05 - Nguyễn Phúc Kiên

Khoa Dược BM Vi sinh - Ký sinh  CHUYÊN ĐỀ HẾT MÔN SẢN XUẤT NGUYÊN LIỆU DƯỢC BẰNG CNSH Tên chuyên đề: MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP THU HOẠCH KHÁNG SINH SAU LÊN MEN  Sinh viên TH: Nguyễn Phúc Kiên Số thăm: 05 Giảng viên HD: TS Nguyễn Tú Anh Ký tên GV chấm GV chấm TP.HCM - 2021 Điểm TB MỤC LỤC Tóm tắt Giới thiệu Nội dung 1 3.1 Tách sinh khối 3.2 Thu hồi kháng sinh 3.3 Tinh chế lại thu sản phẩm cuối 3.4 Một số ví dụ cụ thể 3.4.1 Vancomycin 3.4.2 Tetracyclin 3.4.3 Kinamycin Kết luận 10 Tài liệu tham khảo 11 ii Tóm tắt Hiện nay, việc sử dụng kháng sinh để điều trị bệnh vi khuẩn gây trờ nên phổ biến bệnh viện Ở Việt Nam, mức độ sử dụng kháng sinh đứng đầu tất nước khu vực khác Châu Âu, Trung Quốc… [1], kéo theo việc sản xuất để đáp ứng nhu cầu tương đối lớn nghiên cứu phát triển Một nhiều phương pháp có từ lâu ứng dụng ngành cơng nghiệp công nghệ lên men, việc sử dụng nguồn nguyên liệu vi sinh vật nguồn dinh dưỡng phong phú sẵn có giúp giảm bớt việc sử dụng chất hóa học, dung mơi có tác động xấu đến môi trường [2] Tuy nhiên, vấn đề đặt để tạo quy trình sản xuất lên men với điều kiện đảm bảo chất lượng lô mẻ, mở rộng quy mô sản xuất cho thách thức lớn ngành công nghiệp [3] Thử thách đặt ra, phương pháp thu hoạch kháng sinh phù hợp, giữ vững tính ổn định mức độ tinh khiết đưa vào sử dụng cho giai đoạn đánh giá giai đoạn quan trọng Trong khuôn khổ báo cáo sản xuất này, em xin tổng hợp chung quy trình thu hoạch kháng sinh sau lên men cụ thể giới thiệu số quy trình thu hoạch kháng sinh bật Từ đó, rút kết luận đề nghị giải hạn chế phương pháp áp dụng cho sản xuất Giới thiệu Kháng sinh từ phân lập thành công đưa vào sản xuất cơng nghiệp từ năm 1940, sau chúng phát triển mức độ đa dạng nhóm cấu trúc (β-lactam, aminoglycosid, quinolon, macrolid, glycopetid…) hoạt tính cụ thể theo đích tác động vi khuẩn khác (thành tế bào, tổng hợp protein, AND gyrase…) điều trị bệnh nhiễm trùng, nhiễm khuẩn Thị trường tiêu thụ giới ngày tăng theo thông kê gần 23 triệu đô la Mỹ với nhóm β-lactam chiếm 65% [4] Hiện nay, kháng sinh tổng hợp theo nhiều đường lên men trực tiếp từ vi sinh vật, bán tổng hợp tổng hợp hoàn toàn Việc từ nguyên liệu ban đầu trải qua nhiều giai đoạn tổng hợp, tinh chế khác thay đổi hiệu suất yếu tố tạo khó khăn việc tổng hợp hóa học kháng sinh, từ sản xuất công nghệ lên men gồm giai đoạn lên men thu hồi sản phẩm dần trọng phát triển tình bền vững ổn định Giảm kinh phí xây dựng quy trình chiết xuất tinh chế để thu hồi sản phẩm kháng sinh nhanh trở ngại lớn việc sản xuất công nghệ lên men Với khoảng dao động cho việc thu hồi kháng sinh sau lên men từ 15% đến tận 75% tổng số kinh phí để sản xuất kháng sinh cho thầy tầm quan trọng giai đoạn [5] Vì vậy, việc nghiên cứu kết hợp đặc điểm sản phẩm lên men phương pháp thu hồi sản