Nghiên cứu chuẩn hóa phương pháp phân tích dư lượng ciprofloxacin trong thịt lợn bằng kỹ thuật elisa tại phòng kiểm nghiệm của công ty cổ phần tập đoàn dabaco việt nam luận văn thạc sĩ nông nghiệp

62 22 0
Nghiên cứu chuẩn hóa phương pháp phân tích dư lượng ciprofloxacin trong thịt lợn bằng kỹ thuật elisa tại phòng kiểm nghiệm của công ty cổ phần tập đoàn dabaco việt nam luận văn thạc sĩ nông nghiệp

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGÔ ĐỨC DŨNG NGHIÊN CỨU CHUẨN HĨA PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG CIPROFLOXACIN TRONG THỊT LỢN BẰNG KỸ THUẬT ELISA TẠI PHÒNG KIỂM NGHIỆM CỦA CƠNG TY CỔ PHẦN TẬP ĐỒN DABACO VIỆT NAM Chuyên ngành: Thú y Mã số : 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học: TS Dương Văn Nhiệm NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 LỜI CAM ĐOAN - Tôi xin cam đoan rằng, số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị - Tôi xin cam đoan rằng, giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Ngô Đức Dũng i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Dương Văn Nhiệm, người tận tình giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu đề tài hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Khoa Thú y Bộ môn Thú y cộng đồng tận tình dạy dỗ đóng góp ý kiến q báu để tơi hồn thành luận văn Tôi chân thành cảm ơn lãnh đạo Công ty Cổ phần Tập đoàn DABACO Việt Nam cho phép triển khai tạo điều kiện thuận lợi cho suốt q trình nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn bạn đồng nghiệp Phòng Kiểm nghiệm Cơng ty Cổ phần Tập đồn DABACO Việt Nam gia đình động viên, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình thực đề tài Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Ngô Đức Dũng ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract xi Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Tình hình an tồn thực phẩm 2.1.1 Tình hình an tồn thực phẩm giới 2.1.2 Tình hình an tồn thực phẩm Việt Nam 2.2 Tình hình sản xuất chăn nuôi Việt Nam 2.2.1 Sản xuất tiêu thụ thịt Việt Nam 2.2.2 Tình hình sản xuất, sử dụng, quản lý thuốc thú y chăn nuôi 2.3 Giới thiệu khái qt cơng ty cổ phần tập đồn dabaco việt nam 2.4 Những hiểu biết kháng sinh nhóm Fluoroquinolone .12 2.4.1 Kháng sinh nhóm Fluoroquinolone 12 2.4.2 Kháng sinh Ciprofloxacin 13 2.5 Tồn dư kháng sinh thịt lợn ảnh hưởng chúng sức khỏe cộng đồng 14 2.5.1 Khái niệm tồn dư 14 2.5.2 Ảnh hưởng tồn dư kháng sinh thực phẩm sức khỏe cộng đồng 16 2.6 Một số kỹ thuật phân tích dư lượng kháng sinh thực phẩm 19 2.6.1 Khái niệm ELISA 20 2.6.2 Phân loại ELISA 21 2.6.3 Ưu, nhược điểm phương pháp phân tích định tính ELISA 24 2.6.4 Một số yếu tố ảnh hưởng tới kết phân tích phương pháp ELISA .24 iii 2.6.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ nhạy phản ứng ELISA 25 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 26 3.1 Vật liệu nghiên cứu .26 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 26 3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 26 3.1.3 Thời gian nghiên cứu 26 3.1.4 Vật liệu, hóa chất thuốc thử 26 3.1.5 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 27 3.2 Nội dung nghiên cứu 27 3.3 Phương pháp nghiên cứu .27 3.3.1 Thí nghiệm nghiên cứu tính phù hợp kit ELISA dùng cho phân tích định tính xác định Ciprofloxacin mẫu thịt lợn tươi 27 3.3.2 Ứng dụng kết nghiên cứu phương pháp để phân tích mẫu thực 30 3.3.3 Phương pháp phân tích số liệu 33 Phần Kết thảo luận 34 4.1 Kết nghiên cứu tính phù hợp kit elisa dùng cho phân tích định tính xác định Ciprofloxacin thịt lợn tươi .34 4.1.1 Kết nghiên cứu tính ổn định kit ELISA 34 4.1.2 Kết xác định giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng kit ELISA 36 4.1.3 Kết nghiên cứu khả phát kit (CCβ) 37 4.1.4 Kết xác định độ xác (Accuracy: AC), độ đặc hiệu (Specificity: SP), độ nhạy (Sensitivity: SE), độ lệch dương (Positive deviation: PD) độ lệch âm (negative deviation: ND) 38 4.1.5 Kết xác định độ thu hồi, độ lặp lại độ tái lặp .40 4.2 Kết phân