thể được sinh ra và nó được di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác

Hệ thống miễn dịch này bao gồm 2 quá trình: quá trình miễn dịch tế bào và quá trình miễn dịch dịch thể

 Quá trình miễn dịch tế bào gồm: da, niêm mạc, hệ bạch huyết, nội tạng (gan, lách), thực bào

 Quá trình miễn dịch dịch thể gồm: kháng thể tự nhiên, bổ thể, interferon, enzyme lysozyme

Là sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể khi xuất hiện kháng nguyên Kháng nguyên này kích thích cơ thể tạo ra miễn dịch chống lại chính kháng nguyên Miễn dịch đặc hiệu là quá trình phát sinh và phát triển sự hoạt động của 2 nhóm tế bào lympho T và lympho B với sự phối hợp của đại thực bào

Miễn dịch thu được hay còn gọi là miễn dịch đặc hiệu là loại miễn dịch mà cơ thể tiếp thu được trong quá trình sống

Miễn dịch thu được chia ra làm hai loại: miễn dịch chủ động và miễn dịch thụ động

i Miễn dịch thụ động là loại miễn dịch mà cơ thể tiếp thu từ bên ngoài Nếu

quá trình tiếp thu miễn dịch xảy ra hoàn toàn tự nhiên như trong trường hợp thú con tiếp nhận kháng thể từ thú mẹ qua sữa đầu, hoặc gia cầm con tiếp nhận kháng thể từ gia cầm mẹ qua lòng đỏ trứng, được gọi là miễn dịch thụ động tự nhiên Còn miễn dịch thụ động có được do con người tạo ra như trường hợp tiêm huyết thanh để phòng và trị bệnh, được gọi là miễn dịch thụ động nhân tạo

ii Miễn dịch chủ động là loại miễn dịch mà tự bản thân cơ thể sinh vật tạo ra

khi cơ thể tiếp xúc với kháng nguyên Nếu miễn dịch chủ động mà trong đó có sự tham gia của con người như trường hợp chủng ngừa vaccine để phòng bệnh, được là miễn dịch chủ động nhân tạo Miễn dịch chủ động do cơ thể tiếp thu tự nhiên trong môi trường sống được gọi là miễn dịch chủ động tự nhiên Trường hợp này xảy ra khi thú qua khỏi sau đợt dịch bệnh, có khả năng không mắc lại bệnh đó khi bị tái nhiễm

Cũng như trong hệ thống miễn dịch tự nhiên, miễn dịch thu được cũng có miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào:

Miễn dịch tế bào (còn gọi là quá trình miễn dịch trung gian tế bào): được

biểu thị bởi sự hoạt hóa lympho bào T thuộc đặc hiệu của kháng nguyên Như vậy trong miễn dịch trung gian tế bào, lympho bào T đóng vai trò quan trọng

Miễn dịch dịch thể: kháng thể chủ yếu có trong huyết thanh Kháng thể

đặc hiệu cũng có cấu tạo giống như kháng thể không đặc hiệu và nằm trong 5 lớp A, D, G, E, M nhưng nó chỉ được tạo ra khi có kháng nguyên đặc hiệu tác động và được sự hỗ trợ của lympho bào T Lympho bào B chịu trách nhiệm trong miễn dịch dịch thể

2.3.3 Khái niệm về kháng nguyên (antigen) và kháng thể (antibody)

2.3.3.1 Kháng nguyên (antigen)

Là những protein lạ mà khi vào cơ thể sẽ kích thích cơ thể tạo ra kháng thể kết hợp đặc hiệu với nó Tất cả kháng nguyên đều có hai tính chất: tính sinh miễn dịch của kháng nguyên và tính đặc hiệu của kháng nguyên

i Tính sinh miễn dịch của kháng nguyên: là khả năng tạo sự miễn dịch

của cơ thể đối với kháng nguyên Tính chất này phụ thuộc các điều kiện sau :

 Bản chất hoá học của kháng nguyên: thường là những protein lạ đối với cơ thể vật chủ Các kháng nguyên bản chất hoá học là protein thường là kháng nguyên hoàn toàn và mạnh vì nó kích thích cơ thể tạo ra nhiều kháng

thể Các kháng nguyên bản chất hoá học là lipid, polysaccharide là kháng nguyên yếu, có loại là “bán kháng nguyên” vì nó kích thích yếu hoặc không kích thích cơ thể sinh kháng thể

 Kích thước phân tử của kháng nguyên: nhìn chung kháng nguyên càng có kích thước lớn và cấu trúc càng phức tạp thì tính sinh miễn dịch càng cao Một phân tử kháng nguyên càng lớn thì nó càng có cấu trúc phức tạp và có nhiều quyết định kháng nguyên Đó là một trong các yếu tố đảm bảo tính sinh miễn dịch cao

 Đường xâm nhập của kháng nguyên: thường kháng nguyên xâm nhập qua đường tiêu hoá có tính sinh miễn dịch yếu hơn kháng nguyên xâm nhập qua da

 Liều lượng kháng nguyên: nếu lượng kháng nguyên quá ít thì không đủ gây đáp ứng miễn dịch Ngược lại, nếu lượng kháng nguyên nhiều quá sẽ gây ức chế miễn dịch

 Quy trình gây miễn dịch có ảnh hưởng lớn tới tính sinh miễn dịch của phân tử kháng nguyên: mỗi loại kháng nguyên thích hợp với một loại quy trình gây miễn dịch riêng

 Cá nhân được miễn dịch: các cơ thể khác nhau có sự đề kháng khác nhau với mầm bệnh (kháng nguyên) Thường cơ thể khoẻ, được chích vaccine có khả năng miễn dịch tốt hơn cơ thể yếu, không được chích vaccine

 Hiệu ứng cộng lực kháng nguyên, phản ứng thứ phát (phản ứng nhớ), chất bổ trợ

ii Tính đặc hiệu của kháng nguyên: là sự phản ứng đặc hiệu của kháng

nguyên với kháng thể mà kháng nguyên kích thích cơ thể sản sinh ra Tính đặc hiệu của kháng nguyên phụ thuộc vào các điều kiện sau:

 Cấu trúc phân tử protein của kháng nguyên: các monopolypeptide không có tính kháng nguyên vì ở đây chuỗi peptide được lặp lại nhiều lần với

cùng một loại acid amin, do đó không chứa yếu tố lạ đặc trưng Các dipolypeptide và đặc biệt là tripolypeptide có tính kháng nguyên mạnh

 Các nhóm quyết định kháng nguyên (epitope): nhóm quyết định kháng nguyên là những điểm thụ thể nằm trên bề mặt kháng nguyên mà tại nơi đó kháng thể gắn vào Trên mỗi phân tử kháng nguyên có khoảng 10.000 nhóm quyết định kháng nguyên

 Trọng lượng phân tử của kháng nguyên: phân tử kháng nguyên càng lớn thì trên đó có nhiều “nhóm quyết định kháng nguyên”, chúng là những kháng nguyên mạnh Bán kháng nguyên có trọng lượng phân tử nhỏ do đó có ít nhóm quyết định kháng nguyên

Các chuỗi H và L nối với nhau bằng cầu nối disulfide (-S-S-) Chuỗi nặng gồm 4 đoạn polypeptide và chuỗi nhẹ gồm 2 đoạn polypeptide, mỗi đoạn có 110 - 120 acid amin Trên chuỗi nặng và chuỗi nhẹ có vùng Fab và Fv kết hợp được với kháng nguyên, vùng Fc mang tính kết hợp bổ thể Sự khác nhau giữa các loại kháng thể nằm ở vùng siêu biến V còn vùng hằng định C thì giống nhau Nhiều kháng nguyên có nhiều yếu tố xác định và do đó phải có 1 bộ kháng thể tương ứng mới tương tác được với kháng nguyên ấy Vì vậy, số lượng kháng thể hết sức lớn

Phân loại kháng thể: tất cả các kháng thể được xếp vào 5 lớp Ig Mỗi lớp phân

biệt với các lớp khác nhờ những trình tự acid amine đặc trưng ở vùng hằng định nằm trên chuỗi nặng tạo nên những đặc tính về cấu trúc và chức năng riêng cho mỗi lớp

i IgG: có chuỗi nặng là gamma (γ) Là thành phần cơ bản nhất trong huyết

thanh Chiếm khoảng 80% tổng số Ig của huyết tương bình thường IgG là kháng thể duy nhất truyền từ mẹ sang nhau thai (kháng thể tự nhiên) Khi trẻ lớn lên dần, lượng kháng thể này giảm dần Đến khi trưởng thành IgG lại gia tăng và đặc biệt tăng cao khi cơ thể bị nhiễm khuẩn

Trong hoạt động đáp ứng miễn dịch, các IgG có 4 chức năng: trung hòa độc tố, ngưng kết tế bào vi khuẩn và tham gia vào phản ứng Arthus, phối hợp với bổ thể làm tan vi khuẩn, và opsonin hóa.

ii IgM: có chuỗi nặng là muy (μ), là globulin miễn dịch lớn nhất và là lớp miễn

dịch chính được tổng hợp ở bào thai bảo vệ bào thai khỏi bị nhiễm khuẩn Trong huyết thanh người bình thường, IgM có nồng độ khoảng 125mg/100ml, đứng thứ hai sau IgG Khi cơ thể bị kích thích bởi kháng nguyên, IgM là loại kháng thể xuất hiện đầu tiên, tiếp sau đó IgG xuất hiện và thay thế IgM Thường sau khi IgG xuất hiện thì IgM sẽ tiêu biến, nhưng cũng có trường hợp IgM tồn tại rất lâu (ví dụ kháng thể IgM chống lại kháng nguyên O của vi

khuẩn Salmonella)

Chức năng sinh học của IgM: trung hòa ngoại độc tố, ngưng kết vi khuẩn, phối hợp với bổ thể làm tan vi khuẩn, hấp thụ lên bề mặt lympho B để tạo nên điểm thụ thể dành cho kháng nguyên tương ứng, ảnh hưởng đến hoạt động của độc tố bằng cách kết hợp với quyết định kháng nguyên nằm trong hoặc gần vị trí hoạt động của độc tố, do đó nó phong bế phản ứng của độc tố

iii IgA: có chuỗi nặng là alpha (α), IgA có trong nước bọt, sữa non, dịch ruột,

đặc biệt là trong huyết thanh và dịch xuất tại chỗ IgA giữ vai trò chủ yếu

trong miễn dịch tại chỗ chống lại các bệnh đường tiêu hoá hay hô hấp

iv IgD: chuỗi nặng là delta (δ), có trong máu với hàm lượng thấp 30mg/100ml

Chúng dễ dàng bị biến tính bởi nhiệt và bị phân giải bởi enzyme Có vai trò trong miễn dịch tại chỗ, thường xuất hiện nhiều trong bệnh nhân có bệnh mãn tính Tốc độ tổng hợp của IgD kém hơn IgG khoảng 100 lần nhưng dị hóa lại

nhanh hơn hàng chục lần IgD tăng trong các trường hợp nhiễm khuẩn mãn tính, nhưng không đặc hiệu cho loài IgD có trong kháng thể kháng tuyến giáp trạng, kháng insulin, kháng penicillin IgD không kết hợp với bổ thể, không

gây phản vệ thụ động trên da chuột lang, không đi qua nhau thai

Chức năng sinh học của IgD còn được biết rất ít, có lẽ IgD có vai trò như thụ thể cho kháng nguyên vì nó gắn trên bề mặt tế bào lympho B để tạo điểm

thụ thể giữa lympho B với kháng nguyên tương ứng

v IgE: có chuỗi nặng là epsilon (ε) IgE có nồng độ trong huyết thanh thấp

0,025mg/100ml, dễ biến tính khi xử lý bằng nhiệt ở 560C/30 phút IgE có khả năng hoạt hóa đại thực bào và bạch cầu ái toan, tăng cường thực bào hay tăng cường độc tính của bạch cầu trung tính đối với giun sán IgE có ít trong huyết

thanh và dễ bị phân huỷ

IgE đóng vai trò trung gian trong phản ứng quá mẫn, trực tiếp gây ra những triệu chứng như sốt mùa hè, hen suyễn, sốt phát ban, và shock quá mẫn

 Sự hình thành kháng thể: nhờ phương pháp đánh dấu kháng thể bằng đồng vị

phóng xạ hay chất huỳnh quang, người ta thấy các kháng thể được tổng hợp ở tủy đỏ và ở các nang của lách, ở các nang và dây tuỷ của các hạch bạch huyết, ở tuỷ xương, mảng Peyer và những tổ chức lympho khắp cơ thể (phổi, gan…) Một trong những tổ chức quan trọng nhất tham gia vào việc tổng hợp kháng thể là “trung tâm mầm” của lách và hạch bạch huyết Trung tâm mầm xuất phát từ những “clone” là những tế bào gốc ở tuỷ xương Ban đầu khi chưa tiếp xúc với kháng nguyên, “clone” ở trạng thái “ngủ”, khi tiếp xúc với kháng nguyên, “clone” bị kích thích và hoạt hoá để tạo ra những tế bào đáp ứng miễn dịch (các lympho bào B và T) Lympho bào B sẽ sản sinh ra dòng lympho B nhớ và tương bào Tương bào trực tiếp tham gia tạo kháng thể Như vậy, tế bào B và “con cháu” của chúng hoạt động theo từng “clone”: chúng biệt hoá, tăng sinh và trưởng thành theo sự đáp ứng miễn dịch

Trong các tình thế khác nhau, mức độ khác nhau, sự tổng hợp kháng thể phụ thuộc vào tế bào T: như sự tổng hợp IgE, IgG phụ thuộc rất nhiều vào tế bào T

(Ishisaka Bankhurst và cộng sự, 1973) Còn các kháng thể IgM, IgA ít hoặc không phụ thuộc vào tế bào T

Kháng thể được tổng hợp trong các polyribosome trong tương bào Các chuỗi nặng, chuỗi nhẹ của kháng thể được tổng hợp riêng sau đó chúng kết hợp với nhau ngay trong polyribosome tạo ra 2 chuỗi nặng và 2 chuỗi nhẹ Ngay sau khi các chuỗi globulin miễn dịch đã hình thành xong thì các đường hydratecacbon sẽ liên kết với nhau và kháng thể ra khỏi tương bào

2.4 Auto-vaccine

2.4.1 Định nghĩa vaccine

Vaccine là chế phẩm sinh học chứa kháng nguyên có khả năng tạo cho cơ thể đáp ứng miễn dịch, được dùng với mục đích phòng bệnh hoặc với mục đích khác

2.4.2 Phân loại vaccine

2.4.2.1 Vaccine giảm độc lực (attenuated)

Sử dụng virus hoặc vi khuẩn sống đã được xử lý để giảm tính độc Ví dụ: vaccine sabin chống bại liệt, vaccine sởi, vaccine quai bị

2.4.2.2 Vaccine bất hoạt (inactivated)

Vi khuẩn hay virus được giết chết bằng phương pháp vật lý (nhiệt độ cao, bức xạ, tia cực tím…) hay hoá học (formaldehyde, ethylen imine…) Ví dụ: vaccine salk chống bại liệt dạng tiêm, vaccine dại Vaccine bất hoạt an toàn hơn vaccine sống nhưng có hiệu lực miễn dịch yếu hơn Người ta thường trộn với chất bổ trợ nhằm tăng sức miễn dịch và kéo dài thời gian miễn dịch

2.4.2.3 Các "toxoid”

Là các hợp chất độc bất hoạt được trích từ các vi sinh vật (trong trường hợp chính các độc chất này là phương tiện gây bệnh của vi sinh vật) Chúng được tiêm cho vật chủ khác (như ngựa) để tạo kháng thể, rồi chiết lấy kháng thể này để chữa

bệnh Ví dụ: các huyết thanh ngừa uốn ván và bạch hầu

2.4.2.4 Vaccine từng phần hay vaccine dưới đơn vị (subunit)

i Vaccine tái tổ hợp: gen mã hoá kháng nguyên được chuyển nạp vào genome

của tế bào nấm men, tế bào vi khuẩn hoặc tế bào động vật thích hợp để tạo ra nhiều kháng nguyên tinh khiết nhờ phương thức nhân bản Quá trình chuyển nạp gen mã hoá kháng nguyên được thực hiện qua yếu tố trung gian plasmid

ii Sử dụng protein tinh sạch hay glycoprotein của virus

2.4.2.5 Một số loại vaccine mới đang nghiên cứu

i Vaccine DNA trần (naked DNA vaccine): gen mã hoá cho một kháng nguyên

của tác nhân gây bệnh cũng có thể tách rời rồi đưa vào vật chủ thông qua vectơ là plasmid hay virus

ii Vaccine peptide: trên đó có epitope bảo vệ Peptid có thể liên kết với một

protein tải để tăng tính phụ thuộc tế bào lympho T

iii Vaccine liên kết: chất polysaccharid liên kết với protein có phân tử lượng cao

để tiếp cận dễ dàng với tế bào lympho T Ví dụ: virosomes …

iv Vaccine khảm hay vaccine lai ghép (hydrid vaccine): là kết quả của sự kết

hợp kĩ thuật tái tổ hợp và kĩ thuật di truyền sử dụng một sinh thể quen biết để hạn chế hiện tượng "phản tác dụng" Chủng vi sinh vật vaccine được cấy ghép gen mã hoá kháng nguyên lấy từ vi sinh vật gây bệnh Vi sinh vật được cấy ghép là vi sinh vật vectơ

Ví dụ: dùng virus Vaccinia mang một số yếu tố của virus viêm gan B hay

virus dại Vaccine lai ghép một lúc kích thích cơ thể tạo ra hai đáp ứng miễn dịch là đáp ứng bảo vệ đối với vi sinh vật gây bệnh (virus viêm gan B hay

virus dại) và đáp ứng đối với vi sinh vật vectơ (Vaccinia)

2.4.3 Định nghĩa auto-vaccine

Auto-vaccine là vaccine mang mầm bệnh (vi khuẩn hoặc virus) của vật chủ hay vùng dịch nào đó và được sử dụng để chủng ngừa cho chính vật chủ hay vùng dịch đó

2.4.4 Quy trình sản xuất auto-vaccine

Việc đầu tiên trong quy trình sản xuất auto-vaccine là cần phân lập mầm bệnh (vi khuẩn hoặc virus) từ mô bệnh hoặc dịch chiết của vật chủ mang bệnh

Tiếp theo, mầm bệnh sẽ được làm chết hoặc làm yếu bởi các tác nhân hóa học, nhiệt, điện hay phóng xạ…

Sau cùng kháng nguyên được tinh sạch và bổ sung một số chất cần thiết để thành phẩm auto-vaccine

2.4.5 Ưu điểm và nhược điểm của việc sản xuất, sử dụng vaccine

Có tính đặc hiệu cao vì tạo miễn dịch chuyên biệt

Phương pháp hiệu quả chống lại vi khuẩn có tính kháng rộng

Phương pháp phòng ngừa hữu hiệu đối với virus biến chủng nhanh hay vi khuẩn kháng kháng sinh nhanh

Có thể được sử dụng để phòng ngừa những tác nhân gây bệnh ở dạng phân tử (như prion…)

2.4.5.2 Nhược điểm

Quy trình sản xuất auto-vaccine rất khó khăn vì cần phải tinh sạch kháng nguyên

Hạn chế trong việc sử dụng rộng rãi, chỉ được sử dụng tại nơi mà mầm bệnh được phân lập để sản xuất auto-vaccine

Chi phí sản xuất cao, giá thành phẩm cao

Khó để thương mại hóa auto-vaccine thành phẩm

2.5 Chất bổ trợ

Ngày nay các hãng sản xuất vaccine luôn bổ sung chất bổ trợ vào sản phẩm của mình Sử dụng chất bổ trợ nào để đem lại hiệu quả cho vaccine là bí quyết riêng của mỗi công ty Vậy chất bổ trợ là gì? Chúng có những tác dụng gì để nâng cao hiệu quả của vaccine?

2.5.1 Định nghĩa chất bổ trợ

Chất bổ trợ là một tác nhân được bổ sung vào vaccine có tác dụng tăng cường kích thích hệ miễn dịch, tạo nên sự đáp ứng với vaccine mạnh và dài hơn, qua đó nâng cao hiệu quả của vaccine

Một trong những chất bổ trợ được sử dụng nhiều và sớm trong vaccine, đặc biệt là vaccine cho người, là muối nhôm Tuy nhiên những nghiên cứu gần đây cho thấy chất bổ trợ nhôm là nguyên nhân gây chết các neuron vận động sau khi tiêm

Một số chất bổ trợ được sử dụng trong vaccine thú y và tác dụng của chúng:  Muối nhôm: kéo dài sự biểu hiện của kháng nguyên

 Yếu tố bề mặt (saponin, lysolecithin…): hoạt hóa sự biểu hiện của kháng nguyên

 Nhũ dầu: kéo dài sự biểu hiện kháng nguyên

 Thành phần cấu tạo của vi khuẩn: hoạt hóa đại thực bào và tế bào lympho  Phức hợp carbonhydrate: hoạt hóa đại thực bào

2.5.2 Tác dụng của chất bổ trợ

 Chất bổ trợ giúp kháng nguyên di chuyển đến các hạch lympho, tại đây chúng được các tế bào lympho T nhận diện Nhờ vậy mà có nhiều tế bào lympho T được hoạt hóa để tham gia tạo kháng thể

 Chất bổ trợ như một tác nhân bảo vệ vật lý giúp kháng nguyên kéo dài sự biểu hiện bên trong cơ thể được tiêm vaccine Qua đó hệ miễn dịch có thêm thời gian để tăng cường điều chỉnh tế bào lympho T và B

 Chất bổ trợ giúp tăng sức chịu đựng tại nơi tiêm, giải tỏa những phản ứng phụ nguy hiểm

 Chất bổ trợ không chỉ tăng cường đáp ứng miễn dịch đặc hiệu mà còn tăng cường đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu

2.5.3 Chất bổ trợ MONTANIDE (chất bổ trợ được sử dụng trong đề tài này)

Montanide được sản xuất bởi công ty SEPPIC (trụ sở chính công ty tại Paris, nước Pháp), là chất bổ trợ tăng cường tính hiệu quả và sự ổn định của vaccine, ngoài ra nó còn làm giảm những phản ứng phụ trên cơ thể được tiêm vaccine và rất dễ sử dụng

Montanide được sử dụng rộng rãi cho các vaccine thương phẩm trên nhiều loài như heo, bò, cá… và chỉ được sử dụng trong thú y

 Không tự bốc cháy, không tự nổ

 Không hòa tan trong nước, hòa tan trong các dung môi  Lưu trữ: cần bảo quản ở nhiệt độ lạnh

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

3.1 Thời gian và địa điểm

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Heo con từ 14 ngày tuổi đến 60 ngày tuổi chưa tiêm vaccine phòng tiêu chảy do

E coli hoặc chưa tiến hành điều trị kháng sinh

Số lượng : 16 bầy heo con

3.2.2 Vật liệu và thiết bị

Mẫu phân được lấy từ những heo trong trại có biểu hiện tiêu chảy

54 mẫu huyết thanh heo con thí nghiệm

Nước muối sinh lý

Môi trường phân lập và thử sinh hóa vi khuẩn E coli: EMB, KIA, TSA, TSB,

môi trường và thuốc thử các phản ứng IMViC

Bộ kít huyết thanh chuẩn để định type đối với vi khuẩn E coli (F4, F5, F6)

Chất bổ trợ Montanide

Dung dịch formol 0,3% dùng để bất hoạt vi khuẩn

Tăm bông tiệt trùng, que cấy, ống nghiệm, đĩa petri, kính hiển vi, tủ ấm, tủ lạnh,

nhiệt kế, cylindre, máy hấp autoclave

3.3 Nội dung

- Sản xuất auto-vaccine trong phòng thí nghiệm

- Đánh giá hiệu quả của auto-vaccine trên heo con thí nghiệm

3.4 Phương pháp tiến hành

3.4.1 Phương pháp lấy mẫu

Chọn những heo có dấu hiệu tiêu chảy, chưa sử dụng kháng sinh Đầu tiên, dùng bông gòn thấm cồn để sát trùng hậu môn, tiếp theo sử dụng tampon tiệt trùng đưa vào trong trực tràng khoảng 3cm, ngoáy một đến hai vòng rồi cắm sâu tampon vào giữa ống nghiệm có chứa nước muối sinh lý, đậy nút bông vào cẩn thận

Mẫu được bảo quản ở 0-4oC trong thùng đá sau đó đem về phòng xét nghiệm để phân lập

Hình 3.1 Lấy mẫu phân tiêu chảy ở heo con

3.4.2 Nghiên cứu vi sinh vật

3.4.2.1 Nuôi cấy phân lập

Sử dụng môi trường chuyên biệt EMB (Eosin Methylen Blue)

Thực hiện phân lập vi khuẩn trực tiếp từ mẫu sang môi trường chuyên biệt EMB trên đĩa petri bằng que cấy vòng Sau đó đem ủ đĩa EMB đã được cấy vi khuẩn trong tủ ấm ở nhiệt độ 37oC, 24 giờ

Vi khuẩn E coli trong môi trường EMB cho khuẩn lạc đường kính khoảng

1-2mm, màu tím ánh kim, có vùng sậm đục ở giữa khuẩn lạc

Để bắt E coli, chúng tôi chỉ chọn khuẩn lạc từ những đĩa có trên 2/3 số khuẩn lạc nghi ngờ là E coli

3.4.2.2 Kiểm tra sinh hóa

Từ những khuẩn lạc đặc trưng của E coli trên môi trường EMB (hơi dẹt, bóng,

nhỏ, tím ánh kim, không nhô cao lên thạch), chúng tôi sẽ chọn 3 - 5 khuẩn lạc để cấy chuyển sang môi trường KIA (Kliger Iron Agar), ủ ở nhiệt độ 37oC trong vòng

24 giờ Vi khuẩn E coli lên men đường glucose và lactose có sinh hơi

Hình 3.2 Phân lập E coli trên môi trường EMB

Chỉ chọn khuẩn lạc của mẫu A

Không chọn khuẩn lạc của mẫu B

Khuẩn lạc nghi ngờ E coli