phẩm cải thiện hiệu sản xuất có chất lượng cao Nội dung Sản phẩm sau lên men cịn chứa nhiều thành phần mảnh tế bào, vi sinh vật ngun vẹn cịn sót lại, thành phần tan không tan dịch lên men, sản phẩm trao đổi giai đoạn sản phẩm phụ khác Do để tăng hiệu suất cần phải xem xét tiêu chí để đánh giá lựa chọn phương pháp thu hồi thích hợp [5]:  Vị trí sản phẩm nội bào hay ngoại bào  Nồng độ sản phẩm sau lên men  Các tính chất lý hóa đặc trưng sản phẩm lên men  Mục đích sử dụng sản phẩm  Tiêu chuẩn độ tinh khiết tối thiểu chấp nhận  Mức độ nguy hiểm, sinh học sản phẩm dung môi  Chất không tinh khiết dịch lên men  Giá trị thị trường sản phẩm Quy trình xử lý thu hoạch kháng sinh sau quy trình lên men thường gồm giai đoạn sau đây:  Tách sinh khối: lọc, ly tâm, phá hủy tế bào…  Thu hồi kháng sinh: chiết phân đoạn, màng siêu lọc, thẩm thấu ngược, hấp phụ, cột ion trao đổi, lọc gel, chiết hai pha nước, kết tủa…  Tinh chế thu sản phẩm cuối cùng: sắc ký, kết tinh, sấy khô 3.1 Tách sinh khối Sản phẩm sau lên men tồn dạng nội bào ngoại bào, cần phải lựa chọn phương pháp tách sinh khối phù hợp, thường lọc ly tâm dạng ngoại bào, phá hủy tế bào nội bào Sau trải qua tách chiết Lọc: phương pháp đơn giản vả sử dụng phổ biến quy mô sản xuất với việc sử dụng màng lọc xốp có tác dụng giữ hạt nhỏ, chất không tan cho phép dịch chất lỏng khí qua dễ dàng Các thông số quan trọng cần ý chọn lựa phương pháp lọc độ nhớt tỷ trọng sản phẩm Ngoài ra, áp suất có ảnh hưởng giúp cho tốc độ lọc cải thiện, giảm đáng kể thời gian lọc Các phương pháp lọc dần cải tiến từ lọc gián đoạn ví dụ thêm chất trợ lọc, lọc khung áp suất giảm đến lọc liên lục thiết bị lọc chân khơng quay vịng thiết bị lọc dòng chảy chéo… Ly tâm: sử dụng để thay cho lọc trường hợp lọc diễn chậm khó khăn, tế bào vật treo lơ lửng khơng sử dụng chất trợ lọc, quy trình hoạt động liên tục theo tiêu chuẩn cao Hiện nay, máy ly tâm thường sử dụng hoạt động liên tục bán liên tục theo nhiều chế khác nhau, thơng số ảnh hưởng đến q trình ly tâm độ nhớt, tốc độ lắng cạn, mật độ tế bào chất lỏng Phá hủy tế bào: phương pháp vật lý hóa học Phương pháp vật lý: sử dụng lực học lực ép để cắt phá hủy tế bào, quay trộn với hạt nhỏ, đóng băng tế bào sau phá hủy tế bào băng tan dùng máy siêu âm Phương pháp hóa học: Sử dụng hợp chất như: amoni bậc IV, natri lauryl sulfat, natri dodecylsulfate (SDS), dung môi kiềm, enzym Dưới tác dụng chất màng tế bào vi sinh vật bị phá hủy từ thu sản phẩm nội bào bên 3.2 Thu hồi kháng sinh Sự lựa chọn phương pháp thích hợp dựa điều kiện nghiên cứu quy mơ nhỏ tìm hiểu tính chất lý hóa đặc trưng sản phẩm lên men, chọn lọc điều kiện thích hợp để thực Các phương pháp thường chiết xuất lỏng – lỏng, sắc ký trao đổi ion, sắc ký thẩm thấu gel, kết tủa… Chiết xuất lỏng lỏng: yêu cầu đặc biệt phương pháp chất phải có nồng độ cao Thơng