tích dư lượng ciprofloxacin mẫu thịt lợn tươi Kit Elisa 42 Phần Kết luận kiến nghị 44 5.1 Kết luận .44 5.2 Kiến nghị 44 Tài liệu tham khảo 46 Phụ lục 49 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên Tiếng Anh Nghĩa Tiếng Việt AC Accuracy Độ xác ADI Acceptable Daily Intake Lượng ăn vào hàng ngày chấp nhận CCα Decision limit Giới hạn định CCβ Detection capability Khả phát ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Phương pháp ELISA Assay EU European Union Liên hiệp Châu Âu FAO Food and Agriculture Organization Tổ chức Lương thực Nông nghiệp of the United Nations Liên Hiệp Quốc Food and Drug Administration Cục Quản lý Thực phẩm Dược FDA phầm Hoa Kỳ FSIS Food Safety and Inspection Service Cơ quan Thanh tra An toàn thực phẩm GMP Good Manufacturing Practice Thực hành sản xuất tốt HACCP Hazard Analysis and Critical Hệ thống phân tích mối nguy kiểm Control Point System soát điểm tới hạn High-performance liquid Sắc ký lỏng hiệu cao HPLC chromatography LC/MS-MS Liquid Chromatography/Mass Sắc ký lỏng khối phổ hai lần Spectrometry LOD Limit of Detection Giới hạn phát v LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng MRL Maximum Residue Limit Giới hạn dư lượng tối đa cho phép MRPL Minimum Required Performance Giới hạn phân tích tối thiểu Limit phương pháp Negative deviation Độ lệch âm ND NN&PTNT Nông nghiệp Phát triển nông thôn PD Positive deviation Độ lệch dương Ppb Parts per billion Phần tỷ SE Sensitivity Độ nhạy SP Specificity Độ đặc hiệu TĂCN Thức ăn chăn ni TP.HCM Thành phố Hồ Chí Minh IUPAC WTO International Union of Pure and Liên minh Quốc tế Hóa học Applied Chemistry túy Hóa học ứng dụng World Trade Organization Tổ chức Thương mại giới vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Ký hiệu quy ước mô phương pháp ELISA 21 Bảng 3.1 Tiêu chí đánh giá độ thu hồi 30 Bảng 3.2 Tiêu chí đánh giá % CV 30 Bảng 4.1 Kết phân tích kiểm tra đường chuẩn tính ổn định kit 35 Bảng 4.2 Kết phân tích kết tính tốn giới hạn phát (LOD) Ciprofloxacin thịt lợn tươi 37 Bảng 4.3 Kết xác định giới hạn phát phương pháp nồng độ 1,6 g/kg 38 Bảng 4.4 Kết phân tích mẫu xác định độ xác, độ đặc hiệu, độ nhạy, độ lệch âm độ lệch dương phương pháp 39 Bảng 4.5 Kết phân tích độ xác độ đặc hiệu, độ nhạy, độ lệch âm độ lệch dương 39 Bảng 4.6 Kết đánh giá độ xác (AC), độ đặc hiệu, độ nhạy (SE), độ lệch dương (PD) độ lệch âm (ND) kit 40 Bảng 4.7 Độ thu hồi (R%), độ lặp lại độ tái lặp Ciprofloxacin mẫu thịt lợn µg/kg .40 Bảng 4.8 Độ thu hồi (R%), độ lặp lại độ tái lặp Ciprofloxacin mẫu thịt lợn 7,5 µg/kg 41 Bảng 4.9 Độ thu hồi (R%), độ lặp lại độ tái lặp Ciprofloxacin mẫu thịt lợn 10 µg/kg 41 Bảng 4.10 Kết phân tích dư lượng Ciprofloxacin mẫu thịt lợn tươi kỹ thuật ELISA 42 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Chuỗi giá trị sản xuất Cơng ty Cổ phần Tập đồn DABACO Việt Nam 10 Hình 2.2 Sơ đồ mơ phương pháp ELISA sandwich ELISA cạnh tranh 23 Hình 4.1 Đường chuẩn biểu thị mối tương quan nồng độ chuẩn Ciprofloxacin độ hấp thụ kit 34 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Ngơ Đức Dũng Tên luận văn: Nghiên cứu chuẩn hóa phương pháp phân tích dư lượng ciprofloxacin thịt lợn kỹ thuật ELISA phịng kiểm nghiệm Cơng ty Cổ phần Tập đoàn DABACO Việt Nam Ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Tên sở đào tạo: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: - Chuẩn hóa phương pháp phân tích Ciprofloxacin thịt lợn tươi kỹ thuật ELISA; - Ứng dụng phương pháp chuẩn hóa để kiểm sốt tồn dư Ciprofloxacin thịt lợn tươi Công ty Cổ phần Tập đồn DABACO Việt Nam Phương pháp: - Thí nghiệm nghiên cứu tính phù hợp kit ELISA dùng cho phân tích định tính xác định Ciprofloxacin mẫu thịt lợn tươi - Ứng dụng kết nghiên cứu phương pháp để phân tích mẫu thực - Phương pháp phân tích số liệu Kết kết luận: Bộ kit ELISA dùng cho phân tích định tính dư lượng Ciprofloxacin thịt lợn hãng Biooscientific (MaxSignalTM Ciprofloxacin, mã 1068-01) đạt yêu cầu tính ổn định; thông số khả phát hiện, hiệu