Khả năng hình thành màng sinh học và tính kháng kháng sinh của vibrionaceae phân lập từ tôm trong các hệ thống nuôi thuộc khu vực tỉnh khánh hòa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG - - ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢ NĂNG HÌNH THÀNH MÀNG SINH HỌC VÀ TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VIBRIONACEAE PHÂN LẬP TỪ TÔM TRONG CÁC HỆ THỐNG NUÔI THUỘC KHU VỰC TỈNH KHÁNH HÕA Giảng viên hƣớng dẫn : ThS Văn Hồng Cầm TS Nguyễn Thị Anh Thƣ Sinh viên thực : Phạm Thị Thu Hằng Mã số sinh viên : 58131182 Khánh Hòa: 2020 TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢ NĂNG HÌNH THÀNH MÀNG SINH HỌC VÀ TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VIBRIONACEAE PHÂN LẬP TỪ TÔM TRONG CÁC HỆ THỐNG NUÔI THUỘC KHU VỰC TỈNH KHÁNH HÕA GVHD: ThS Văn Hồng Cầm TS Nguyễn Thị Anh Thƣ SVTH: Phạm Thị Thu Hằng MSSV: 58131182 Khánh Hòa, tháng 8/2020 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đề tài ―Khả hình thành màng sinh học tính kháng kháng sinh Vibrionaceae phân lập từ tôm hệ thống nuôi thuộc khu vực tỉnh Khánh Hịa‖ cơng trình nghiên cứu khoa học độc lập riêng Các số liệu kết đề tài trung thực, khách quan Mọi giúp đỡ cho việc thực đồ án đƣợc cảm ơn thông tin trích dẫn cho đồ án đƣợc ghi nguồn gốc rõ ràng đƣợc phép công bố Sinh viên thực Phạm Thị Thu Hằng i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới ThS Văn Hồng Cầm TS Nguyễn Thị Anh Thƣ – giảng viên thuộc Viện Công nghệ Sinh học Môi trƣờng, trƣờng Đại học Nha Trang, định hƣớng bảo tận tình nhƣ quan tâm, động viên suốt thời gian thực đồ án tốt nghiệp Cảm ơn quý thầy cô Viện Công nghệ Sinh học Môi trƣờng, trƣờng Đại học Nha Trang dành tâm huyết giảng dạy để trang bị kiến thức cho chúng tơi suốt khóa học Tơi xin cảm ơn nhân viên/cán phịng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học tạo điều kiện để tơi hồn thành đề tài Đồng thời xin cảm ơn bạn em làm chung phịng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học nhiệt tình giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Cuối tơi xin cảm ơn đến gia đình bạn thuộc tập thể lớp 58CNSH bên động viên chia khó khăn, giúp đỡ tơi trình học tập rèn luyện trƣờng Đại học Nha Trang Tôi xin chân thành cảm ơn! ii TĨM TẮT Tơm động vật thủy sản có giá trị kinh tế cao Tuy nhiên, nghề nuôi tôm đối mặt với đợt dịch bệnh gây thiệt hại nặng nề cho ngƣời ni nên việc sử dụng kháng sinh để điều trị bệnh trở nên tất yếu Nghiên cứu tập trung vào việc phân lập, định danh, xác định tính kháng kháng sinh khả hình thành màng sinh học (biofilm) Vibrionaceae từ mẫu tôm hệ thống nuôi thuộc khu vực tỉnh Khánh Hòa Kết định danh phƣơng pháp hóa sinh sinh học phân tử cho thấy có 34 chủng 55 chủng phân lập đƣợc Vibrio parahaemolyticus Khảo sát khả kháng kháng sinh khả hình thành màng sinh học 72 chủng vi khuẩn (bao gồm 55 chủng phân lập 17 chủng vi khuẩn phát sát đƣợc nhận từ sƣu tập vi sinh vật Phịng thí nghiệm, Viện Công nghệ Sinh học Môi trƣờng, trƣờng Đại học Nha Trang) cho thấy tính kháng cao với Streptomycin (77,78%) Cefotaxime (36,11%); nhạy cảm cao với Azithromycin (98,61%), Florfenicol (94,44%), Docyxycline (91,67%) Chloramphenicol (90,28%) Đối với khả hình thành màng sinh học, kết có 66,67% chủng có khả sinh hình thành biofilm 5,56% sinh biofilm yếu, 15,28% sinh biofilm trung bình 45,83% sinh biofilm mạnh Đồng thời nghiên cứu cho thấy khả kháng kháng sinh có mối tƣơng quan đến hình thành màng sinh học Từ khóa: màng sinh học, kháng kháng sinh, Vibrio parahaemolyticus iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii MỤC LỤC iv DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH ẢNH viii DANH MỤC VIẾT TẮT x MỞ ĐẦU xii CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Kháng sinh 1.1.1 Lịch sử kháng sinh 1.1.2 Cơ chế tác động kháng sinh 1.2 Kháng kháng sinh 1.2.1 Cơ chế kháng kháng sinh 1.2.2 Cơ chế lan truyền kháng kháng sinh 10 1.3 Màng sinh học (biofilm) 12 1.3.1 Lịch sử khái niệm màng sinh học (biofilm) 12 1.3.2 Các giai đoạn phát triển màng sinh học 13 1.3.3 Một số phƣơng pháp phát màng sinh học 14 1.4 Ngành tôm kháng kháng sinh ngành tơm 19 1.4.1 Tình hình nuôi tôm giới Việt Nam 19 iv 1.4.2 Tình hình sử dụng kháng sinh nuôi trồng tôm 22 1.5 Tình hình nghiên cứu kháng kháng sinh ni tơm khả hình thành màng sinh học 25 1.6 Phƣơng pháp phân tích thành phần (Principal component analysis – PCA) 27 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 31 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 31 2.3 Dụng cụ, môi trƣờng thiết bị 31 2.3.1 Dụng cụ 31 2.3.2 Môi trƣờng 32 2.3.3 Thiết bị 32 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 33 2.4.1 Phƣơng pháp chung 33 2.4.2 Phƣơng pháp thu mẫu 35 2.4.3 Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn 36 2.5 Phƣơng pháp xác định đặc điểm hình thái sinh hóa chủng vi khuẩn 37 2.5.1 String test 37 2.5.2 Nhuộm Gram 38 2.5.3 Catalase 38 2.5.3 Oxidase 39 2.5.4 Thử nghiệm khả di động 39 v 2.5.5 Thử nghiệm KIA 39 2.6 Định danh vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus cách xác định gen độc tố toxR nhờ kỹ thuật PCR 41 2.6.1 Phƣơng pháp tách chiết DNA 41 2.6.2 Phản ứng PCR 42 2.7 Khảo sát khả kháng kháng sinh chủng vi khuẩn 43 2.8 Khảo sát khả hình thành biofilm chủng vi khuẩn 48 2.9 Phân tích liệu 49 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50 3.1 Kết phân lập chủng vi sinh vật từ mẫu tôm 50 3.2 Kết kiểm tra hình thái sinh hóa chủng vi sinh phân phân lập đƣợc 54 3.3 Định danh vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 56 3.4 Khả kháng kháng sinh chủng vi sinh vật phân lập 57 3.5 Mối tƣơng quan khả kháng kháng sinh việc hình thành biofilm 65 CHƢƠNG KẾT LUẬN 69 4.1 Kết luận 69 4.2 Kiến nghị 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO 70 PHỤ LỤC PL1 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Mồi đặc hiệu đƣợc sử dụng phản ứng PCR 42 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 42 Bảng 2.3 Chu kì phản ứng PCR 43 Bảng 2.4 Tiêu chuẩn xác định nhạy cảm (S), đề kháng trung gian (I) hay đề kháng (R) 47 Bảng 3.1 Thông tin chủng vi khuẩn phân lập bao gồm mã, nguồn phân lập, thời gian vị trí phân lập 52 Bảng 3.2 Đặc điểm chủng vi khuẩn phân lập đƣợc 54 Bảng 3.3 Kết tổng hợp khả kháng kháng sinh tất vi khuẩn thí nghiệm 58 Bảng 3.4 Kết kháng kháng sinh vi khuẩn phân