số quan tâm để lựa chọn số điện mơi, cho biết tính phân cực khơng phân cực hợp chất kháng sính, từ tạo dạng muối chiết xuất dung môi phân cực chiết trực tiếp với dung mơi phù hợp Ví dụ penicillin G dùng dung môi amyl acetate, butyl acetate hay methyl isobutyl ketone [6] Chiết xuất cách tạo hai pha thân nước: cách thêm chất polyme thân nước tới mức độ định tạo nhiều pha khác Sau dùng thiết bị ly tâm phân tách để chọn lọc lấy pha cần thiết Ví dụ phương pháp việc sử dụng PEG-NADH để chiết dẫn xuất dehydrogenases, p-aminobenzamidine… Chiết xuất sử dụng chất lỏng siêu tới hạn: điều kiện thích hợp nhiệt độ áp suất tới hạn, vật chất tồn vừa thể lỏng khí Ưu điểm phương pháp loại bỏ thành phần không mong muốn dư lượng thuốc trừ sâu, loại bỏ vi khuẩn trình lên men, thu hồi chất hữu xót lại, khơng làm nhiễm môi trường… Tuy nhiên phương pháp thường gặp điều kiện bất lợi chi phí, nhà máy thiết bị phù hợp, quy trình vận hành kiểm sốt chặt chẽ Dung môi phổ biến thường sử dụng carbon dioxide hữu hiệu để chiết chất tan không phân cực Kết tủa: sử dụng dung môi khác nhau, muối làm thay đổi tỉ trọng, điều kiện pH thay đổi, nhiệt độ… để kết tủa kháng sinh sau lọc ly tâm để thu kháng sinh thô ban đầu để tinh chế thêm bước sau Ví dụ: pennicilin kết tủa giảm độ tan cho natri kali acetat vào, vancomycin bị tủa lại tác dụng acid picric Sắc ký: dựa độ phân cực, tính chất vật lý (kích thước, tương tác kỵ nước, thân nước), hóa học (liên kết hóa trị, ion…), hay sinh học (ái lực) Dưới di chuyển dung mơi rửa giải chất tan với độ hịa tan phân cực khác di chuyển với tốc độ khác pha rắn, kiểm tra lấy giai đoạn cần thiết Tùy theo chất chất chất tan lựa chọn chế cho loại cột sắc ký phù hợp sau đây: Sắc ký hấp phụ: dựa liên kết chất tan với hợp chất rắn thông qua tương tác yếu Van der walls Sắc ký trao đổi ion: có trao đổi ion pha rắn pha lỏng làm cho chất hòa tan giữ lại cột, sau chất tan liên kết rửa trơi đệm thích hợp với tăng dần nồng độ pH Hai cột trao đổi ion thông dụng cationic (acid sulphonic, acid carboxylic, acid phosphoric…), anion (diethylaminoethyl cellulose) Sắc ký thẩm thấu gel: dựa kích thước chất tan, qua hạt có kích thước nhỏ thẩm thấu qua gel nhanh so với hạt có kích thước lớn Thơng dung gel gồm có Sephadex Sepharose với phạm vi kích thước đa dạng tùy vào mục đích sử dụng Ví dụ: Sephadex LH20 sản xuất acid clavulanic Sắc ký lực: thông qua cấu trúc chức phân tử, chịu tương tác cao vật liệu sinh học enzym – chất, enzym – chất ức chế, kháng nguyên – kháng thể… tạo lực khác phối tử thụ thể liên kết 3.3 Tinh chế lại thu sản phẩm cuối Kết tinh: ứng dụng để thu sản phẩm có độ tinh khiểt cao thu hồi thành phần tan dịch chất acid amin, acid hữu cơ…dựa độ tan chất với dung môi sử dụng tạo dung dịch siêu bão hòa tạo cạnh tranh độ tan, để hình thành tinh thể cách dễ dàng thêm vào vài tinh thể