lực kit điều kiện phòng thử nghiệm DABACO là: Độ xác (AC): 95% (AC ≥ 90%) Độ đặc hiệu: 100% (SP ≥ 90%) Độ nhạy (SE): 90% (SE ≥ 90%) Độ lệch dương (PD): 0% (PD ≤ 10%) Độ lệch âm (ND): 9,1% (ND ≤ 10%) Giới hạn phát LOD 1,52 µg/kg Khả phát CCò l 1,60 àg/kg thu hi khong t 81,0 - 109,2% Độ lặp lại 7,99 – 10,64 ix Bảng 4.1 Kết phân tích kiểm tra đường chuẩn tính ổn định kit Lơ Lơ Lô Lô Lô Nồng độ (ng/ml) 2,5 7,5 Lần thực 0,35 22,5 Hệ số hồi quy (R2) Lần 0,406 0,852 2,237 Lần 0,389 0,822 Lần 0,368 Lần 8,402 22,714 0,9932 Y= -0,9029 (logx)-0,4169 Đạt 2,551 8,43 21,489 0,9939 Y= -1,0113 (logx)-0,7198 Đạt 0,859 2,63 8,614 20,612 0,9949 Y= -0,9975(logx)-0,5876 Đạt 0,408 0,777 2,524 8,386 21,982 0,9907 Y= -0,9952(logx)-0,6668 Đạt Lần 0,382 0,819 2,623 8,635 20,857 0,9929 Y= -0,9823(logx)-0,6231 Đạt Lần 0,382 0,85 2,466 8,772 21,025 0,9941 Y= -0,831(logx)- 0,6408 Đạt Lần 0,366 0,955 2,295 8,572 21,484 0,9971 Y= -0,629(logx)- 0,3901 Đạt Lần 0,346 0,938 2,63 8,496 22,364 0,9970 Y= -0,8533(logx)-0,5786 Đạt Lần 0,406 0,778 2,538 8,451 21,796 0.9907 Y= -0,9697(logx)- 0,6497 Đạt Lần 0,363 0,866 2,661 8,688 20,331 0,9946 Y= -0,9575(logx)-0,5835 Đạt 35 Phương trình hồi quy tuyến tính Đánh giá Kết cho thấy phương trình đường chuẩn kit thử nghiệm lần đầu đạt yêu cầu Phần lại kit bảo quản theo hướng dẫn nhà sản xuất 2-80C thí nghiệm lặp lại sau tháng cho kết đạt yêu cầu Như nồng độ đo dải nồng độ thiết lập đường chuẩn kit ổn định Đặc biệt, nồng độ dung dịch xây dựng đường chuẩn khoảng 0,35 đến 22,5 ng/ml đáp ứng kit (log) có quan hệ hồi quy tuyến tính chặt chẽ, với giá trị R2≥0,99 Kết đáp ứng yêu cầu phương trình hồi quy tuyến tính phương pháp phân tích sàng lọc theo quy định Quyết định số 657/2002/EC Uỷ ban Châu Âu: 0,99 ≤ R2≤1 4.1.2 Kết xác định giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng kit ELISA Kết phân tích kết tính tốn giới hạn phát (LOD) Ciprofloxacin mẫu trắng trình bày Bảng 4.2 Kết bảng cho thấy trung bình chung 20 mẫu trắng = 0,48 µg/kg, độ lệch chuẩn SD = 0,35 Giới hạn phát (LOD) 1,52 µg/kg Như kit ELISA có khả phát Ciprofloxacin mẫu thịt lợn tươi nồng độ thấp 1,52 µg/kg hay nói cách khác kit xác định có mặt chất phân tích có mẫu nồng độ từ 1,52 µg/kg trở lên điều kiện phòng thử nghiệm Giới hạn định lượng LOQ tính x 1,52 = 4,56 (µg/kg) Trên sở giá trị tính tốn thu được, phịng thí nghiệm lấy giá trị LOD 1,6 µg/kg LOQ µg/kg Giới hạn phát (LOD) nhà sản xuất kít Bioo Scientific 0,525 µg/kg Giới hạn phát (LOD) Ciprofloxacin mẫu thịt lợn tươi phịng thí nghiệm 1,52 µg/kg Giá trị chấp nhận đạt yêu cầu lớn với Giới hạn phát (LOD) nhà sản xuất kit Bioo Scientific tuyên bố 36 Bảng 4.2 Kết phân tích kết tính tốn giới hạn phát (LOD) Ciprofloxacin thịt lợn tươi Tên mẫu Nồng độ đo (µg/kg) M_01 0,43 M_02 0,31 M_03 1,27 M_04 0,55 M_05 0,85 M_06 0,37 M_07 0,41 M_08 0,14 M_09 0,03 M_10 0,92 M_11 0,06 M_12 0,08 M_13 0,72 M_14 0,69 M_15 0,71 M_16 0,05 M_17 0,27 M_18 0,28 M_19 0,87 M_20 0,66 Trung bình chung 0,48 Độ lệch chuẩn (SD) 0,35 Giới hạn phát (LOD) 1,52 4.1.3 Kết nghiên cứu khả phát kit (CCβ) Kết (Bảng 4.3) cho thấy: Mẫu trắng có tín hiệu cao 1,27 g / kg (M_03), Tín hiệu thấp mẫu thêm chuẩn nồng độ 1,6 g / kg 1,24 g / kg (M_09) Như vậy, có 01 (1/20 mẫu hay 5%) mẫu thêm chuẩn có tín hiệu (nồng độ) nhỏ tín hiệu mẫu trắng có tín hiệu cao Do giá trị “cut off” Ciprofloxacin mẫu thịt lợn tươi 1,24 g/kg Vậy khả phát phương pháp CCßCiprofloxacin 1,6 g / kg 37 Bảng 4.3 Kết xác định giới hạn phát phương pháp nồng độ 1,6 g/kg Mẫu Tên mẫu M_01 M_02 M_03 M_04 M_05 M_06 M_07 M_08 M_09 M_10 M_11 M_12 M_13 M_14 M_15 M_16 M_17 M_18 M_19 M_20 trắng Nồng độ đo (µg/kg) 0,43 0,31 1,27 0,55 0,85 0,37 0,41 0,14 0,03 0,92 0,06 0,08 0,72 0,69 0,71 0,05 0,27 0,28 0,87 0,66 Mẫu trắng Tên mẫu M_01* M_02* M_03* M_04* M_05* M_06* M_07* M_08* M_09* M_10* M_11* M_12* M_13* M_14* M_15* M_16* M_17* M_18* M_19* M_20* thêm chuẩn Nồng độ đo (µg/kg) 1,84 1,61 2,48 1,65 1,85 1,67 1,61 1,64 1,24 1,92 1,66 1,68 1,72 1,69 1,91 1,65 