lập từ nguồn tôm khác tôm hùm (Panulirus spp.), tôm sú (P monodon) tôm thẻ (L vannamei) 63 Bảng 3.5 Kết mức độ hình thành biofilm chủng 67 vii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình thái nấm Penicillium notatum Hình 1.2 Cơ chế tác động kháng sinh Hình 1.3 Cấu tạo thành tế bào vi khuẩn Gram dƣơng vi khuẩn Gram âm Hình 1.4 Cơ chế kháng kháng sinh màng sinh học 10 Hình 1.5 Hình thức vận chuyển vật chất di truyền bao gồm biến nạp, tải nạp tiếp hợp 11 Hình 1.6 Mảng bám hình thành 12 Hình 1.7 Quá trình hình thành màng biofilm 14 Hình 1.8 Khuẩn lạc có màu đen mơi trƣờng CRA có hình thành màng sinh học 15 Hình 1.9 Thành đáy ống nghiệm bắt màu thuốc nhuộm safanine 16 Hình 1.10 Kết kiểm tra khả hình thành màng sinh học sau nhuộm Crystal violet đĩa 96 giếng 17 Hình 1.11 Các quốc gia sản xuất tôm hàng đầu giới 19 Hình 1.12 Sản lƣợng ni trồng thủy khai thác thủy sản Việt Nam 21 Hình 1.13 Số lô tôm bị từ chối bị từ chối diện thuốc kháng sinh bị cấm dƣ lƣợng thuốc kháng sinh khác từ năm 2010-2019 24 Hình 1.14 Số lần từ chối lô tôm xuất tồn dƣ lƣợng kháng sinh bị cấm vƣợt mức cho phép từ năm 2010-2018 25 Hình 1.15 Các bƣớc tiến hành PCA 30 Hình 2.1 Tổng quát bƣớc đƣợc tiến hành nghiên cứu 34 Hình 2.2 Vị trí khu vực thu mẫu đảo Bình Ba, Cam Ranh huyện Vạn Ninh 35 Hình 2.3 Các mẫu tôm thẻ, tôm sú, tôm hùm tôm hùm xanh 36 Hình 2.4 Quá trình thu mẫu tơm thẻ đìa ni tơm huyện Vạn Ninh, tỉnh Khánh Hòa 36 Hình 2.5 Phƣơng pháp cấy ria ba chiều để phân lập vi khuẩn 37 viii 33 Gilbert P., Allison D., and Lambert P (2002), Antibiotics that act on nucleic acids and protein biosynthesis, In: Mol Med Micro., San Diego, California 34 Halebian, S., Harris, B., Finegold, S M., and Rolfe, R D (1981), Rapid method that aids in distinguishing gram-positive from gram-negative anaerobic bacteria, Journal of Clinical Microbiology, 13: 444–448 35 Hawkey, P M (2003), Mechanisms of quinolone action and microbial response, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 51(SUPPL 1): 29–35 https://doi.org/10.1093/jac/dkg207 36 Hedberg, N., Stenson, I., Nitz Pettersson, M., Warshan, D., Nguyen-Kim, H., Tedengren, M., and Kautsky, N (2018), Antibiotic use in Vietnamese fish and lobster sea cage farms; implications for coral reefs and human health, Aquaculture, 495(August): 366–375 https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2018.06.005 37 J, G., AB, K., A, B., WV, L., B, C., P, B., and Indian (2013), Association of biofilm production with multidrug resistance among clinical isolates of Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa from intensive care unit, Indian Journal of Critical Care Medicine, 17(4): 214 38 Jamal, M., Tasneem, U., Hussain, T., and Andleeb, S (2015), Bacterial biofilm: Its composition, formation and role in human infections, Research and Reviews: Journal of Microbiology and Biotechnology, 4(3) 39 John, G H., Noel, R K., Peter, H A S., James, T S., and Stanley, T W (1994), Bergey’s manual of determinative bacterial 9th Edition 40 Johnston, N J., Mukhtar, T A., and Wright, G D (2005), Streptogramin Antibiotics: Mode of Action and Resistance, Current Drug