Xác định khả năng của vi sinh vật chuyển hóa các acid amin chứa lưu huỳnh trong điều kiện kỵ khí sinh H2S, tạo chất kết tủa màu đen. Có nhiều cách phát hiện khả năng sinh H2S nhưng ph[r]
(1)CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA
- Sau nuôi cấy môi
trường chọn lọc, môi trường phân biệt thu khuẩn lạc
đơn khiết kỹ thuật phân lập
(2)CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA
Việc định danh:
- Các đặc điểm hình thái
(3)(4)Kết quả:
(5)(6)CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA
Có ba cách tiếp cận để thực thử nghiệm sinh hóa dùng cho
mục đích định danh
1) Cách truyền thống 2) Sử dụng kit
(7)CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA
Các kết thử nghiệm sinh hóa hàng
trăm lồi vi sinh vật tổng hợp thành
những Bảng sinh hóa định danh vi sinh
vật.
Bảng bao gồm đặc điểm sinh hóa đặc
trưng để phân biệt loài vi sinh vật gây bệnh thường gặp Mỗi đặc điểm sinh hóa biểu thị trị số tỷ lệ phần trăm thử nghiệm sinh hóa cho kết
(8)CÁC THỬ NGHIỆM SINH HĨA
Các đặc điểm sinh hóa có trị số dao động mức
50% khơng có giá trị việc định danh.
Trong thực tế kiểm nghiệm, kết thử
nghiệm sinh hóa biểu thị qui ước ký hiệu như:
(+) : dương tính
(-) : âm tính
(+/-) : khoảng 70% dương tính
(-/+) : khoảng 70% âm tính.
Trong thử nghiệm này, để đảm bảo
(9)1.Thử nghiệm phép thử catalase
1.1.Nguyên tắc
- Các vi sinh vật hiếu khí kỵ khí tùy tiện chứa chuỗi truyền điện tử có cytochrome
đều có enzyme catalase, có khả biến dưỡng lượng theo phương thức hô hấp với oxy tạo H2O2
- Catalase thủy phân H2O2 thành H2O O2, ngăn cản tích tụ phân tử có độc tính cao này tế bào
(10)1.Thử nghiệm phép thử catalase
(11)1.Thử nghiệm phép thử catalase
1.2.Tiến hành
Hóa chất sử dụng:
- Dung dịch H2O2 30% giữ tủ lạnh với chai màu nâu tránh ánh sáng
- Dung dịch đệm phosphate pH 7,0.
Có thể thực thử nghiệm catalase bằng phương pháp sau:
- Thử phiến kính (lame)
(12)1.Thử nghiệm phép thử catalase
1.2.Tiến hành
- Thử phiến kính (lame)
(13)1.Thử nghiệm phép thử catalase
1.2.Tiến hành
- Thử phiến kính (lame): dùng que cấy lấy một sinh khối từ khuẩn lạc đặt
phiến kính Nhỏ giọt H2O2 30% lên sinh
(14)1.Thử nghiệm phép thử catalase
1.2.Tiến hành
(15)1.Thử nghiệm phép thử catalase
1.2.Tiến hành
- Thử ống mao dẫn: dùng ống mao dẫn
thu lấy dung dịch H2O2 30%, sau chấm đầu ống mao dẫn vào tâm khuẩn lạc cần thử mơi trường Ghi nhận có sủi bọt khí ống
mao dẫn Phương pháp có ưu điểm thử trên khuẩn lạc nên thực
(16)1.Thử nghiệm phép thử catalase
1.3.Đọc kết quả
- Dương tính (+) : có tượng sủi bọt khí khí O2 tạo ra. - Âm tính (-) : khơng có tượng sủi bọt khí.
(17)
2.Thử nghiệm Urease
2.1.Nguyên tắc
- Xác định khả vi sinh vật tổng
hợp enzyme urease xúc tác thủy phân
urea tạo nguyên tử NH3 CO2 làm tăng pH mơi trường
theo dõi qua thay đổi màu chất thị pH.