1,87 1,68 2,27 1,86 Kết chấp nhận đáp ứng yêu cầu quy định định 657/2002/EC (EC, 2002) có ≤ 5% số mẫu thêm chuẩn có giá trị ≤ giá trị ‘cut – off’ nồng độ thêm chuẩn nồng độ xác định thí nghiệm coi khả phát phương pháp (CCβ) Vậy khả phát phương pháp CCßCiprofloxacin 1,6 g / kg Kết chấp nhận (Phòng thử nghiệm tham chiếu (CRL) châu Âu có MRPL mẫu thịt µg/kg) 4.1.4 Kết xác định độ xác (Accuracy: AC), độ đặc hiệu (Specificity: SP), độ nhạy (Sensitivity: SE), độ lệch dương (Positive deviation: PD) độ lệch âm (negative deviation: ND) Việc lựa chọn thông số thẩm định tùy thuộc vào kỹ thuật áp dụng phương pháp Các kết nghiên cứu cho thấy kit phân tích dư lượng Ciprofloxacin hãng BiooScientific đáp ứng yêu cầu tính ổn định kit Khả nng phỏt hin ca Kớt CCò l 1,6 àg/ kg Với phương pháp phân tích định 38 tính ELISA, thông số cần xác định bao gồm độ xác (accuracy: AC), độ đặc hiệu (specificity: SP), độ nhạy (sensitivity: SE), độ lệch dương (positive deviation: PD), độ lệch âm (negative deviation: ND) Kết phân tích mẫu xác định độ xác, độ đặc hiệu, độ nhạy, độ lệch âm độ lệch dương trình bày Bảng 4.4 Bảng 4.4 Kết phân tích mẫu xác định độ xác, độ đặc hiệu, độ nhạy, độ lệch âm độ lệch dương phương pháp Mẫu Tên mẫu L_01 L_02 L_03 L_04 L_05 L_06 L_07 L_08 L_09 L_10 L_11 L_12 L_13 L_14 L_15 L_16 L_17 L_18 L_19 L_20 trắng Nồng độ đo (µg/kg) Mẫu trắng Tên mẫu 0,49 0,26 0,23 0,52 0,85 0,47 0,49 0,24 0,22 0,62 0,36 0,18 0,42 0,60 0,21 0,15 0,47 0,29 1,27 0,86 L_01* L_02* L_03* L_04* L_05* L_06* L_07* L_08* L_09* L_10* L_11* L_12* L_13* L_14* L_15* L_16* L_17* L_18* L_19* L_20* thêm chuẩn Nồng độ đo (µg/kg) 1,74 1,65 2,45 1,68 1,81 1,52 1,68 1,61 1,79 1,91 1,68 1,62 1,78 1,56 1,97 1,63 1,88 1,61 1,66 1,81 Bảng 4.5 Kết phân tích độ xác độ đặc hiệu, độ nhạy, độ lệch âm độ lệch dương Kết Mẫu có kết dương tính (+) Mẫu có kết âm tính (-) Mẫu chứng (+) Mẫu chứng (-) 18 20 Kết Bảng 4.5 cho thấy 20 mẫu trắng bố trí thí nghiệm khơng có mẫu cho kết dương tính 20 mẫu thêm chuẩn nồng độ 1,6 ppb 39 có mẫu cho kết âm tính Kết trình bày Bảng 4.6 Bảng 4.6 Kết đánh giá độ xác (AC), độ đặc hiệu, độ nhạy (SE), độ lệch dương (PD) độ lệch âm (ND) kit Thơng số Độ xác (AC) Tỷ lệ (%) Yêu cầu (657/2002/EC) Độ đặc hiệu Độ nhạy Độ lệch Độ lệch âm (SE) dương (PD) (ND) 95 100 90 9,1 ≥ 90 % ≥ 90 % ≥ 90 % ≤ 10 % ≤ 10 % Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đánh giá Kết bảng cho thấy: Nhà sản xuất tuyên bố độ đặc hiệu kit để phân tích Ciprofloxacin thịt lợn tươi 100% Kết kiểm tra kit phịng thí nghiệm đạt độ đặc hiệu kit để phân tích Ciprofloxacin thịt lợn tươi 100% Đối chiếu với quy định việc chuẩn hóa phương pháp phân tích sàng lọc tồn dư thực phẩm kết hồn tồn đáp ứng yêu cầu phương pháp sàng lọc Như vậy, phương pháp phát Ciprofloxacin mẫu thịt lợn tươi có nồng độ 1,6 ppb với với xác suất lỗi âm tính giả β = 5% 4.1.5 Kết xác định độ thu hồi, độ lặp lại độ tái lặp Bảng 4.7 Độ thu hồi (R%), độ lặp lại độ tái lặp Ciprofloxacin mẫu thịt lợn µg/kg Ngày Thơng Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu số 4,05 5,13 5,01 4,80 C (µg/kg) R(%) C (µg/kg) R(%) C (µg/kg) R(%) Mẫu Mẫu Trung 96,0 107,6 93,4 4,63 4,12 5,16 92,6 82,4 104,2 103,2 101,0 83,8 4,07 4,28 4,67 81,4 85,6 93,4 105,0 5,25 40 SD 5,38 4,67 4,84 0,46 81,0 102,6 100,2 5,21 bình 5,05 4,19 4,73 0,49 4,52 4,96 4,63 0,43 90,4 99,2 CV% Độ tái lặp 9,51 9,43 10,33 9,39 Bảng 4.8 Độ thu hồi (R%), độ lặp lại độ tái lặp Ciprofloxacin mẫu thịt lợn 7,5 µg/kg Ngày Thông Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu số 7,72 8,16 8,07 7,23 7,83 C (µg/kg) 6,55 R(%) 87,3 102,9 108,8 107,6 C (µg/kg) 6,35 6,35 8,12 7,96 Mẫu Trung SD CV% tái lặp 7,59 0,61 7,99 7,35 0,78 10,64 7,31 0,75 10,23 9,24 96,4 104,4 7,58 7,69 R(%) 84,7 85,2 108,3 106,1 101,1 102,5 C (µg/kg) 8,06 7,96 R(%) bình Độ 7,77 7,20 6,39 6,45 107,5 106,1 103,6 96,0 85,2 86,0 Bảng 4.9 Độ thu hồi (R%), độ lặp lại độ tái lặp Ciprofloxacin mẫu thịt lợn 10 µg/kg Ngày Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Trung