Targets, 3(4): 335–344 https://doi.org/10.2174/1389450023347678 41 Kapoor, G., Saigal, S., and Elongavan, A (2017), Action and resistance mechanisms of antibiotics: A guide for clinicians, Journal of Anaesthesiology Clinical Pharmacology, 33(3): 300–305 https://doi.org/10.4103/joacp.JOACP 74 42 Kim, Y B., Okuda, J., Matsumoto, C., Takahashi, N., Hashimoto, S., and Nishibuchi, M (1999), Identification of Vibrio parahaemolyticus strains at the species level by PCR targeted to the toxR gene, Journal of Clinical Microbiology, 37(4): 1173–1177 https://doi.org/10.1128/jcm.37.4.1173-1177.1999 43 Kırmusaoğlu, S (2019), The Methods for Detection of Biofilm and Screening Antibiofilm Activity of Agents, Antimicrobials, Antibiotic Resistance, Antibiofilm Strategies and Activity Methods, 1–17 https://doi.org/10.5772/intechopen.84411 44 Kırmusaoğlu, S., Gareayaghi, N., and Kocazeybek, B S (2019), Introductory Chapter: The Action Mechanisms of Antibiotics and Antibiotic Resistance, Antimicrobials, Antibiotic Resistance, Antibiofilm Strategies and Activity Methods, 1–9 https://doi.org/10.5772/intechopen.85211 45 Kourkouta, L., Tsaloglidou, A., Koukourikos, K., Iliadis, C., Plati, P., and Dimitriadou, A (2016), History of antibiotics research, Current Topics in Microbiology and Immunology, 398(January): 237–272 https://doi.org/10.1007/82_2016_499 46 Kumar, A., and Schweizer, H P (2005), Bacterial resistance to antibiotics: Active efflux and reduced uptake, Advanced Drug Delivery Reviews, 57(10): 1486–1513 https://doi.org/10.1016/j.addr.2005.04.004 47 Kwon, A S., Park, G C., Ryu, S Y., Lim, D H., Lim, D Y., Choi, C H., Yoonkyung Park, and Lim, Y (2008), Higher biofilm formation in multidrugresistant clinical isolates of Staphylococcus aureus, International Journal of Antimicrobial Agents, 32(1): 68–72 48 Leach K.L., Swaney S.M., Colca J.R., McDonald W.G., Blinn J.R., Thomasco L.M., Gadwood R.C., Shinabarger D., Xiong L., Mankin A.S (2007), The site of action of oxazolidinone antibiotics in living bacteria and in human mitochondria, Mol Cell, 26: 393–402 49 Li, R., Chiou, J., Chan, E., and Chen, S (2016), A Novel PCR-Based Approach for 75 Accurate Identification of Vibrio parahaemolyticus, Frontiers in Microbiology, https://doi.org/10.3389/fmicb.2016.00044 50 Manjusha., Sarita G.B., Elyas K.K and Chandrasekaran M, (2005), Multiple Antibiotic Resistances of Vibrio Isolates from Coastal and Brackish Water Areas, American Journal of Biochemistry and Biotechnology, 1(4): 193-198 51 McManus M.C (1997), Mechanisms of bacterial resistance to antimicrobial agents, Am J Heal Syst Pharm., 54: 1420 –1433 52 McDermott, P F., Walker, R D., and White, D G (2003), Antimicrobials An Resistance Mechanisms, International Journal of Toxicology, 22: 135–143 https://doi.org/10.1080/10915810390198410 53 McMurry, L., Petrucci, R E., and Levy, S B (1980), Active efflux of tetracycline encoded by four genetically different tetracyline resistance determinants in Escherichia coli, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 77(7 II): 3974–3977 https://doi.org/10.1073/pnas.77.7.3974 54 Munita, J M., and Arias, C A (2016), Mechanisms of antibiotic resistance, Microbiol Spectrum, 4(2) https://doi.org/10.1142/9789813209558_0015 55 O’Shea, R., and Moser, H E (2008), Physicochemical properties of antibacterial compounds: Implications for drug discovery, Medicinal Chemistry Society, 51(10): 2871–2878 https://doi.org/10.1021/jm700967e 56 O’Toole, G A (2010), Microtiter dish Biofilm formation assay, Journal of Visualized Experiments, 47: 3–5 https://doi.org/10.3791/2437 57 O’Toole, G A., and Kolter, R (1998), Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis, Mol Microbiol, 28: 449 58 Ojamaa, P (2018), Research for PECH Committee - Fisheries in Vietnam October, 34 http://www.europarl.europa.eu/RegData/etudes/IDAN/2018/629175/IPOL_IDA(20 76 18)629175_EN.pdf 59 Ooi, M C., Goulden, E F., Smith, G G., and Bridle, A R (2019), Haemolymph microbiome of the cultured spiny lobster Panulirus ornatus at different temperatures, Scientific Reports, 9(1): 1677 https://doi.org/10.1038/s41598-01939149-7 60 Organization, W H (2014), Antimicrobial resistance: global report on surveillance, https://doi.org/10.1136/ejhpharm-2018-001820 61 Rabin, N., Zheng, Y., Opoku-Temeng, C., Du, Y., Bonsu, E., and Sintim, H O (2015), Biofilm formation mechanisms and targets for developing antibiofilm agents, Future Medicinal Chemistry, 7(4): 493–512 https://doi.org/10.1021/ie50495a015 62 Raissy, M., Moumeni, M., Ansari, M., and Rahimi, E (2012), Antibiotic resistance pattern of some Vibrio strains isolated from seafood, Iranian Journal of Fisheries Sciences, 11(3): 618–620 63 Rampelotto, R F., Lorenzoni, V V., Silva, D da C., Coelho, S S., Wust, V., Garzon, L R., Nunes, M S., Meneghetti, B., Brites, P C., Hörner, M., and Hörner, R (2018), Assessment of different methods for the detection of biofilm production in coagulase-negative staphylococci isolated from blood cultures of newborns Revista Da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 51(6): 761–767 https://doi.org/10.1590/0037-8682-0171-2018 64 Reygaert, W C (2018), An overview of the antimicrobial resistance mechanisms of bacteria, AIMS Microbiology, 4(3): 482–501 65 Sharma, D., Misba, L., and Khan, A U (2019), Antibiotics versus biofilm: An emerging battleground in microbial communities, Antimicrobial Resistance and Infection Control, 8(76): 1–10 https://doi.org/10.1186/s13756-019-0533-3 66 Soowannayan, C., Boonmee, S., Puckcharoen, S., Anatamsombat, T., Yatip, P., Ng, W K., Thitamadee, S., Tuchinda, P., Munyoo, B., Chabang, N., Nuangsaeng, 77 B., Sonthi, M., and Withyachumnarnkul, B (2019), Ginger and its component shogaol inhibit Vibrio biofilm formation in vitro and orally protect shrimp against acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND), Aquaculture, 504: 139–147 https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2019.02.007 67 Stepanović, S., Vuković, D., Dakić, I., Savić, B., and Švabić-Vlahović, M (2000), A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation, J Microbiol Methods, 40 68 Storm, D., Rosentha, K., and Swanson, P (1977), Polymyxin and related peptide antibiotics, Antibiotics Annual Review of Biochemistry, 46(1): 723–763 69 Strohl W.R (1997), Biotechnology of Antibiotics, Mar Dek Inc., New York, USA., 577–658 70 Tan, S Y., and Tatsumura, Y (2015), Alexander Fleming (1881–1955): Discoverer of penicillin, Singapore Medical Journal, 56(7): 366–367 https://doi.org/10.11622/smedj.2015105 71 Thornber, K., Verner-Jeffreys, D., Hinchliffe, S., Rahman, M M., Bass, D., and Tyler, C R (2020), Evaluating antimicrobial resistance in the global shrimp industry, Reviews in Aquaculture, 12(2): 966–986 https://doi.org/10.1111/raq.12367 72 The New York Times (1945), Penicillin’s finder assays its future, 21 73 Tran, K C., Tran, M P., Phan, T Van, and Dalsgaard, A (2018), Quality of antimicrobial products used in white leg shrimp (Litopenaeus vannamei) aquaculture in Northern Vietnam, Aquaculture, 482: 167–175 https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2017.09.038 74 Verderosa, A D., Totsika, M., and Fairfull-Smith, K E (2019), Bacterial Biofilm Eradication Agents: A Current Review, Frontiers in Chemistry, 7: 824 https://doi.org/10.3389/fchem.2019.00824 75 Watts, J L., Sweeney, M T., and Lubbers, B V (2018), Antimicrobial 78 Susceptibility Testing of Bacteria of Veterinary Origin, Microbiology Spectrum, 6(2) https://doi.org/10.1128/microbiolspec.arba-0001-2017 76 Xu, X., Cheng, J., Wu, Q., Zhang, J., and Xie, T (2016), Prevalence, characterization, and antibiotic susceptibility of Vibrio parahaemolyticus isolated from retail aquatic products in North China, BMC Microbiology, 16(32) https://doi.org/10.1186/s12866-016-0650-6 77 Yoneyama, H., and Katsumata, R (2006), Antibiotic resistance in bacteria and its future for novel antibiotic development, Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 70(5), 1060–1075 https://doi.org/10.1271/bbb.70.1060 Tài liệu Internet 78 Cần chấm dứt sử dụng kháng sinh cấm nuôi trồng thủy sản Hội Nơng Dân Việt Nam - Tiếng Nói Nhà Nơng Truy cập 26-05-2020 http://tnnn.hoinongdan.org.vn/sitepages/news/1091/44297/can-cham-dut-su-dungkhang-sinh-cam-trong-nuoi-trong-thuy-san 79 Tổng quan ngành thủy sản Việt Nam Truy cập 26-05-2020, VASEP website http://vasep.com.vn/1192/OneContent/tong-quan-nganh.htm 80 Khánh Hòa thả nuôi 600ha tôm nƣớc lợ vụ đầu năm Truy cập 26-05-2020, VASEP website: http://vasep.com.vn/Tin-Tuc/1202_59134/Khanh-Hoa-tha-nuoihon-600ha-tom-nuoc-lo-vu-dau-nam.htm 79 PHỤ LỤC Phụ lục Kết kháng sinh đồ 72 chủng vi khuẩn H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 AMK30 17 16 19 19 17 16 20 20 18 19 20 17 20 18 15 18 20 15 16 17 AZM15 21 19 23 24 25 24 22 22 24 22 21 19 22 22 20 20 20 20 19 21 C30 27 24 30 26 28 23 29 26 26 28 26 18 26 24 22 24 24 24 25 25 CIP5 21 20 24 24 23 20 28 23 22 24 29 23 23 19 20 22 19 22 22 23 CLR15 20 18 22 20 20 20 28 20 21 20 19 19 20 18 16 19 21 15 17 19 CN10 18 16 19 19 17 17 21 19 17 19 18 21 19 17 15 18 20 14 17 17 CTX30 25 24 28 30 25 26 28 26 27 27 28 27 26 24 21 21 23 21 26 25 DO30 20 21 22 22 23 22 21 22 20 23 22 22 22 20 18 19 20 20 20 20 E15 12 15 21 19 20 19 17 18 20 17 20 19 18 17 15 18 19 17 16 17 ERN5 20 18 22 21 22 21 23 21 22 22 20 24 22 18 23 20 0 20 18 FFC30 27 25 29 25 26 21 27 19 26 26 