có sẵn sử dụng tác động vật lý để mồi, sau tinh thể lọc rửa nhiều lần dung mơi thích hợp Sấy khơ: áp dụng để thuận tiện cho q trình đóng gói, bảo quản, giảm chi phí vận chuyển Dưới tác dụng nhiệt độ nước từ vật liệu loại bỏ thu hồi đến mức độ đảm bảo theo tiêu chuẩn quy định Các sản phẩm nhạy với nhiệt cần kiểm sốt tính ổn định, hoạt tính, giá trị tiếp xúc với nhiệt độ cao thời gian dài 3.4 Một số ví dụ cụ thể 3.4.1 Vancomycin [7] Phương pháp - Tách sinh khối Bước 1: tinh chế cách sử dụng nhựa trao đổi cation acid mạnh (DOWEX 50WX2100) Dịch thu sau lên men Amycolatopsis orientalis (ATCC 19795) acid hóa với acid sulfuric đến pH Sau giữ ổn định vịng 30 phút, lọc qua đá diatomaceous Các dịch lọc sau tập trung cho hấp thụ nhựa trao đổi cation acid mạnh DOWEX 50WX2-100 với tốc độ chảy 2000 ml/giờ Nhựa trao đổi sau rửa với nước cất tốc độ 2000 ml/giờ Cuối rửa với dung dịch NH4OH 0.1N (hiệu suất: 88%) Điều chỉnh với HCl 2N pH 3.5 - Thu hồi kháng sinh Bước 2: tinh chế cách sử dụng nhựa trao đổi anion base yếu nhôm oxide Dịch rửa giải bước qua nhựa trao đổi anion base yếu (DCA11) than hoạt tính với tốc độ chảy 1000 ml/giờ DCA11 nhơm oxit rửa giải với nước, tốc độ chảy 1000 ml/giờ Kế tiếp, than hoạt tính cho vào khuấy vịng 20 phút, sau lọc loại bỏ để thu dịch rửa giải cuối (hiệu suất 85%) Bước 3: tinh chế sử dụng nhựa hấp thụ kỵ nước (AMBERCHROM CG-161M) Dịch rửa giải bước cho qua nhựa hấp thụ kỵ nước với tốc độ chảy 1000 ml/giờ hấp thụ Nhựa rửa lần đầu với nước tốc độ 1000 ml/ rửa tiếp tục với isopropanol chứa Natri dihydrophosphat 50mM (NaH2PO4) khan nước có nồng độ tăng dần tới 8% vòng 2.5 - Tinh chế thu sản phẩm cuối Bước 4: Kết tinh tạo tinh thể vancomycin, kiểm nghiệm tiêu Dịch rửa giải bước cô đặc nhiều lần tới mức tối thiểu acid hóa với HCl 2N đến pH 3.2 Từ từ thêm aceton gấp lần lượng dịch cô đặc Làm lạnh 4oC qua đêm sau lọc, sấy khô tinh thể 40oC Vancomycin HCl phân tích HPLC tiêu theo tiêu Dược Điển Châu Âu Phương pháp 2: dịch lên men điều chỉnh pH acid hydrocloride cho qua nhựa sắc ký trao đổi ion amine-formaldehyde (Permutit DR) có pH 8.5 chứa cột thủy tinh Inch (nhựa yều cầu phải rửa nhiều lần với nước để đảm bảo pH 9), kháng sinh hấp thu vào nhựa này, rửa cột lần đầu với nước để loại bỏ thành phần không cần thiết Rửa giải kháng sinh nhựa hỗn hợp acid acetic băng : aceton : nước (1:30:69), dịch rửa giải chứa khoảng 85% kháng sinh từ hỗn hợp dịch lên men ban đầu cô đặc chân không để loại bỏ aceton Sau hỗn hợp điều chỉnh pH dung dịch NaOH hấp phụ cách khuấy liên tục 80 phút với than hoạt tính (Norit SG), lọc chân không rửa nhiều lần nước than hoạt Sau đó, than hoạt rửa giải aceton 30%, acid hóa dịch rửa giải acid sulfuric đến pH Cô đặc để loại bớt dung môi, tiếp tục thêm từ từ acid picric vào để kháng sinh tủa lại làm lạnh liên tục 5oC vòng 16h Ly tâm để lấy chất rắn, rửa nhiều lần với nước lạnh Sau hịa tan chất rắn methanol : acid hydroclorid 10% (5 : ) Dung dịch acid có chứa aceton thêm vào để tạo tủa Ly tâm lấy chất rắn, rửa lại với aceton diethylether, sấy khô chân không qua đêm thu muối vancomycin hydrocloride dạng vơ định hình [8] Hình Sơ đồ thu hoạch kháng sinh vancomycin HCl Nhận xét: hai phương pháp có chung phải có nhiều giai đoạn acid hóa trung hịa, nhiên quy trình phải trải qua giai đoạn sắc ký với cột sắc ký cation, anion nhựa nhiều dung môi rửa giải khác cịn quy trình đơn giản gồm giai đoạn cột sắc ký giai đoạn hấp phụ than hoạt lại tạo dạng vơ định hình chất lượng khơng ổn định dạng tinh thể quy trình Do đó, cần phát triển thêm điều kiện quy trình để kết tinh thu dạng tinh thể chất lượng 3.4.2 Tetracyclin [9] Hỗn hợp sau lên men hoàn tất lọc để thu phần dịch lít dịch lọc acid hóa với acid sulfuric đến pH 2, thêm từ từ 75 ml Arquad 16 vào Hỗn hợp khuấy liên tục vòng 15 phút lọc qua đá diatomaceous mịn, rửa với nước nhiều lần Kết hợp phần dịch lọc với điều chỉnh pH 8.8 natri hydroxide 10 N, lọc qua đá diatomaceous mịn, rửa với nước nhiều lần Dịch lọc acid hóa lần với acid sulfuric đến pH 1.5, sau khuấy ổn định vịng 15 phút lọc, rửa với nước nhiều lần Gộp phần dịch lại điều chỉnh pH 3.8 với ammonium hydroxide, thêm tinh thể tetracyclin vào để mồi cho kết tinh diễn Giữ ổn định để qua đêm tủ lạnh Hỗn hợp cuối lọc, rửa lại với n-butanol nước, sấy khơ thu tinh thể tetracyclin base Hình Sơ đồ thu hoạch kháng sinh tetracyclin dạng base tinh thể 3.4.3 Kinamycin [10] Hình Sơ đồ thu hoạch kháng sinh kinamycin A, B, C, D Tách sinh khối: hỗn hợp sau lên men lọc điều chỉnh pH đến 8.2 Thu hồi kháng sinh: Dịch lọc sau (200 lít) chiết xuất với benzen pH Cô quay áp suất giảm để loại dung môi benzen thu chất lỏng nhớt (197 g), thêm 600 ml hexan để tạo dạng bột thơ, sau bột thơ tinh chế cột sắc ký Kieselgel (0.05-0.2mm) tẩm thêm với H2SO4 2% sử dụng dung môi benzen acetone Đầu tiên khởi đầu với hệ dung môi benzen-aceton (20:1) thu kinamycin A B (12g), sau tiếp tục với benzen-aceton (5:1) để thu kinamycin C D (32g) Tinh chế thu sản phẩm cuối cùng: Hỗn hợp A B tách tiếp tục cột sắc ký Kieselgel (0.05 -0.2 mm) sử dụng hệ dung mơi chloroform ethyl acetate (15:1), sau thành phần A B kết tinh trở lại dung mơi cloroform cho tinh thể có màu vàng cam Tương tự với hỗn hợp C D sử dụng hệ dung môi chloroform ethyl acetate (5:1), kết tinh trở lại dung môi chloroform cho tinh thể màu vàng cam Kinamycin kiểm tra đơn giản sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi (CHCl3: EtOAc 3:2) cho khoảng Rf A, B, C, D 0.89, 0.82, 0.47, 0.39 Kết luận Từ nội dung trình bày trên, biết số quy trình để thu hoạch kháng sinh ứng dụng phương pháp thực tế Những phương pháp tùy vào khác chủng loại vi sinh vật tính chất đặc trưng loại kháng sinh lý hóa, độ ổn định, độ hịa tan khác nhau, yếu tố môi trường tạo đa dạng phức tạp công đoạn thu hoạch kháng sinh sau lên men Do đó, để sản xuất với quy mô công nghiệp lớn cách hiệu cần phải nghiên cứu đặc tính đặc trưng kháng sinh, chọn lựa chủng vi sinh vật, thiết bị từ giai đoạn đầu lên men, sau thiết kế quy trình thu hoạch phù hợp tối ưu điều kiện khác ảnh hưởng đáp ứng hiệu suất, tính lặp lại ổn định tiến hành sản xuất Gần đây, kháng sinh sản xuất theo đường lên men trọng đánh giá cao tính an tồn thân thiện với môi trường, thể số lượng kháng sinh sản xuất theo đường lên men ngang so với hai đường tổng hợp bán tổng hợp Do đó, góp phần sản xuất kháng sinh đạt yêu cầu chất lượng, tìm phát tiển giai đoạn thu hoạch sau lên men đóng vai trị quan trọng sản xuất kháng sinh theo đường để đáp ứng lại với nhu cầu ngày tăng việc sử dụng kháng sinh điều trị 10 Tài liệu tham khảo [1] Bộ Y tế (2009), Báo cáo sử dụng kháng sinh kháng kháng sinh 15 bệnh viện Việt Nam năm 2008-2009, Hà Nội [2] Soetaert W., Vandamme, Erick (2006), "The impact of industrial biotechnology", Biotechnology Journal: Healthcare Nutrition Technology, (7‐8), pp 756-769 [3] Schmidt F (2005), "Optimization and scale up of industrial fermentation processes", Applied microbiology biotechnology, 68 (4), pp 425-435 [4] Elander R (2003), "Industrial production of β-lactam antibiotics", Applied microbiology biotechnology, 61 (5-6), pp 385-392 [5] Stanbury P F., Whitaker A., Hall S J (2013), Principles of fermentation technology, Chapter 10:The Recovery and Purification of Fermentation Products, MPG Books Ltd, Bodmin, Cornwall, Elsevier, pp 277-308 [6] Trần Cát Đông (2015), Sản xuất nguyên liệu Dược Công nghệ Sinh học, Kháng sinh, tr 1-24 [7] Lee J W., Jung Y T et al., "Process of purifying vancomycin hydrochloride", Patent No US7018814B2, 2006 [8] Mccormick M H., Mcguire J M., "Vancomycin and method for its preparation", Patent No US3067099A, 1962 [9] Minieri P P., Ziegler W M., "Tetracycline extractions", Patent No US2871264A, 1959 [10] Hata T., OMURA S et al (1971), "A new antibiotic, kinamycin: Fermentation, isolation, purification and properties", The Journal of antibiotics, 24 (6), pp 353-359 11 ... Kieselgel (0 .0 5- 0.2mm) tẩm thêm với H2SO4 2% sử dụng dung môi benzen acetone Đầu tiên khởi đầu với hệ dung môi benzen-aceton (20:1) thu kinamycin A B (12g), sau tiếp tục với benzen-aceton (5:1)... microbiology biotechnology, 68 (4), pp 42 5-4 35 [4] Elander R (2003), "Industrial production of β-lactam antibiotics", Applied microbiology biotechnology, 61 ( 5-6 ), pp 38 5-3 92 [5] Stanbury P F., Whitaker... 200 8-2 009, Hà Nội [2] Soetaert W., Vandamme, Erick (2006), "The impact of industrial biotechnology", Biotechnology Journal: Healthcare Nutrition Technology, (7‐8), pp 75 6-7 69 [3] Schmidt F (2 005) ,