Độ Thông Mẫu số bình C (µg/kg) 8,89 8,72 9,07 10,5 10,6 10,9 9,78 0,99 10,09 R(%) 88,9 87,2 90,7 105,0 106,0 109,0 C (µg/kg) 10,92 9,36 8,54 8,91 10,15 9,78 9,96 0,86 8,99 R(%) 109,2 93,6 85,4 89,1 101,5 97,8 C (µg/kg) 9,97 10,36 9,13 8,45 10,60 9,61 9,69 0,80 8,28 R(%) 99,7 103,6 91,3 84,5 106,0 96,1 SD CV% tái lặp 8,63 Kết Bảng 4.7; 4.8 4.9 cho thấy: - Đối với phép thử phân tích dư lượng Ciprofloxacin mẫu thịt lợn thêm chuẩn: + Ở nồng độ µg/kg: Độ thu hồi (R%) ngày thấp nhất: 81,0; cao : 107,6; Độ lặp lại thấp nhất: 9,39; cao nhất: 10,33; Độ tái lặp: 9,43 + Ở nồng độ 7,5 µg/kg: Độ thu hồi (R%) ngày thấp nhất: 84,7; cao : 108,8; Độ lặp lại thấp nhất: 7,99; cao nhất: 10,64; Độ tái lặp: 9,24 + Ở nồng độ 10 µg/kg: Độ thu hồi (R%) ngày thấp nhất: 84,5; cao : 109,2; Độ lặp lại thấp nhất: 8,28; cao nhất: 10,09; Độ tái lặp: 8,63 41 Trên mẫu trắng thêm chuẩn ba nồng độ: 5; 7,5 10 µg/kg, kết thu độ thu hồi khoảng từ 81,0 - 109,2 ; độ lặp lại 7,99 – 10,64 độ tái lặp 8,63- 9,43 So với quy định Quyết định 657/2002/EC, kết hoàn toàn phù hợp Ghi chú: Yêu cầu theo định 657/2002/EC theo Bảng 3.1 Bảng 3.2 4.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG CIPROFLOXACIN TRONG MẪU THỊT LỢN TƯƠI BẰNG KIT ELISA Bảng 4.10 Kết phân tích dư lượng Ciprofloxacin mẫu thịt lợn tươi kỹ thuật ELISA STT Mã số mẫu Nồng độ Nồng độ đo đo giếng giếng (µg/kg) (µg/kg) Giá trị trung Độ chụm bình (µg/kg) (CV%) Lô TL_01 0,83 0,73 0,78 12,0 Lô TL_02 0,33 0,37 0,35 12,1 Lô TL_03 0,73 0,65 0,69 11,0 Lô TL_04 0,03 0,03 0,03 0,0 Lô TL_05 0,39 0,37 0,38 5,1 Lô TL_06 0,52 0,49 0,505 5,8 Lô TL_07 0,44 0,49 0,465 11,4 Lô TL_08 0,27 0,27 0,27 0,0 Lô TL_09 0,27 0,31 0,29 14,8 10 Lô TL_10 0,33 0,36 0,345 9,1 11 Lô TL_11 0,21 0,21 0,21 0,0 12 Lô TL_12 0,51 0,41 0,46 19,6 13 Lô TL_13 0,72 0,62 0,67 13,9 14 Lô TL_14 0,66 0,72 0,69 9,1 15 Lô TL_15 0,54 0,49 0,515 9,3 16 Lô TL_16 0,43 0,48 0,455 11,6 17 Lô TL_17 0,44 0,44 0,44 0,0 18 Mẫu QC - 0,32 0,36 0,34 12,5 19 Mẫu QC + 1,92 2,12 2,02 10,4 42 Kết Bảng 4.10 cho thấy: + Mẫu trắng cho kết âm tính Mẫu dương tính cho kết dương tính với độ thu hồi 101,0% Kết phù hợp với thí nghiệm bố trí + Mẫu PTN, tất kết phân tích âm tính + Quy định Quyết định 657/2002/EC, độ chụm kết lần đo nồng độ – 10 µg//kg cho phép lớn 21% Độ chụm kết lần đo (giữa giếng) có CV (%) từ – 19,6% So với quy định này, tất kết đạt yêu cầu nghĩa kết phân tích đảm bảo độ tin cậy ELISA kỹ thuật sàng lọc hiệu để loại bỏ mẫu âm tính Bằng phân tích sàng lọc, loại bỏ 17/17 mẫu âm tính với Ciprofloxacin Đây kỹ thuật áp dụng phổ biến phịng thử nghiệm phân tích dư lượng thực phẩm nhiều nước giới trở thành công cụ hữu hiệu quan thẩm quyền chấp thuận cho phép sử dụng với mục đích thử nghiệm sàng lọc (screening method) Trên sở xác định giá trị thông số khả phát CCß, PTN DABACO quy định diễn giải kết phân tích sàng lọc dư lượng Ciprofloxacin thịt lợn kỹ thuật ELISA theo kết xác định Khả phát CCß 1,6 µg/kg thay cho Giới hạn phát LOD 1,52 µg/kg Việc quy định diễn giải kết phân tích sàng lọc dư lượng Ciprofloxacin thịt lợn kỹ thuật ELISA đảm bảo độ tin cậy kết phân tích cao Trong phương pháp áp dụng phân tích mẫu dư lượng, theo quy định định 657/2002/EC Văn phịng cơng nhận chất lượng VILAS (2005) có phương pháp phân tích định tính ELISA phương pháp định lượng GCMS, LCMSMS… Trong chiến lược phân tích, mẫu âm tính chiếm tỷ lệ cao, phịng thí nghiệm thường áp dụng phương pháp phân tích sàng lọc (ELISA) để loại bỏ phần lớn mẫu âm tính Mặc dù pháp phân tích sàng lọc bỏ sót tỷ lệ âm tính giả (9,1%) với chất cần phân tích kỹ thuật ELISA cơng cụ hữu ích để phân tích nhanh dư lượng thực phẩm có nguồn gốc động vật Kết phân tích cung cấp thơng tin hữu ích, kinh tế cho cơng việc phân tích 43 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Bộ kit ELISA dùng cho phân tích định tính dư lượng Ciprofloxacin thịt lợn hãng Biooscientific (MaxSignalTM Ciprofloxacin, mã 1068-01) đạt yêu cầu tính ổn định; thơng số khả phát hiện, hiệu lực kit