(18)(19)(20)2.Thử nghiệm urease
Thử nghiệm Urease thực môi trường:
- Môi trường urea lỏng Rustigian-Stuart’s Urease Broth
(21)2.Thử nghiệm Urease
2.2.Tiến hành
- Dùng que cấy vòng cấy lượng sinh
khối lớn từ khuẩn lạc chủng lên bề mặt ống môi trường thạch nghiêng
(22)2.Thử nghiệm Urease
2.3.Đọc kết quả
* Môi trường urea lỏng Rustigian-Stuart’s Urease Broth:
- Dương tính (+): Màu đỏ tím khắp mơi trường
(23)(24)(25)2.Thử nghiệm Urease
2.3.Đọc kết quả
* Môi trường Christensen Urea:
- Dương tính (+): Màu đỏ tím bề mặt mơi trường thạch nghiêng
+ + + + : toàn thạch đổi màu + + + : mặt thạch đổi màu
+ : mặt thạch đỉnh đổi màu, phần môi trường cịn lại khơng đổi màu
(+) nhanh: màu đổi vòng 1-6 giờ
(26)(27)(28)3.Thử nghiệm khả lên men đường rượu
3.1 Nguyên tắc
-Xác định khả số vi sinh vật lên men (phân giải) carbohydrate đặc hiệu có mơi trường để
tăng trưởng
(29)3.Thử nghiệm khả lên men đường rượu
3.1 Nguyên tắc
(30)3.Thử nghiệm khả lên men đường rượu
3.1 Nguyên tắc
-Thử nghiệm khả lên men thường dùng để định danh vi sinh vật đường ruột (Enterobacteriaceae có khả lên men glucose, E.coli, Klebsiella, Enterobacter lên men gluocose lactose) phân biệt số giống vi sinh vật.
(31)3.Thử nghiệm khả lên men đường rượu
3.2.Tiến hành
- Cấy vi khuẩn hoạt hoá vào ống nghiệm, đặt 36 0C, theo dõi tượng sinh acid sau 1-3 ngày
- Lọc vơ trùng mơi trường qua màng lọc có kích thước lỗ 0,45µm 0,2µm.
- Phân phối vào ống nghiệm Hấp 1210C 15 phút - Tiến hành cấy chủng vào ống môi trường que cấy vòng.
- Ủ ống môi trường 370C 18 – 20 Trong
trường hợp khẳng định kết âm tính, cần dùng paraffin để bịt kín nút bơng theo dõi thời gian ủ kéo dài đến
trong 14-30 ngày.
Nếu vi khuẩn có khả lên men đường (sinh acid) chất chỉ thị Andrade chuyển màu đỏ, chất thị BPB
(32)(33)(34)(35)(36)(37)(38)4.Thử nghiệm khả biến dưỡng citrat
4.1 Nguyên tắc
Xác định khả số vi sinh vật sử dụng citrate nguồn cacbon cho hoạt động trao đổi chất làm kiềm hóa mơi trường Sản phẩm biến dưỡng citrate thay đổi tùy pH môi trường Khi pH tăng, môi trường chuyển sang kiềm, lượng acetate, formate tăng
pH trung tính: sản phẩm chủ yếu CO2 acetate pH acid : sản phẩm chủ yếu acetoin lactate
(39)4.Thử nghiệm khả biến dưỡng citrat
4.1 Nguyên tắc
-Thử nghiệm khả lên men thường dùng để định danh vi sinh vật đường ruột (Enterobacteriaceae có khả lên men glucose, E.coli, Klebsiella, Enterobacter lên men gluocose lactose) phân biệt số giống vi sinh vật.