27 28 21 25 23 23 24 23 26 26 SXT25 22 21 21 20 21 21 22 21 23 22 23 24 21 19 17 23 20 19 19 19 S10 11 17 15 18 17 10 10 15 10 9 11 10 TE30 15 17 20 16 18 17 16 15 17 15 16 15 16 15 18 11 16 17 PL1 H12 H13 H14 H15 H16 H17 H18 H19 H20 H21 H22 H23 V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 V11 V12 V13 V14 V15 V16 V17 AMK30 16 18 21 20 17 19 18 18 17 15 17 18 29 18 22 20 17 16 19 15 AZM15 23 23 22 22 19 23 20 25 21 18 18 20 22 16 22 21 20 16 20 15 C30 23 29 24 28 30 27 25 22 25 31 26 25 34 23 28 28 27 23 24 21 CIP5 21 24 17 25 26 22 21 20 17 32 21 23 32 21 26 32 25 21 22 19 CLR15 20 20 20 19 20 20 18 20 17 17 15 17 18 16 18 19 16 14 17 15 CN10 15 17 18 22 16 17 18 18 16 17 16 17 24 18 22 21 17 16 17 14 CTX30 22 29 21 26 26 26 23 25 23 29 22 26 34 23 32 28 25 21 26 21 DO30 19 20 20 24 23 24 22 21 22 24 22 21 26 19 25 20 26 18 20 18 E15 18 19 17 17 15 18 15 17 18 16 15 16 17 15 13 14 14 14 14 11 ERN5 15 21 19 22 24 20 19 20 20 31 16 20 32 20 22 36 20 19 16 10 FFC30 25 29 23 27 26 26 26 25 24 29 25 22 28 22 27 26 26 21 21 21 SXT25 19 25 19 22 20 20 20 20 19 24 20 18 20 16 20 20 17 18 19 17 S10 10 10 11 10 18 15 20 11 10 12 TE30 16 19 17 16 16 18 19 13 14 15 18 16 15 22 20 11 12 10 PL2 V18 V19 V20 V21 V22 V23 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 AMK30 16 18 20 18 15 AZM15 14 18 27 22 C30 28 28 26 CIP5 24 23 CLR15 17 CN10 15 18 19 18 22 24 15 17 19 20 20 16 19 22 20 22 19 19 25 24 25 22 15 20 29 12 25 19 20 22 25 25 27 37 17 22 22 22 12 21 15 28 13 17 23 17 18 23 23 25 29 18 25 20 21 29 17 22 24 35 25 14 13 20 20 20 25 20 22 24 19 23 21 22 15 16 18 21 12 20 27 17 21 21 20 16 21 18 15 16 15 14 20 17 22 18 16 18 20 19 20 22 16 19 CTX30 30 28 28 24 26 30 0 13 25 28 26 DO30 22 21 22 20 24 27 11 15 20 18 12 15 19 22 10 10 20 19 10 17 E15 13 17 24 20 19 16 16 21 20 19 16 13 20 0 17 13 19 20 ERN5 23 25 21 18 16 28 20 22 19 21 20 19 19 18 15 17 14 21 21 20 FFC30 18 27 29 25 30 30 22 26 27 27 22 23 27 0 26 30 26 26 SXT25 22 22 25 20 20 24 0 12 0 0 28 0 26 0 S10 12 21 11 0 17 10 9 10 0 13 TE30 12 15 23 16 15 19 16 12 19 18 10 14 14 15 15 14 11 19 PL3 A12 A13 A14 AMK30 AZM15 C30 CIP5 CLR15 CN10 CTX30 DO30 E15 ERN5 FFC30 SXT25 S10 TE30 A15 A16 A17 21 19 23 23 20 20 28 27 18 18 19 11 21 20 20 19 20 20 29 25 23 25 25 20 17 17 17 20 15 13 28 29 25 22 29 11 17 15 16 A18 A19 A20 A21 A22 A23 A24 A25 A26 15 16 20 15 15 15 22 20 16 20 18 17 19 16 20 22 26 21 24 18 18 25 21 25 18 29 14 15 11 16 20 20 21 19 20 17 17 20 12 16 13 18 18 24 14 15 17 14 14 14 14 16 20 18 22 23 20 20 21 27 15 16 19 16 20 20 21 23 16 13 16 12 17 17 16 15 21 15 12 10 12 17 17 19 17 22 21 21 26 20 23 23 20 23 27 10 0 19 19 20 12 12 14 11 10 10 10 10 14 19 10 21 PL4 Phụ lục Kết đo OD 72 chủng khả hình thành biofilm CODE H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 H12 H13 H14 H15 H16 H17 H18 H19 H20 H21 H22 H23 V1 OD lần 0.234 0.578 0.022 0.077 0.009 0.01 0.161 0.018 0.19 0.031 0.041 0.024 0.022 0.266 1.077 0.464 0.621 0.618 0.65 0.98 0.745 0.437 0.52 0.024 OD lần 0.236 0.574 0.024 0.077 0.011 0.018 0.157 0.024 0.194 0.031 0.043 0.022 0.02 0.26 1.071 0.466 0.617 0.616 0.654 0.976 0.749 0.437 0.518 0.026 OD tb 0.235 0.576 0.023 0.077 0.01 0.014 0.159 0.021 0.192 0.031 0.042 0.023 0.021 0.263 1.074 0.465 0.619 0.617 0.652 0.978 0.747 0.437 0.519 0.025 CODE V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 V11 V12 V13 V14 V15 V16 V17 V18 V19 V20 V21 V22 V23 A1 A2 OD lần 0.016 0.007 0.02 0.008 0.018 0.152 0.209 0.07 0.118 0.205 0.117 0.134 0.038 0.188 0.046 0.27 0.065 0.053 0.555 0.628 0.298 0.023 0.194 0.813 PL5 OD lần 0.02 0.005 0.02 0.008 0.02 0.154 0.209 0.072 0.12 0.175 0.133 0.142 0.034 0.178 0.046 0.272 0.055 0.053 0.559 0.628 0.298 0.025 0.19 0.809 OD tb 0.018 0.006 0.02 0.008 0.019 0.153 0.209 0.071 0.119 0.19 0.125 0.138 0.036 0.183 0.046 0.271 0.06 0.053 0.557 0.628 0.298 0.024 0.192 0.811 CODE A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17 A18 A19 A20 A21 A22 A23 A24 A25 A26 OD lần 0.077 0.176 0.121 0.608 0.083 0.107 0.592 0.531 0.125 0.813 0.133 0.027 0.008 0.014 0.035 0.146 0.134 0.207 0.273 0.438 0.112 0.301 0.153 0.05 OD lần 0.065 0.172 0.121 0.604 0.081 0.109 0.592 0.529 0.125 0.811 0.133 0.019 0.008 0.012 0.035 0.152 0.136 0.205 0.271 0.44 0.11 0.303 0.151 0.052 OD tb 0.071 0.174 0.121 0.606 0.082 0.108 0.592 0.53 0.125 0.812 0.133 0.023 0.008 0.013 0.035 0.149 0.135 0.206 0.272 0.439 0.111 0.302 0.152 0.051 Mẫu đối chứng: OD lần OD lần OD lần OD tb SD ODc 0.014 0.022 0.019 0.018333 0.004041 0.030458 PL6 Phụ lục Dữ liệu sử dụng phân tích thành phần (PCA) CODE R I S H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 H12 H13 H14 H15 H16 H17 H18 H19 H20 H21 H22 H23 V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 1 0 0 1 1 2 3 1 1 3 2 3 2 2 2 4 3 5 2 1 4 4 8 11 12 11 10 13 12 11 11 11 11 12 9 11 12 12 10 9 13 PL7 Biofilm (ODs) 0.204542 0.545542 -0.00746 0.046542 -0.02046 -0.01646 0.128542 -0.00946 0.161542 0.000542 0.011542 -0.00746 -0.00946 0.232542 1.043542 0.434542 0.588542 0.586542 0.621542 0.947542 0.716542 0.406542 0.488542 -0.00546 -0.01246 -0.02446 -0.01046 -0.02246 -0.01146 0.122542 0.178542 0.040542 0.088542 V11 V12 V13 V14 V15 V16 V17 V18 V19 V20 V21 V22 V23 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17 A18 A19 A20 A21 A22 A23 A24 A25 A26 0 2 7 5 2 5 5 2 4 4 2 2 2 3 PL8 12 13 11 13 10 11 8 10 5 10 10 7 5 10 0.159542 0.094542 0.107542 0.005542 0.152542 0.015542 0.240542 0.029542 0.022542 0.526542 0.597542 0.267542 -0.00646 0.161542 0.780542 0.040542 0.143542 0.090542 0.575542 0.051542 0.077542 0.561542 0.499542 0.094542 0.781542 0.102542 -0.00746 -0.02246 -0.01746 0.004542 0.118542 0.104542 0.175542 0.241542 0.408542 0.080542 0.271542 0.121542 0.020542 PL9 ... đoan đề tài ? ?Khả hình thành màng sinh học tính kháng kháng sinh Vibrionaceae phân lập từ tôm hệ thống nuôi thuộc khu vực tỉnh Khánh Hịa‖ cơng trình nghiên cứu khoa học độc lập riêng Các số liệu... xác định tính kháng kháng sinh khả hình thành màng sinh học (biofilm) Vibrionaceae từ mẫu tôm hệ thống nuôi thuộc khu vực tỉnh Khánh Hòa Kết định danh phƣơng pháp hóa sinh sinh học phân tử cho... ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢ NĂNG HÌNH THÀNH MÀNG SINH HỌC VÀ TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VIBRIONACEAE PHÂN LẬP