điều kiện phịng thí nghiệm DABACO là: Độ xác (AC): 95% (AC ≥ 90%) Độ đặc hiệu: 100% (SP ≥ 90%) Độ nhạy (SE): 90% (SE ≥ 90%) Độ lệch dương (PD): 0% (PD ≤ 10%) Độ lệch âm (ND): 9,1% (ND 10%) Gii hn phỏt hin LOD l 1,52 àòg/kg Kh nng phỏt hin CCò l 1,60 àg/kg thu hồi khoảng từ 81,0 - 109,2% Độ lặp lại 7,99 – 10,64 Độ tái lặp 8,63- 9,43 Kết đáp ứng yêu cầu phương pháp phân tích định tính theo quy định Quyết định 657/2002/EC Phương pháp phân tích dư lượng Ciprofloxacin thịt lợn kỹ thuật ELISA đáp ứng quy định Quyết định 657/2002/EC yêu cầu kỹ thuật phương phấp phân tích sàng lọc Phương pháp phù hợp để ứng dụng phòng kiểm nghiệm DABACO phân tích sàng lọc dư lượng Ciprofloxacin thịt lợn Phịng thí nghiệm quy định diễn giải kết thử nghiệm phân tích dư lượng Ciprofloxacin thịt lợn kỹ thuật ELISA theo khả phỏt hin CCò l 1,60 àg/kg (mu tht ln dng tính dư lượng Ciprofloxacin, cần phân tích khẳng định kỹ thuật LC/MS/MS) 5.2 KIẾN NGHỊ - Phòng kiểm nghiệm DABACO nên viết thành hướng dẫn chung chuẩn hóa phê duyệt phương pháp thử (kỹ thuật ELISA) áp dụng 44 PTN Công ty để phương pháp phân tích áp dụng PTN cần chuẩn hóa phê duyệt phương pháp thử trước phân tích mẫu PTN Như kết phân tích đảm bảo độ tin cậy cao, đáp ứng yêu cầu phù hợp cho mục đích phân tích - Cần tiếp tục nghiên cứu phương pháp phân tích dư lượng nhóm kháng sinh thịt lợn kỹ thuật ELISA mà nhóm kháng sinh sử dụng chăn ni lợn thịt trại vệ tinh Công ty theo Hướng dẫn chung chuẩn hóa phê duyệt phương pháp thử 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn (2011) Thông tư 54/2011/TT-BNNPTNT ngày 03/08/2011 Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn yêu cầu lực cho phịng thử nghiệm có khả phân tích phép thử thuộc lĩnh vực sinh học, hóa học Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn (2016a) Thông tư 10/2016/TTBNNPTNT ngày 01/6/2016 quy định Danh mục thuốc thú y phép lưu hành, cấm sử dụng Việt Nam, công bố mã HS thuốc thú y nhập phép lưu hành Việt Nam Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn (2016b) Thông tư 13/2016/TTBNNPTNT ngày 02/6/2016 quy định quản lý thuốc thú y bao gồm đăng ký lưu hành, khảo nghiệm, sản xuất, buôn bán, xuất khẩu, nhập khẩu, kiểm nghiệm, kiểm tra chất lượng, thu hồi, tiêu hủy, quảng cáo thuốc thú y Bộ Nông nghiệp PTNT (quý I năm 2017) Bộ Y tế (2002) Quyết định số 928/2002/QĐ-BYT ngày 21/3/2002 Về việc ban hành Quy định điều kiện bảo đảm an toàn thực phẩm sản xuất, kinh doanh, sử dụng phụ gia thực phẩm Bộ Y tế (2007) Thông tư 24/BYT ngày 19 tháng 11 năm 2012 Bộ trưởng Bộ Y tế việc quy định giới hạn tối đa dư lượng thực phẩm Chính phủ (2005) "Nghị định số 33/2005/ND-CP ngày 15/3/2005 Chính phủ quy định chi tiết thi hành số điều Pháp lệnh thú y." Cục An toàn thực phẩm (2011) "Tổng kết chương trình mục tiêu quốc gia an tồn thực phẩm giai đoạn 2006-2010 Hà Nội, ngày 23 tháng năm 2015." Cục Thú y (2016) Sản xuất thuốc thú y theo tiêu chuẩn GMP, NXB Nơng nghiệp 10 Đồn Thị Khang, Phạm Thanh Đạm, Dương Thị Thu Anh Đào Đức Hảo (2008) "ứng dụng kỹ thuật ELISA để xác định Clenbuterol Salbutamol thức ăn chăn nuôi." Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Chăn ni 13(8).tr 1-6 11 Nguyễn Thị Thanh Nga (2009) Ứng dụng ảnh hưởng Ciproflocaxin Enrofloxacin Luận Văn thạc sĩ Khoa Học – Hóa Học, Đại Học Quốc Gia, Thành phố Hồ Chí Minh 46 12 Tổng cục Hải quan (2016) Số liệu thống kê Nông lâm thủy sản 13 Trần Đáng (2007) An toàn thực phẩm, Nhà xuất Hà Nội 14 Triệu Nguyên Trung Lê Thạnh (2015) Thực trạng an toàn thực phẩm giới Việt Nam Truy cập ngày 12/5/2017 http://www.impe-qn.org.vn/impeqn/vn/portal/InfoPreview.jsp?ID=8608 15 Võ Thị Trà An (2001) Tình hình sử dụng kháng sinh dư lượng kháng sinh thịt gà sở chăn ni gà cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh, Đại Học Nơng Lâm, Thành phố Hồ Chí Minh Luận Văn thạc sĩ Khoa Học Nông Nghiệp, Đại Học Nơng Lâm, Thành phố Hồ Chí Minh 16 Võ Thị Trà An (2007) Kháng sinh cho vật nuôi, Nhà xuất Đà Nẵng Tài liệu tiếng Anh: 17 Adetosoye, A