(40)4.Thử nghiệm khả biến dưỡng citrat
4.2.Tiến hành
1) Môi trường Simmon Citrate Agar (SCA),
chỉ thị pH: bromothymol blue pH 6,9. Acid: màu vàng pH=6
Kiềm: màu xanh dương pH= 7,6
Trung tính (mơi trường khơng ni cấy): màu xanh lục pH= 6,9
Cấy ria khuẩn lạc từ môi trường KIA môi
(41)4.Thử nghiệm khả biến dưỡng citrat
4.2.Tiến hành
2) Môi trường Christensen Citrate Sulfide Agar (CCSA)
chỉ thị pH: phenol red pH 6,7. pH acid (<6,8): màu vàng
pH kiềm (>8,4): màu đỏ
(42)4.Thử nghiệm khả biến dưỡng citrat
4.3.Đọc kết quả
- SCA (+): có khuẩn lạc, mơi trường chuyển sang màu xanh dương
SCA (-): khơng có khuẩn lạc, mơi trường giữ ngun màu lục
- CCSA (+): màu đỏ bề mặt thạch nghiêng
(43)5.Thử nghiệm khả sinh H2S
5.1 Nguyên tắc
Xác định khả vi sinh vật chuyển hóa acid amin chứa lưu huỳnh điều kiện kỵ khí sinh H2S, tạo chất kết tủa màu đen Có nhiều cách phát khả sinh H2S phương pháp sử dụng acetate chì nhạy để nhận lượng H2S vi khuẩn
Chuẩn bị môi trường
- Môi trường KIA (Kligler Iron Agar)
- Môi trường TSI (Triple Sugar Iron Agar)
- Môi trường SIM (Sulfide Indol Motility Agar) - Môi trường PIA (Peptone Iron Agar)
- Môi trường BSA (Bismuth Sulfide Agar)
(44)5.Thử nghiệm khả sinh H2S
5.2.Tiến hành
- Môi trường KIA, TSI : cấy ống thạch nghiêng, phần đáy sâu.
- Môi trường SIM, PIA : cấy đấm xuyên vào tâm ống thạch
đứng.
- Môi trường BSA : cấy đĩa.
Có thể dùng giấy tẩm Pb(CH3COO)2 5% gắn lên thành ống môi trường lỏng Phương pháp cho kết từ 30
phút dến 1-2 giờ.
Dùng que cấy vòng cấy sinh khối từ khuẩn lạc chủng thuần sâu vào phần đáy ống thạch nghiêng, ống
(45)5.Thử nghiệm khả sinh H2S
5.3.Đọc kết quả
-Dương tính (+):
+ Xuất khuẩn lạc môi trường BSA + Môi trường KIA, TSI, SIM, PIA hóa đen
(46)(47)6.Thử nghiệm khả sinh Indol
6.1 Nguyên tắc
(48)6.Thử nghiệm khả sinh Indol
6.1 Nguyên tắc
Môi trường nước peptone (tryptone water)
Có thể dùng mơi trường kết hợp:
- Môi trường MIU (Motility Indol Urea) - Môi trường SIM (Sulfide Indol Motility)
Thuốc thử:
(49)6.Thử nghiệm khả sinh Indol
6.1 Nguyên tắc
Thuốc thử:
(50)6.Thử nghiệm khả sinh Indol
6.2.Tiến hành
- Sinh khối chủng cấy vào ống môi trường lỏng, nhỏ giọt thuốc thử
- Ủ 370C 24-48 Trước bổ sung
thuốc thử bổ sung 1ml ether xylene vào ống nghiệm, lắc để chiết tách indol lên lớp dung môi hữu cơ.
(51)6.Thử nghiệm khả sinh Indol
6.3.Đọc kết quả
Dương tính (+): Màu đỏ xuất bề mặt mơi trường
Âm tính (-) : Bề mặt môi trường giữ nguyên màu vàng thuốc thử.
(52)6.Thử nghiệm khả sinh Indol
(53)
6.Thử nghiệm khả sinh Indol
(54)
6.Thử nghiệm khả sinh Indol
(55)
6.Thử nghiệm khả sinh Indol
(56)
6.Thử nghiệm khả sinh Indol