Clostridium perfringens

Báo cáo thảo luận Clotridium perfringens Clostridium perfringens I GIỚI THIỆU: Clostridium perfringens có tên Closdtridium welchii, Welchia perfringens, Bacillus perfringens, Bacillus phlegmonis emphyse matosae, Bacillus aerogens capsulatus Cl.perfringens thuộc nhóm vi khuẩn gây hoại thư sinh Đây nhóm vi khuẩn kỵ khí, sinh bào tử, giống mặt hình thể tính chất gây nhiễm khuẩn nhiễm độc vết thương Nhóm vi khuẩn gây viêm ruột thừa, viêm gan mật, viêm ruột, viêm màng bụng, viêm chấn thương não tủy,do sảy thai nhiễm độc thức ăn Đứng mặt vi khuẩn học, nhóm vi khuẩn thuộc lớp Sporulales, giống Clostridium họ Clostridiaceae Năm 1955 dựa sở trực khuẩn lông (khác với vi khuẩn gây hoại thư sinh khác) đề nghị xếp thành giống riêng Welchia perfringens hay Clostridium perfringens Dựa vào khả sinh độc tố , người ta chia giống thành typ đánh dấu chữ A,B,C,D,E,F Khả gây bệnh:  Ngộ độc thực phẩm: Thường gặp phổ biến sử dụng thực phẩm với thịt, thịt gia cầm sản phẩm chế biến từ thịt, chủ yếu với thực phẩm nấu chín để nguội ăn ( thực phẩm chế biến sẵn) Clostridium Perfringens thường cư trú hệ thống tiêu hóa người động vật Khoảng 25% quần thể cư dân hàng ngày thải Clostridium Perfringens theo phân chúng sống lâu môi trường thiên nhiên, đất& bụi, kết thành bào tử, gây ô nhiễm chủ yếu thịt gia cầm ô nhiễm chéo khu vực chế biến, sơ chế thực phẩm Triệu chứng: đau bụng,tiêu chảy, nôn mửa Thời gian ủ bệnh: 9-15h sau ăn thực phẩm bị vi khuẩn Cl.perfringens sinh sản độc tố bên động vật chủ  Hoại thư sinh : Hoại thư sinh tượng gây hoại tử cho mô bị nhiễm, gây biến chứng vết thương Triệu chứng:vết thương mưng mủ,bị hoại tử,khó thởø,nôn mửa,có thể tử vong Thời gian ủ bệnh:1-6 h Hình thái: Là loại trực khuẩn thẳng, hai đầu tròn, kích thước 0,8 -1,5 x 38m,kỵ khí tuyệt đối.Vi khuẩn bắt màu Gram dương , canh Trang Báo cáo thảo luận Clotridium perfringens khuẩn nuôi lâu bắt màu âm Sinh sản chủ yếu cách phân đôi tế bào Trong canh khuẩn non thấy vi khuẩn ngắn , mập , đứng riêng hay ghép thành song trực khuần , canh khuẩn già có hình dài , uốn cong hình sợi dài Vi khuẩn lông roi, không di động, hình thành giáp mô thể bệnh, có khả hình thành bào tử môi trường trung tính kiềm 3.Đặc điểm nuôi cấy : Môi trường nuôi cấy :yếm khí tuyệt đối Khoảng pH cho phép: 5.7-8.1 (pHopt = 7.6) Khoảng nhiệt độ cho phép:30 – 550C (Topt = 370C) Sự phát triển Cl.perfringens số môi trường nuôi cấy: - Trong canh thang gan cục: vi khuẩn phát triển làm đục -Trong nước thịt Mactin (Martin) có 2% glucoz : canh khuẩn đục sinh sản nhiều , hình thành cặn có sắc tố màu đen -Thạch máu glucoz : Hình thành khuẩn lạc hình tròn bầu dục , có vùng dung huyết xung quanh -Thạch Vây-ống (Veillon) Khuẩn lạc hình hạt đậu, vi khuẩn sinh sản nhiều làm nứt thạch -Gelatin : vi khuẩn hình thành khuẩn lạc có hình hạt đậu nhỏ, gelatin tan chảy chậm 4.Đặc tính hoá sinh: Chuyển hóa đường: Cl.perfringens thuỷ giải saccaride  (glucoza, levuloza, galactoza,mantoza,lactoza,saccaroza) tạo thành acetic acid,butyric rượu Thuỷ giải protein chuyển hoá không hoàn toàn  acid amin tạo mùi khó chịu cho sản phẩm : H2S, NH3 , CO2 , H2 Khử nitrat thành nitrit  5.Bào tử : Vào cuối thời kỳ sinh trưởng phát triển,khi điều kiện môi trường trở nên bất lợi cho tế bào sinh dưỡng bên tế bào hình thành thể nghỉ có dạng hình bầu dục hay hình cầu,gọi bào tử.Bào tử trạng thái sống ẩn không hình thức sinh sản Bào tử hình thành môi trường trung tính kiềm Bào tử to chiều ngang thân vi khuẩn thường nằm gần đầu Bào tử Trang Báo cáo thảo luận Clotridium perfringens II ĐỘC TỐ: Clostridium perfringens hình thành độc tố , loại độc tố thần kinh gây bại liệt co giật , độc tố dung huyết gây hoại tử làm chết Căn vào khả hình thành ngoại độc tố dung huyết gây hoại tử, cấu tạo kháng nguyên khả gây bệnh, người ta chia Cl.perfringens thành typ huyết sau: a Typ A: Typ A gây bệnh cho người ,thỉnh thoảng gây bệnh Enterotoxemia cho bê thỏ, có công thức kháng nguyên , , , k b.Typ B:: Typ B gây bệnh lỵ cho dê Welchia agni thấy bê, ngựa con, công thức kháng nguyên , , , , , k c Typ C: Typ C độc tố gây bệnh cho cừu lớn gọi bệnh ”Strike”, có công thức kháng nguyên , , , , , k d.Typ D: Typ D gaây cho cừu bệnh Enterotoxemia thấy vi khuẩn dê ngựa, công thức kháng nguyên , , , k e Typ E: Typ E gây bệnh lỵ cho bê có công thức có công thức kháng nguyên , , L, k,  f Typ F: Typ F gaây bệnh viêm ruốt hoại tử cho người, dê số loài gia súc khác, có công thức kháng nguyên , ,  Các typ vi khuẩn phân bố rộng rãi thiên nhiên,sống đất, phân rau, thức ăn đường tiêu hóa người gia súc, tổ chức thể bị tổn thương, sức đề kháng giảm, vi khuẩn phát triển gây bệnh Trong số có loại A gây bệnh cho người, loại khác gây bệnh cho động vật Độc tố A chất đơn mà bao gồm nhiều phân hoá tố khác nhau, đáng ý là:  toxin: phân hóa tố kiểu lecithinase, chúng phân giải lecithin, gây tan hồng cầu, hoại tử tổ chức phần mềm  toxin: độc tố quan trọng C perfringens Chúng phá hủy nhanh tổ chức đảm bảo môi trường kỵ khí oxy tự Chúng không phân giải lecithin có khả làm tan hồng cầu gây liệt chức phận tim  toxin: độc tố giống hyaluronidase có khả khuếch tán, làm hủy hoại tổ chức liên kết mô , ,  toxin: độc tố yếu, gây chết, có khả gây hoại tử tổ chức gây tan máu Độc tố C perfringens tác dụng formol 4%o 37oC ngày tạo thành giải độc tố Trang Báo cáo thảo luận Clotridium perfringens * Sự diện kháng nguyên typ : Ký A B C D E hiệu + + + + +  + +  + +  + +  + +  ++ + + +  Chú thích:  + + :có chủng + + + ++  +:có số chủng + ++  có - : không chủng ++ + Ngoài ,ở typ huyết có hình thành ngoại độc + + + + +  tố (enterotoxin) III PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA : Kỹ thuật phân tích kiểm tra vi sinh vật thực phẩm dựa số công đoạn sau: Chọn thu nhập mẫu vật chuyển đến phòng thí nghiệm phân tích vi sinh vật Xử lý mẫu , nghiền trộn hoà tan môi trường dịch treo (suspension) với tỷ lệ phù hợp Nuôi cấy phân lập vi sinh vật Đếm quần thể vi sinh vật Phát xác định tên giống (genus), loài (species) chủng nòi (strains) vi sinh vật ĐỊNH TÍNH:  Kiểm tra hình thái kính hiển vi: nhằm bước đầu có nhận định loại vi khuẩn gây bệnh dựa việc quan sát hình thái , khả hình thành bào tử , giáp mô , khả di động , xếp vi khuẩn , tính chất bắt màu Gram Tiêu làm từ bệnh phẩm từ canh khuẩn nuôi cấy vi khuẩn bệnh phẩm nghi ngờ  Kiểm nghiệm trực khuẩn yếm khí : làmột biện pháp cần thiết nhằm chẩn đoán xác định loại vi khuẩn yếm khí gây bệnh bệnh phẩm cần chẩn đoán Bệnh phẩm lấy để tiến hành làm tiêu thường mẩu thịt ung , tổ chức hoại tử , mủ dịch vết thương bệnh sống (đối với triệu chứng bệnh hoại thư sinh hơi),hay kiểm nghiệm thức ăn , thực phẩm dự trữ , đồ hộp , lạp xưởng , giăm (jambon).(đối với triệu chứng ngộ độc thực phẩm)  Kiểm nghiệm đặc tính sinh hoá : nhằm xác định xác loài vi khuẩn thông qua đăïc tính hoá sinh đặc trưng dựa vi sinh vật phân lập nghi ngờ Cl.perfringens Một số cách kiểm tra đặc tính sinh hoá: Trang Báo cáo thảo luận Clotridium perfringens Thử phản ứng lên men đường: Dùng thị màu Gô manh (Guomian) Lấy gạch men trắng có lỗ lõm, nhỏ – giọt thị nhỏ tiếp vào giọt canh khuẩn, trộn đều, đọc kết nếu: Kết dương tính có: -Màu đỏ vỏ lựu : pH = 4,6 -Màu hồng vỏ cua : pH = 5,0 -Màu hồng vàng : pH = 5,4 -Màu vàng rượu vang : pH = 5,8 Kết âm tính có màu lục : pH = 6,2 – 7,4 Thử phản ứng sinh H2S Dùng băng giấy axetat , thử môi trường nứơc thịt pepton yếm khí Kiểm tra khả làm đông sữa: Dùng sữa tươi, lấy hết kem, cho vào ống nghiệm – 8ml, hấp 1100C 30 phút, cấy vi khuẩn vào, nuôi điều kiện yếm khí Ngoài cần thử phản ứng sinh hoá khác phản ứng khử nitrat, khả tác động gelatin, huyết đông, anbumin, óc … Từ kết thử phản ứng sinh hoá loại vi khuẩn yếm khí có bệnh phẩm Lactoz Smalixin H2S TanGelatin Nitrat Đỏ Indon Sữa CI perfingens Mantoz Loài vi khuẩn Gluc-oz Phản ứng sinh hoá học Cl.perfringens + + + - + + + - Đông nhanh 2.ĐỊNH LƯNG : phương pháp đếm Clostridium perfringens Có phương pháp để định lượng Cl.perfringens :  Nuôi cấy sâu ống nghiệm  Nuôi cấy thạch hộp Cả phương pháp thực nguyên tắc chung:  Nuôi cấy điều kiện thích hợp (yếm khí,T = 370C,pH trung tính )  Đem xác định đặc tính sinh hoá để xác nhận vi khuẩn điển hình  Đếm số khuẩn lạc điển hình để xác định số tế bào g mẫu ban đầu Trang Báo cáo thảo luận Clotridium perfringens  Phương pháp : nuôi cấy sâu Nguyên tắc : Nuôi cấy 10ml mẫu thử hay dung dịch pha loãng mẫu thử môi trường thạch chọn lọc (nuôi cấy sâu),xử lý nhiệt độ 800C 10ph sau cấy mẫu,làm lạnh đưa vào nuôi tủ ấm 370C 24-72h Thiết bị dụng cụ thủy tinh Tủ sấy Nồi hấp tiệt trùng Bình yếm khí Tủ ấm pH kế ng nghiệm,ống đong ,pipet chia độ Môi trường thuốc thử Môi trường Wilson Blair cải tiến: Cao thịt 5g Pepton 10g NaCl 5g Gluco 20g Nước cất 1000ml Thạch 15g Đun sôi để hoà tan hoàn toàn thành phần Phân phối vào ống nghiệm 20x220mm, ống 20ml môi trường Thanh trùng 121 0C 15ph Trước sử dụng đem đun chảy,bằng thao tác vô trùng thêm ống 2ml dung dịch Na2S2O3 20% giọt dung dịch phèn sắt amoni 5% NH4Fe (SO4)2.12H2O Môi trường SPS : Pepton (từ casein) 15g Cao men 10g Xirat saét III 0.5g Na2SO3 0.5g Polymyxin B sunphate 0.01g Sulphadiazin natri 0.12g Thạch 14g Nước cất 1000ml pH cuối môi trường 7+0.1 Các thành phần đun tới sôi,khuấy cho tan hết Phân phối vào ống nghiệm trùng 121 0C 15ph Môi trường nitrat di động: Pepton 5g Chất chiết thòt 3g Galacto 5g Glycerol 5g KNO3 1g Natri hydrophotphat 2.5g Thạch 5g Nước 1000ml Trang Báo cáo thảo luận Clotridium perfringens Hoà tan thành phần nước đun sôi.Điều chỉnh pH cho say tiệt trùng ,môi trường có pH khoảng 7.3.Phân phối môi trường vào ống nghiệm định lượng ,mỗi ống 10ml.Hấp 1210C 15ph Bảo quản môi trường nhiệt độ 4-6 0C thời gian tối đa tháng Môi trường gelatin-lacto: Tryptose (hay pancreatic casein) 15g Chất chiết men 10g Lacto 10g Gelantin 120g Đỏ phenol 0.05g Nước 1000ml Hoà tan thành phần nứơc trừ lacto đỏ phenol,chỉnh pH cho sau tiệt trùng pH=7.5 Thêm lacto đỏ phenol vào Phân phối vào ống nghiệm, ống 10ml, hấp 1210C 15ph Bảo quản môi trường 40C thời gian tối đa tuần Thuốc thử phát Nitrit:  Dung dịch axit-5-amino-2 naphtalene Sunfonic (5-2 ANSA): Hoàø tan 0.1 g 5-2 ANSA 100ml dung dịch axit axetic 15% thể tích Lọc qua giấy lọc Bảo quản lọ màu nâu,nút kín 40C  Dung dịch axit Sunfanilic: hoà tan 0.4 g axit Sunfanilic 100 ml dung dịch axit axetic 15% thể tích Lọc qua giấy lọc Bảo quản lọ nâu kín 40C  Pha chế thuốc thử hoàn chỉnh: trộn thể tích dung dịch trứơc dùng Cách làm Chuẩn bị đồng mẫu thực phẩm Pha loãng Nuôi cấy : Cho 10ml dịch mẫu thử dịch pha loãng vào ống môi trường Wilson Blair SPS (đã đun chảy để nguội đến 450C), lắc tròn ống để trộn đầu mẫu môi trường Đặt ống cấy mẫu vào bể điều nhiệt đun cách thuỷ 800C thời gian 10ph,lấy làm lạnh vòi nước chảy tủ lạnh.Khi thạch đông,đưa ống mẫu vào nuôi tủ ấm 370C 24-72h Sau 24h, lấy đọc kết sơ bộ: Clostridium perfringens tạo nên khuẩn lạc tròn, đen(khuẩn lạc Clostridium có màu đen phản ứng ion sulphide (S 2- ) ion sắt (Fe2+) có môi trường), có đường kính khoảng 1mm trở lên Nếu để lâu, khuẩn lạc lớn (đường kính-6mm), xuất vết nứt hay bọt khí cột thạch tượng sinh Xác nhận tính sinh hoá: Trang Báo cáo thảo luận Clotridium perfringens - Bằng môi trường Nitrat di động:Cấy sâu khuẩn lạc vào môi trường Nitrat di động.Nuôi điều kiện yếm khí 37 0C 24h Kiểm tra ống môi trường Nitrat di động để xem dạng sinh trưởng dọc theo đường cấy sâu.Sự sinh trưởng khuếch tán vào môi trường từ vết cấy sâu thể rõ tính di động vi sinh vật nuôi cấy Thử nghiệm có mặt nitrit cách thêm 0.5ml thuốc thử phát nitrit vào ống môi trường nitrat di động (thực thao tác tủ hút).Sự hình thành màu đỏ xác nhận phản ứng khử nitrat thành nitrit Nếu 15ph,màu đỏ không hình thành thêm lượng nhỏ bột kẽm.Để yên 10ph,nếu màu đỏ hình thành sau thêm bột kẽm phản ứng khử nitrat thành nitrit - Bằng môi trường gelatin-lacto: Cấy khuẩn lạc vào môi trường gelatin-lacto Nuôi dưỡng điều kiện yếm khí 37 0C 24h Kiểm tra ống môi trường gelatin-lacto để xem có sinh khí co ùchuyển màu vàng không (do chuyển axit) cho biết lên men lacto Làm lạnh 1h t=50C kiểm tra hoá lỏng gelatin Nếu môi trường rắn, nuôi cấy thêm kiểm tra hoá lỏng gelatin  Phương pháp 2: cấy thạch hộp Nguyên tắc: Sử dụng kỹ thuật đổ đóa môi trường chọn lọc SPS (sulphite polymixin sulphadiazin) Thiết bị dụng cụ thủy tinh 1.Đũa petri 2.Ống nghiệm 3.Vại kỵ khí Tủ ấm 350C 5.Chậu nước 450C 6.Dụng cụ đếm khuẩn lạc Môi trường thuốc thử 1.Môi trường làm giàu ,thịt băm 2.Môi trường thioglycolate lỏng 3.Môi trường nitrate di động 4.Nước pepton để pha loãng (0.1%) 5.Canh thang sinh bào tử 6.Thạch SPS (sulphite polymyxin sulfadiazin agar 7.Thuốc nhuộm Gram Cách làm: Nuôi cấy: Lấy ml thực phẩm đồng pha loãng cho vào petri đánh dấu, độ pha loãng dùng đóa - Rót 15-20 ml thạch SPS vào đóa, đảo đóa cho thạch trộn với mẫu thực phẩm môi trường đông lại - Ủ ấm: Lật úp đóa để bình kỵ khí Ủ ấm bình 35-37 0C 24 h Trang Báo cáo thảo luận Clotridium perfringens - Đếm khuẩn lạc (nghi Clostridium perfringens): Chọn đóa có 30-300 khuẩn lạc tính số lượng cho g thực phẩm Xác nhận tính sinh hoá: + Chọn 10 khuẩn lạc điển hình đóa môi trường SPS cấy khuẩn lạc vào ống canh thang thioglycollate vừa làm thoát khí làm nguội + Ủ ấm 350C tronng 18-24 h + Xét nghiệm ống nhuộm Gram chọn canh khuẩn khiết Nếu canh khuẩn khiết cấy vào ống môi trường nitrate di động ,canh thang sinh bào tử thịt băm.Ủ ấm 350C tronng 24 h:  Môi trường nitrate di động: vi khuẩn mọc theo đường cấy (Clostridium perfringens không di động) khử nitrate cách cho thêm 0.5 ml dung dịch -naphthylamine lượng tương tự acid sulphanilic(Clostridium perfringens hoàn nguyên nitrate, nghóa xuất màu da cam vòng 15 phút)  Xét nghiệm canh thang bào tử:Lấy cặn phết kính để khô, hơ lửa để cố định Nhuộm malachite green 10 phút, rửa nước nhuộm safranun 15 giây, rửa, thấm, để khô soi kính Bào tử nhuộm màu xanh cây, tế bào sinh dưỡng bắt màu đỏ Tính toán Tính số Clostridium Perfringens tronng mẫu dựa vào tỷ lệ phần trăm phép đếm khuẩn lạc điển hình –những khuẩn lạc xác nhận Clostridium Perfringens Thí dụ: Số khuẩn lạc đếm được: 85 10 khuẩn lạc xác nhận Clostridium Perfringens.(80%) Số Clostridium Perfringens g thực phẩm: 85x 0.8 =68 Trang Báo cáo thảo luận Clotridium perfringens Phương pháp đếm Clotridium perfringens sử dụng kỹ thuật đổ đóa, môi trường SPS 3.KỸ THUẬT MỚI TRONG PHÂN TÍCH KIỂM TRA VI SINH VẬT THỰC PHẨM Dựa tiến kỹ thuật miễn dịch, sinh học, phân tử, kỹ thuật vi tính điện toán, công nghệ sinh học,hiện số kỹ thuật nghiên cứu phát triển để phân tích kiểm tra phát vi sinh vật thực phẩm: Kỹ thuật kiểm tra test sinh hóa học (Biochemical identificatioon test kits) Đây test phổ biến rộng ,do có ưu điểm xác định nhóm vi sinh vật, nhóm mà test kiểm tra chuyên sâu định hướng phân biệt chủng vi sinh vật Thí dụ test Rosco, API Listeria… đïc sử dụng để xác định Listeria với vi khuẩn Strept Kỹ thuật lọc màng mỏng (Membrance filter techniques) Việc sử dụng màng mỏng để lọc đếm vi sinh vật kính hiển vi sử dụng từ lâu , có nhiều thuận lợi so với phương pháp nuôi cấy theo quy ước (conventional cultural methods) lọc với mẫu có khối lượng lớn Khi lọc thu chất ức chế can thiệp (inhibitors , interferiing substances) mẫu vật Tế bào vi sinh vật tập trung bề mặt dễ dàng tách chuyển sang môi trường phù hợp khác, không gây cản trở cho tế bào quần thể cộng đồng vi sinh, giảm thời gian phân tích kiểm tra vi sinh vật Kỹ thuật màng phim khô (Petrifilm) Hiện phổ biến với kỹ thuật chuẩn bị sẳn môi trường dạng Petrifilm (đóa cấy màng mỏng sấy khô bao gói kín công ty 3M, Minnesota) Mẫu thực phẩm cấy truyền màng film tái tạo cho môi trường có độ ẩm thích hợp tạo thành gel.Sau màng film đưa vào vào tủ cấy để quần thể vi sinh vật phát triển phân biệt chủng vi sinh vật qua kỹ thuật nhuộm màu Kỹ thuật màng film khô thuận lợi , không công chuẩn bị môi trường đổ vào đóa petri thuận tiện thao tác tiết kiệm dung tích tủ ấm Trang 10 Báo cáo thảo luận Clotridium perfringens sản: (Dùng trực tiếp, không qua xử lý nhiệt trước sử dụng) c Thủy sản khô sơ chế (phải xử lý trước sử dụng) Nhóm ngũ cốc, khoai củ, đậu đỗ : Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, khoai củ, đậu đỗ a Xử lý nhiệt trước sử dụng b Dùng trực tiếp, không qua xử lý nhiệt trước sử dụng Nhóm rau a Rau tươi, rau đông lạnh… b Rau muối, rau khô Nhóm nước khoáng nước giải khát đóng chai Nhóm nước chấm a Nước chấm nguồn gốc động vật b Nước chấm nguồn gốc thực vật Nhóm thức ăn đặc biệt (Thức ăn khô thức ăn dinh dưỡng cho trẻ em, thức ăn thay đặc biệt) a Xử lý nhiệt trước sử dụng b.dùng trực tiếp không qua xử lý nhiệt 10 Kem nước đá 10 20 102 10 Giới hạn G.A.P 10 10 10 10 10 10 G.A.P : thực hành nông nghiệp tốt Với thực phẩm thường nhiễm Cl.perfringens thịt sản phẩm chế biến từ thịt ,ta có biện pháp bảo quản phòng ngừa sau: A.Các phương pháp bảo quản công nghiệp: 1.Bảo quản sử dụng nhiệt độ thấp: Phương pháp áp dụng loại thực phẩm thịt ,cá sau sơ chế thời gian bảo quản trước sử dụng: Do khoảng nhiệt độ cho phép Cl.perfringens.:30 – 550C (Topt = 370C) nên: Khi hạ nhiệt độ thấp điều kiện tối ưu, enzim giảm hoạt động đưa nhiệt độ xuống thấp , enzym ngừng hoạt động Khi mà nhiều loại enzym ngừng hoạt động vi sinh vật ngừng phát triển sinh sản trạng thái ngủ Cl.perfringens loại vi sinh vật chịu nhiệt nên ngừng hoạt động nhiệt độ thấp , tế bào chết nhiệt độ đông lạnh Trang 14 Báo cáo thảo luận Clotridium perfringens Hầu hết thực phẩm bảo quản đông lạnh sử dụng kỹ thuật đông lạnh cần đảm bảo có thời gian đông lạnh nhanh 30 phút Nhiệt độ đông lạnh số sở thương nghiệp giữ bảo quản đông lạnh thực phẩm thời gian hạ nhiệt độ tới nhiệt độ đông lạnh nhanh, thường 20 phút Kỹ thuật đông lạnh sử dụng kết hợp với kỹ thuật hấp , trần, làm trắng thực phẩm , nhằm giảm số lượng vi sinh tự dưỡng có thực phẩm coi kỹ thuật nấu chín đông lạnh Điều đặc biệt quan trọng cần thiết trình bảo quản điều kiện cho phép vi sinh vật phát triển bị loại Bảo quản đông lạnh để lạnh thực phẩm sử dụng để làm giảm hoạt động vi sinh vật hoạt động men Giữ nhiệt độ không 0C ngăn cản làm chậm trình phát triển vi khuẩn gây bệnh thực phẩm Mặt khác cần ý có nhiều loại vi sinh vật có nhu cầu dinh dưỡng cao (spychotrophic) thường gây biến chất thực phẩm số vi khuẩn gây bệnh phát triển nhiệt độ 00C 2.Bảo quản thực phẩm sấy khô: Thường sấy loại thực phẩm có nhiều xơ chà là, đậu , thịt ,cá… Bảo quản khô thường coi phương pháp thông dụng nhiều nước phát triển Trong điều kiện khí hậu nóng nhiệt đới, phơi khô ánh nắng mặt trời sử dụng rộng rãi để sấy khô hoa , gia vị đến rau loại Sau đưa sấy tiếp tục buồng sấy nhân tạo Sấy khô rau giữ chất lượng thực phẩm tốt , hoạt tính nước thực phẩm thấp vi sinh vật không phát triển Men thực phẩm bị ngừng hoạt động thực phẩm thường trần hấp (làm trắng ) trước phơi sấy Có nhiều kỹû thuật để phơi sấy làm khô thực phẩm , làm bốc nước ánh sáng mặt trời , dùng luồng không khí nóng , sấy khô trục rullô, sấy phun khô , sấy phun làm thăng hoa (freeze drying ) 3.Sấy hun khói :thường sử dụng cho thực phẩm thịt Có loại sấy hun khói (còn gọi xông khói ) :Phương pháp lạnh , phương pháp nóng Hun khói nóng dạng nướng , đưa thực phẩm nướng lửa , hình thức nấu điều kiện bão hoà khói Thực phẩm bảo quản dạng hun khói thường ướt có thời gian bảo quản ngắn giữ nhiệt độ lạnh hàm lượng nước thực phẩm tỷ lệ cao Để bảo quản hun khói lạnh thường sử dụng nhiệt độ thấp (320C đến 430C ) Một số thực phẩm thường hun khói lạnh thời gian ngắn, phần lớn thực phẩm hun khói lạnh thường kéo dài số ngày hàng tuần Trang 15 Báo cáo thảo luận Clotridium perfringens thời gian thực phẩm dần nước vàbão hòa lượng khói lớn Tất loại thực phẩm hun khói thường không bảo quản lâu Chỉ có trường hợp xông khói đạt lượng thủy phần thấp có thêm lượng muối thích hợp , giúp kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm lâu Bảo quản sử dụng nồng độ thẩm thấu cao : Trong điều kiện thẩm thấu cao,sẽ giảm hoạt tính nước thực phẩm ngăn chặn chất dinh dưỡng từ môi trường qua màng tế bào sinh vật Có hai biện pháp để tạo nồng độ thẩm thấu cao thực phẩm sử dụng môi trừơng có nồng độ muối đường cao Sử dụng dung dịch có nồng độ muối ăn lượng muối ăn có thêm nitrat,nitrit …để bảo quản thực phẩm.Cần ý muối ăn dùng để bảo quản thực phẩm,do số loại vi sinh vật gây bệnh Vibrio cholerae sống nhiều ngày dung dịch muối nhạt Có ba phương pháp muối để bảo quản thực phẩm: a Muối khô: thực phẩm hấp thụ lượng muối cao, nước muối luôn chảy thoát b Muối ướt: Trong muối nước thực phẩm hoà tan thành dung dịch muối bảøo quản thực phẩm c Muối dung dịch có sẵn nồng độ muối thích hợp - Bảo quản thực phẩm sử dụng nồng độ đường thích hợp, nồng độ chứa dung dịch không thấp 60%, sử dụng đường kính đường mạch nha Phương pháp muối khô phương pháp áp dụng phổ biến cho thực phẩm thịt 5.Bảo quản với nồng độ pH thích hợp lên men: Cl.perfringens có khoảng pH cho phép :5.7 –8.1 Do đó:  Sẽ ngừng hoạt động môi trường có nồng độ acid cao Để đạt hiệu cân cấu trúc tế bào vi sinh vật , nồng độ pH bảo quản thích hợp phải  Acid hoá môi trường thực phẩm cách cho thêm acid vào thực phẩm lên men thực phẩm Tác dụng ngăn cản làm chết vi sinh vật phụ thuộc vào nhiệt độ, pH , thời gian bảo quản pH nhiệt độ đó,cũng thành phần lượng acid dùng 6.Bảo quản chất bảo quản: Có nhiều chất hoá học phụ gia bảo quản thực phẩm để ngăn cản phát triển tiết độc tố số chủng vi sinh vật : acid benzoic,boric,propionic muối chúng : paraben,sulfuro dioxyd sulfit,nitrit nitrat…Cũng sử dụng kết hợp thêm acid hữu (acetic,lactic) muối ăn Đối với Clostridium perfringens : o Phụ gia bảo quản : Sodium nitrit o Giới hạn sử dụng: 120ppm Trang 16 Báo cáo thảo luận o Clotridium perfringens Thực phẩm : thịt chế biến Tác dụng phương pháp bảo quản đạt hiệu cao phối hợp đồng thời.Tác sụng phối hợp đồng thời đạt hiệu cao khả hợp lực tác dụng thích hợp phản ứng phối hợp thực tế phản ứng hợp lực khó tiên đoán trước B.Phương pháp phòng ngừa dân dụng : Phần lớn vụ ngộ độc thực phẩm clostridium perfringens gây nên ăn thực phẩm nấu xong để nguội vàhay thực phẩm chế biến xong klâu trứơc dùng (trong bữa tiệc thịt sấy hun,thịt viên… ;thường gặp bếp ăn nấu cho nhiều người trường học ,bệnh viện ,phân xưởng….) Bào tử clostridium perfringens có khả chịu nhiệt phát triển nhanh chóng sau nấu lại ,thực phẩm giữ điều kiện có độ ẩm nhiệt độ thích hợp Các biện pháp để đề phòng ngộ độc thực phẩm vi khuẩn có bào tử chịu nhiệt đun nấu :  Tất thực phẩm chế biến để lạnh trước ăn cần nấu lại ,phục vụ ăn nóng  Thức ăn nấu chín để nguội nhanh bảo quản lạnh ăn  Khi ăn phải hâm nóng nhanh tới nhiệt độ diệt vi khuẩn ăn  Không ăn thịt có miếng to ,cần thái mỏng để dễ nấu chín & dễ dàng làm lạnh nhanh Trang 17 Báo cáo thảo luận Clotridium perfringens Phụ lục Phụ lục QUY ĐỊNH GIỚI HẠN Ô NHIỄM VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM ( QĐ 867/1988/QĐ-BYT ngày 4/4/1998) Thực phẩm Nhóm thịt a Thịt tươi: thịt đông lạnh, thịt xay nhỏ, thịt nghiền, thịt chế biến… (phải qua xử lý nhiệt trước sử dụng) b Sản phẩm chế biến từ thịt: thịt hun khói, patê… (sử dung trực tiếp) Nhóm cá thuỷ sản a Cá thuỷ sản tươi: Cá đông lạnh, cá tươi, loại nhuyễn thể, sản phẩm cá (Phải xử lý nhiệt trước sử dụng) b Sản phẩm chế biến từ cá thuỷ sản: tôm, cá hấp nóng, hun khói, chả cá, chả mực, loại giáp xác, nhuyễn thể luộc, hấp… (Dùng trực tiếp, không qua xử lý Vi sinh vật Giới hạn cho phép g hay 1ml thực phẩm TSVKHK E.coli S.aureus Salmonelia* B.cereus 106 102 102 102 TSVKHK Coliforms E.coli Cl.perfringens Salmonella* B.cereus S.aureus 3.105 50 10 10 10 TSVKHK E.coli S.aureus Cl.perfringens Salmonella* V.parahaemolyticus 106 102 102 102 102 TSVKHK Coliform E.coli S.aureus Cl.perfringens Salmonella* V.païrahaemolyticus TSBTNM-M 105 10 10 10 10 10 Trang 18 Báo cáo thảo luận Clotridium perfringens nhiệt trước sử dụng) TSVKHK:Tổng số vi khuẩn hiếu khí (*) Salmonella:không có 25g thực phẩm TSBTNM-M:Tổng số bào tử nấm men-nấm mốc Tiếp bảng giới hạn ô nhiễm vi sinh vật thực phẩm Thực phẩm Vi sinh vật c Thủy sản khô sơ chế (phải xử lý trước sử TSVKHK dụng) Coliforms E.coli S.aureus Cl.perfringens Salmonella* V.parahaemmolyticus 3.Nhóm trứng a trứng tươi, dịch trứng TSVKHK tươi đông lạnh… Coliforms E.coli A.aureus Salmonella* b sản phẩm chế biến từ trứng TSVKHK (Đã tiệt khuẩn theo Coliforms phương pháp Pasteur) E.coli S.aureus Salmonella* 4.Nhóm sữa a.Sữa khô,sữa bột… TSVKHK Coliforms E.coli S.aureus Salmonella* b Sữa tươi tiệt khuẩn TSVKHK theo phương pháp Pasteur Coliforms E.coli Salmonella* c sữa tươi tiệt trùng the TSVKHK phương phap U.H.T (sử Coliforms dung nhiệt độ siêu cao) E.coli S.aureus Salmonella* d Sản phẩm chế biến TSVKHK từ sữa: Bơ sữa chua, Coliforms Trang 19 Giới hạn cho phép 1g hay 1ml thực phẩm 106 102 10 102 20 102 105 102 10 103 10 5.104 10 0 5.104 10 10 0 0 104 10 Báo cáo thảo luận Clotridium perfringens mát…(Dùng trực tiếp, E.coli không qua xử ly nhiệt S.aureus trước sử dụng) Salmonella* 0 (*) Salmonella: 25g thực phẩm UHT: Ultra high temperature Tiếp bảng giới hạn ô nhiễm vi sinh vật thực phẩm Thực phẩm Vi sinh vật Nhóm ngũ cốc, khoai củ, đậu đỗ a Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, khoai củ, đậu đỗ: bột miến, mỳ sợi…(có xử lý nhiệt trước sử dụng) b Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, khoai củ, đậu đổ: Bánh, bột… (Dùng trực tiếp, không qua sử lý nhiệt trước sử dụng) Nhóm rau a Rau tươi, rau đông lạnh… TSVKHK Coliforms E.coli S.aureus Cl.perfringens B.cereus TSBTNM-M TSVKHK Coliforms E.coli S.aureus Cl.perfringens B.cereus TSBTNM-M TSVKHK Coliforms E.coli S.aureus Cl.perfringens Salmonella* b Rau muối, TSVKHK rau khô Coliforms E.coli Cl.perfringens B.cereus TSBTNM-M Nhóm nước TSVKHK khoáng nước E.coli giải khát đóng S.aureus chai Streptococcl a Nước giải khát Faecal có cồn P aeruginosa Cl.perfringens (*)Salmonella: 25g thực Trang 20 Giới hạn cho phép 1g hay 1ml thực phẩm 106 103 102 102 102 102 103 104 10 10 10 10 102 Giới hạn 10 Giới hạn Giới hạn Giới hạn 10 10 10 102 102 10 0 0 0 phẩm G.A.P G.A.P G.A.P G.A.P Báo cáo thảo luận Clotridium perfringens G.A.P: thực hành nông nghiệp tốt Trang 21 Báo cáo thảo luận Clotridium perfringens Tiếp bảng giới hạn ô nhiễm vi sinh vật thực phẩm Thực phẩm Vi sinh vật b nước giải khát TSVKHK có coàn Coliforms E.coli S.aureus Streptococcl faecal P.Aeruginosa TSBTNM-M Cl.perfringens c Nước khoáng TSVKHK đóng chai(**) Coliforms Streptococcl faecal P.Aeruginosa Cl.perfringens Nhóm gia vị TSVKHK Coliforms E.coli S.aureus Salmonella* TSBTNM-M Nhóm nước TSVKHK chấm Coliforms a Nước chấm E.coli nguồn gốc động S.aureus vật Cl.perfringens Salmonella* V.parahaemolytic us b Nước chấm TSVKHK nguồn gốc thực Coliforms vật E.coli S.aureus Cl.perfringens Salmonella* TSBTNM-M Giới hạn cho phép 1g hay 1ml thực phẩm 102 10 0 0 10 Giới hạn G.M.P 0 0 104 102 102 102 104 102 10 10 104 102 10 10 (*)Salmonella: 25g thực phẩm (**) Không có 250ml G.M.P Thực hành sản xuất tốt Trang 22 Báo cáo thảo luận Clotridium perfringens Tiếp bảng giới hạn ô nhiễm vi sinh vật thực phẩm Thực phẩm Vi sinh vật 10 Nhóm thức ăn đặc biệt a thức ăn khô thức ăn dinh dưỡng cho trẻ em, thức ăn thay đặc biệt (phải xử lý nhiệt trước sử dụng) b.thức ăn khô thức ăn dinh dưỡng cho trẻ em, thức ăn thay đặc biệt (dùng trực tiếp không qua sử lý nhiệt trước sử dụng) 11 Kem nước đá TSVKHK Coliforms E.coli S.aureus Cl.perfringens Salmonella* B.cereus Giới hạn cho phép 1g hay 1ml thực phẩm 105 102 10 102 10 102 TSVKHK Coliforms E.coli S.aureus Cl.perfringens Salmonella* B.cereus 104 10 10 10 TSVKHK Coliforms E.coli S.aureus Salmonella* Cl.perfringens 5.104 102 10 10 12 Nhóm đồ hộp Sản phẩm chế biến từ thịt, cá… đóng hộp, rau, quả… đóng hộp 13 Nhóm dầu mỡ E.coli S.aureus Cl.perfringens Cl.botulism TSBTNM-M 0 0 TSVKHK Coliforms E.coli S.aureus Salmonella* TSBTNM-M 103 10 0 (*)Salmonella: 25g thực phẩm Trang 23 Báo cáo thảo luận Clotridium perfringens Phụ lục 2: Gluc-oz Mantoz Lactoz Smalixin H2S TanGelatin Nitrat Đỏ Indon Sữa Phản ứng sinh hoá học số loài Clotridium Cl chauvoei Cl septicum Cl perfingens Cl.hemolyticu m Cl tetani + + + + + + + + + + - + + + + + + + + - + - - - + + - - axít axít Đông nhanh axít - - - - + + - + Cl botulinum Cl sordelli + + - - + + - - + + + + + + - + Loài vi khuẩn Trang 24 K0 thay đổi axít Tiêu hoá Báo cáo thảo luận Clotridium perfringens Phụ lục 3: Sự phát triển Clotridium perfringens môi trường nuôi cấy khác Môi trường thạch lòng đỏ trứng Môi trường thạch máu Môi trường đặc STSA STSA : máu cừu+trypticase +đậu nành Tạo thành vùng thạch máu Một số hình ảnh Clotridium perfringens quan sát kính hiển vi: Trang 25 ... khuẩn lạc xác nhận Clostridium Perfringens. (80%) Số Clostridium Perfringens g thực phẩm: 85x 0.8 =68 Trang Báo cáo thảo luận Clotridium perfringens Phương pháp đếm Clotridium perfringens sử dụng... khuẩn mọc theo đường cấy (Clostridium perfringens không di động) khử nitrate cách cho thêm 0.5 ml dung dịch -naphthylamine lượng tương tự acid sulphanilic (Clostridium perfringens hoàn nguyên nitrate,... dưỡng bắt màu đỏ Tính toán Tính số Clostridium Perfringens tronng mẫu dựa vào tỷ lệ phần trăm phép đếm khuẩn lạc điển hình –những khuẩn lạc xác nhận Clostridium Perfringens Thí dụ: Số khuẩn lạc