I (1986) "Carcass contamination and antibiotic residue in slaughtered cattle at Bodija abattoir and slaughter houses in Ibadan, Nigeria." Bulletin of animal health and production in Africa 34 pp 99-101 18 Algird, J R (1966) "The Allergic patient." Connecticut Medicine 30: 878-879 19 Black R E and Lanata C F (1995) "Epidemiology of diarrheal diseases in developing countries." Infections of the gastrointestinal tract pp 13-36 20 Bucknall, S D., MacKenzie, A L., Sauer, M J., Everest, D J., Newman, R., and Jackman, R (1993) "Determination of clenbuterol in bovine liver by enzyme immunoassay." Analytica Chimica Acta 275(1-2) pp 227-230 21 Degand, G., Bernes-Duyckaerts, A., Delahaut, P., and Maghuin-Rogister, G (1993) "Determination of β-agonists in urine by an enzyme immunoassay based on the use of an anti-salbutamol antiserum." Analytica Chimica Acta 275(1-2) pp 241247 22 DeWaal C S and Robert N (2005a) Global & Local: Food Safety Around the World Washington, D.C., Center for Science in the Public Interest 23 DeWaal C S and Robert N (2005b) North American Region: Food Safety Around the World Washington, D.C., Center for Science in the Public Interest 24 DeWaal C S and Robert N (2005c) European Region: Food Safety Around the World Washington, D.C., Center for Science in the Public Interest.s 25 DeWaal C S and Robert N (2005d) South East Asian Region: Food Safety Around the World Washington, D.C 47 26 EC (2002) "Commission Decision 2002/657/EC of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC." Official Journal of the European Community 221.pp 8-36 27 Gavigan S J and Knight B L (1981) "Catabolism of low-density lipoprotein by fibroblasts cultured in medium supplemented with saturated or unsaturated free fatty acids." Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism 665(3) pp 632-635 28 O'Keeffe, M (1999) Methods for veterinary drug residue analysis in food, Teagasc 29 Posyniak, A., Zmudzki, J., and Niedzielska, J (2003) "Evaluation of sample preparation for control of chloramphenicol residues in porcine tissues by enzymelinked immunosorbent assay and liquid chromatography." Analytica Chimica Acta 483(1) pp 307-311 30 Sande M A and Mandell G L (1985) Antimicrobial agents Tetracyclins, chloramphenicol, erythromycin, and miscellaneous agents In: The pharmacological basis of therapeutics, Macmillan Publishing Company, New York 31 Walton, J (1970) " Contamination of meat carcasses by antibiotic-resistant coliform bacteria." The Lancet 296(7672) pp 561-563 32 WHO (2002) WHO Global Strategy for Food Safety Geneva, Switzerland ss 33 WHO (2004) "Food Safety in Developing Countries-Building Capacity." Weekly Epidemiological Record 18(79) pp 173-180 34 WHO/SEARO (2008) Nutrition and Food Safety in the South-East Asia Region New Delhi, Report and Documentation of the Technical Discussions, New Delhi 48 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thời gian sản xuất, thời gian hết hạn cách bảo quản kit dùng nghiên cứu tính ổn định kit Lô kit Ngày hết hạn Bảo quản Lô 06/11/2017 2-80C Lô 11/04/2018 2-80C Lô 13/09/2017 2-80C Lô 2/111/2017 2-80C Lô 02/12/2017 2-80C Trong trường hợp khơng có dự định sử dụng kít vòng tháng nên bảo quản β-agonist antibody #1 100X HRB-conjugated antibody #2 -20 0C tủ âm Phụ lục Bộ kit ELISA Ciprofloxacin Max SignalTM (Bioo-scientific) 49 ... YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Ngơ Đức Dũng Tên luận văn: Nghiên cứu chuẩn hóa phương pháp phân tích dư lượng ciprofloxacin thịt lợn kỹ thuật ELISA phịng kiểm nghiệm Cơng ty Cổ phần Tập đoàn DABACO Việt. .. dụng phương pháp chuẩn hóa để kiểm sốt tồn dư Ciprofloxacin thịt lợn tươi Công ty Cổ phần Tập đồn DABACO Việt Nam Phương pháp: - Thí nghiệm nghiên cứu tính phù hợp kit ELISA dùng cho phân tích. .. nguời tiêu dùng, việc ? ?Nghiên cứu chuẩn hóa phương pháp phân tích dư lượng ciprofloxacin thịt lợn kỹ thuật elisa phịng kiểm nghiệm Cơng ty Cổ phần Tập đồn DABACO Việt Nam? ?? có ý nghĩa khoa học

Ngày đăng: 12/06/2021, 14:44

Mục lục

  • TRANG BÌA

  • MỤC LỤC

  • TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

  • THESIS ABSTRACT

  • PHẦN 1. MỞ ĐẦU

    • 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

    • 1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

  • PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

    • 2.1. TÌNH HÌNH AN TOÀN THỰC PHẨM

      • 2.1.1. Tình hình an toàn thực phẩm trên thế giới

      • 2.1.2. Tình hình an toàn thực phẩm ở Việt Nam

    • 2.2. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT CHĂN NUÔI Ở VIỆT NAM

      • 2.2.1. Sản xuất và tiêu thụ thịt ở Việt Nam

        • 2.2.1.1. Tình hình sản xuất thịt lợn ở Việt Nam

        • 2.2.1.2. Tiêu thụ thịt lợn ở Việt Nam

      • 2.2.2. Tình hình sản xuất, sử dụng, quản lý thuốc thú y trong chăn nuôi

        • 2.2.2.1. Tình hình sản xuất và sử dụng thuốc thú y

        • 2.2.2.2. Tình hình quản lý thuốc thú y trong chăn nuôi

    • 2.3. GIỚI THIỆU KHÁI QUÁT VỀ CÔNG TY CỔ PHẦN TẬP ĐOÀNDABACO VIỆT NAM

    • 2.4. NHỮNG HIỂU BIẾT CƠ BẢN VỀ KHÁNG SINH NHÓMFLUOROQUINOLONE

      • 2.4.1. Kháng sinh nhóm Fluoroquinolone

      • 2.4.2. Kháng sinh Ciprofloxacin

        • 2.4.2.1. Tính chất và cấu trúc của Ciprofloxacin

        • 2.4.2.2. Cơ chế tác dụng và phổ kháng khuẩn của Ciprofloxacin

        • 2.4.2.3. Sử dụng Ciprofloxacin trong chăn nuôi

    • 2.5. TỒN DƯ KHÁNG SINH TRONG THỊT LỢN VÀ ẢNH HƯỞNG CỦACHÚNG ĐỐI VỚI SỨC KHỎE CỘNG ĐỒNG

      • 2.5.1. Khái niệm về tồn dư

        • 2.5.1.1. Khái niệm về Giới hạn tồn dư tối đa (Maximum Residue Limit)

        • 2.5.1.2. Khái niệm về giới hạn phân tích tối thiểu của phương pháp (MinimumRequired Performance Limit)

        • 2.5.1.3. Khái niệm về lượng ăn vào hàng ngày chấp nhận được ADI(Acceptable Daily Intake)

        • 2.5.1.4. Thời gian ngưng thuốc là thời gian cần thiết

      • 2.5.2. Ảnh hưởng của tồn dư kháng sinh trong thực phẩm đối với sức khỏecộng đồng

    • 2.6. MỘT SỐ KỸ THUẬT PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG KHÁNG SINHTRONG THỰC PHẨM

      • 2.6.1. Khái niệm về ELISA

      • 2.6.2. Phân loại ELISA

      • 2.6.3. Ưu, nhược điểm của phương pháp phân tích định tính ELISA

      • 2.6.4. Một số yếu tố ảnh hưởng tới kết quả phân tích của phương pháp ELISA

      • 2.6.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ nhạy của phản ứng ELISA

  • PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

    • 3.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

      • 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu

      • 3.1.2. Địa điểm nghiên cứu

      • 3.1.3. Thời gian nghiên cứu

      • 3.1.4. Vật liệu, hóa chất và thuốc thử

        • 3.1.4.1. Chuẩn bị mẫu thịt lợn tươi âm tính và dương tính với Ciprofloxacin

        • 3.1.4.2. Hóa chất và thuốc thử dùng cho phân tích định tính

      • 3.1.5. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

    • 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

    • 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

      • 3.3.1. Thí nghiệm nghiên cứu tính phù hợp của kit ELISA dùng cho phântích định tính xác định Ciprofloxacin trong mẫu thịt lợn tươi

      • 3.3.2. Ứng dụng kết quả nghiên cứu của phương pháp để phân tích mẫu thực

        • 3.3.2.1. Phương pháp lấy mẫu

        • 3.3.2.2. Phân tích định tính Ciprofloxacin bằng kit ELISA

      • 3.3.3. Phương pháp phân tích số liệu

  • PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

    • 4.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TÍNH PHÙ HỢP CỦA KIT ELISA DÙNGCHO PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH XÁC ĐỊNH CIPROFLOXACIN TRONGTHỊT LỢN TƯƠI

      • 4.1.1. Kết quả nghiên cứu tính ổn định của kit ELISA

      • 4.1.2. Kết quả xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng củakit ELISA

      • 4.1.3. Kết quả nghiên cứu khả năng phát hiện của kit (CCβ)

      • 4.1.4. Kết quả xác định độ chính xác (Accuracy: AC), độ đặc hiệu(Specificity: SP), độ nhạy (Sensitivity: SE), độ lệch dương (Positivedeviation: PD) và độ lệch âm (negative deviation: ND

    • 4.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG CIPROFLOXACIN TRONGMẪU THỊT LỢN TƯƠI BẰNG KIT ELISA

  • PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

    • 5.1. KẾT LUẬN

    • 5.2. KIẾN NGHỊ

  • TÀI LIỆU THAM KHẢO

    • Tài liệu tiếng Việt

    • Tài liệu tiếng Anh

  • PHỤ LỤC

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan