tương hợp sinh học in vitro của biodentine với nguyên bào xương

MỞ ĐẦU Trong thực hành nha khoa, vấn đề thủng buồng tủy hay ống tủy phẫu thuật cắt chóp dẫn đến thơng thương mơ tủy với mô xương xung quanh mô nha chu Việc lựa chọn vật liệu trám trường hợp cần xem xét, vật liệu sử dụng tiếp xúc trực tiếp với mô xung quanh thời gian dài Lành thương quanh chóp liên quan đến việc tái tạo dây chằng nha chu, xê măng chân mô xương, nên vật liệu dùng trám ngược cần có đặc tính lí tưởng như: tương hợp sinh học tốt với mơ quanh chóp, có tác động kìm khuẩn, khả kích thích tái tạo mơ, đảm bảo khít kín hệ thống ống tủy ba chiều khơng gian, khơng bị hịa tan, ổn định theo thời gian, dễ thao tác, cản quang để kiểm soát sau can thiệp [30] Trước đây, nhiều vật liệu sử dụng để trám ngược như: Amalgam, Composite, IRM, Super EBA, GIC, xi măng Eugenol- ZnO Tuy nhiên, vật liệu chưa đáp ứng hầu hết yêu cầu vật liệu trám ngược lí tưởng, đặc biệt khơng có khả kích thích tạo mơ, chí có độc tính nhẹ [59] MTA (Mineral trioxide aggregate) đời vào năm 1998, xem tiêu chuẩn vàng điều trị đóng chóp, che tủy trực tiếp, lấy tủy buồng, điều trị ngoại tiêu, thủng sàn, thủng chân răng, nứt gãy chân [50] MTA có tính tương hợp sinh học cao, độc tính thấp, khả bám dính vào mơ răng, hoạt tính sinh học, đặc biệt kích thích tái tạo mơ [35] Bên cạnh đó, MTA có nhược điểm thời gian đơng kéo dài, khoảng 20 phút MTA trắng 55 phút với MTA xám, độ bền nén độ bền uốn thấp ngà răng, gây đổi màu đặc biệt giá thành cao [31] Dựa đặt tính sinh học bật MTA, loại xi măng có thành phần calcium silicate BiodentineTM phát triển nhằm cải thiện hạn chế MTA [40] BiodentineTM dùng lĩnh vực chữa răng-nội nha: thủ thuật che tủy trực tiếp, dùng chất thay ngà bên vật liệu trám… BiodentineTM có thời gian đơng cứng ngắn khoảng 12 phút, đặc tính học cải thiện, dễ thao tác [14], [49], [63] chi phí hợp lí Hiện nay, BiodentineTM đề xuất dùng làm vật liệu trám ngược phẫu thuật cắt chóp, điều trị thủng buồng tủy hay ống tủy [53] Vật liệu trám ngược tiếp xúc với mô tế bào xung quanh, việc hiểu chế hoạt động vật liệu quan trọng Nhiều nghiên cứu tập trung vào tính tương hợp sinh học vật liệu mức tế bào, nhiên tương tác vật liệu trám ngược tổn thương quanh chóp việc khởi đầu tiến triển lành thương xương chưa sáng tỏ [7], [59] Năm 2014, Attik G.N cộng tiến hành nghiên cứu in vitro nhằm đánh giá hiệu BiodentineTM MTA nguyên bào xương MG-63 Kết cho thấy BiodentineTM có tính tương hợp sinh học tương tự MTA, thời gian đông BiodentineTM ngắn so với MTA Cũng vào năm này, Lee B.N cộng đánh giá hiệu ba loại xi măng MTA, BiodentineTM Bioaggregate dòng tế bào gốc trung mô C3H10T1/2 Tác giả đưa kiến nghị sử dụng BiodentineTM cho trám ngược, cần thêm nghiên cứu khác để minh chứng cho vấn đề Năm 2015, Margunato S cộng thực nghiên cứu nhằm đánh giá tăng sinh tế bào gốc trung mô tủy xương người tiếp xúc với BiodentineTM, MTA MM – MTA Dựa kết nghiên cứu này, tác giả đề nghị sử dụng BiodentineTM trám ngược Mặc dù BiodentineTM sử dụng điều trị trám ngược, thủng buồng tủy, thủng chân răng… Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu chế tác động vai trò lành thương xương BiodentineTM, đặc biệt so sánh với MTA Để hiểu rõ vấn đề thực nghiên cứu Tương hợp sinh học in vitro Biodentine với nguyên bào xương Mục tiêu tổng quát: Xác định khả đáp ứng tế bào gốc trung mô tủy xương người với BiodentineTM Mục tiêu chuyên biệt: Xác định so sánh phần trăm tế bào sống tế bào gốc trung mô tủy xương người tiếp xúc với BiodentineTM MTA thông qua mật độ quang Xác định so sánh mức độ tăng sinh tế bào gốc trung mô tủy xương người tiếp xúc với dịch chiết (nồng độ pha loãng) BiodentineTM MTA CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 MTA 1.1.1 Thành phần MTA có thành phần calcium silicate Ngồi MTA cịn có thành phần khác tricalcium aluminate, bismuth oxide… Bismuth oxide thêm vào để tăng tính cản quang MTA [60] Khi MTA đông cứng xuất sản phẩm phụ Camilleri J cộng (năm 2008) chứng minh dạng hydrate hoá MTA tiết lượng lớn ion calcium [11] Nghiên cứu Camilleri J cộng (năm 2004) định lượng sản phẩm phụ phóng thích q trình đơng cứng, kết cho thấy MTA dạng hydrate hoá tiết lượng lớn calcium silicate hydrate (C-SH) calcium hydroxide(C-H) Lượng bismuth oxide giảm đáng kể dạng MTA hydrate hoá [12] Một số nghiên cứu cho bismuth oxide làm giảm tăng sinh tế bào điều kiện mơi trường có pH axit Tuy nhiên bismuth oxide ảnh hưởng đến tính tương hợp sinh học MTA có thành phần calcium hydroxide [12] 1.1.2 Phân loại MTA có hai loại MTA trắng xám - MTA xám chủ yếu gồm hạt ưa nước tricalcium silicate, dicalcium silicate, tricalcium aluminate, tetracalcium aluminoferrite tricalcium oxide, silic oxide, bismuth oxide - MTA trắng khơng có tetracalcium aluminiferrite, lượng iron oxide, magnesium oxide, aluminium oxide MTA trắng thấp MTA xám Thời gian đông hai loại khác nhau: MTA trắng (MTA) thời gian đơng trung bình 20 phút, MTA xám thời gian đơng trung bình 55 phút [31] 1.1.3 pH MTA dạng hydrate hoá Theo nghiên cứu Torabinejad M cộng (1995) cho pH MTA ban đầu trung bình 10,2, sau trộn tăng lên đến khoảng 12,5 tương tự calcium hydroxide [60] 1.2 BIODENTINETM 1.2.1 Thành phần Là loại xi măng calcium silicate, phần bột có thêm vào chất độn zirconium oxide chất cản quang Chất lỏng calcium cloride với thành phần chất gia tốc Thời gian đông từ 9-12 phút Đây xem cải tiến vật liệu có thành phần calcium silicate [14], [49], [63] Bảng 1.1: Thành phần BiodentineTM MTA Thành phần bột BiodentineTM MTA Tricalcium silicate Tricalcium silicate Zirconium oxide Dicalcium silicate Calcium carbonate Bismuth oxide Calcium oxide Calcium sulfate Tricalcium aluminate Thành phần nước Nước, calcium cloride Nước cất (dùng môi trường gia tốc) hydrosolube polymer biến đổi ( chất làm dẻo) Calcium silicate có khả tương tác với nước dẫn đến đông cứng xi măng 3CaO.SiO2 dạng hydrate tricalcium silicate, tạo sản phẩm calcium silicate hydrate calcium hydroxide nhờ phản ứng: 2(3CaO.SiO2) + 6H2O → 3CaO.2SiO2.3H2O + 3Ca(OH)2 C3S CSH Q trình hịa tan xảy bề mặt hạt calcium silicate Các gel calcium silicate hydrate calcium hydroxide dư thừa có xu hướng kết tủa lại bề mặt hạt bề mặt lỗ rỗ bột bão hịa mơi trường Các hạt tricalcium silicate không phản ứng bao quanh lớp gel calcium silicate hydrate ngậm nước, tương đối không thấm nước, làm chậm lại tốc độ phản ứng Sự hình thành gel calcium silicate hydrate hydrate hóa thường trực tricalcium silicate, lấp đầy khoảng trống hạt tricalcium silicate [14] 1.2.2 pH BiodentineTM dạng hydrate hoá Để làm rõ mối liên hệ pH tiết ion calcium, năm 2012, Khan S.I.R cộng đánh giá pH BiodentineTM, MTA MTA xám cách đặt khối vật liệu sau đơng cứng hồn tồn vào dung dịch khử ion tiến hành đo pH dung dịch sau giờ, sau 24 giờ, sau 168 Sau đo nồng độ ion calcium vào thời điểm Kết cho thấy pH trung bình BiodentineTM MTA sau giờ, 24 giờ, 168 9,14±0,16, 8,88±0,27, 8,02±0,19 9,52±0,33, 9,32±0,51, 8,45±0,26 [34] Kết nghiên cứu cho thấy pH MTA thấp so với nghiên cứu Torabinejad M cộng (1995) nghiên cứu Khan S.I.R cộng tiến hành đo pH BiodentineTM, MTA, MTA xám dạng dịch chiết nghiên cứu Torabinejad M cộng thực đo trực tiếp pH MTA [60] Thực BiodentineTM MTA vật liệu giàu calcium, thành phần quan trọng hình thành mơ cứng Có nhiều nghiên cứu nhằm đánh giá nồng độ ion calcium mà vật liệu phóng thích ra, kết cho thấy nồng độ ion calcium vật liệu phóng thích giảm theo thời gian [29], [34] nồng độ calcium hấp thu vào ống ngà tăng theo thời gian [29] Các nghiên cứu đáp ứng tế bào với BiodentineTM MTA dạng dịch 1.3 chiết 1.3.1 Nghiên cứu giới Năm 2010 Anto V cộng tiến hành đánh giá tăng sinh tế bào gốc trung mô người qua ngày 1, 3, 5, 7, 14, 21, 28 tiếp xúc trực tiếp với xi măng Porland MTA Kết cho thấy tế bào tiếp xúc với MTA tăng sinh tuyến tính từ ngày đến ngày 28 Nhóm tế bào tiếp xúc với MTA tăng sinh nhanh từ ngày thứ 14 trở [6] Năm 2014, Lee B.N cộng đánh giá độc tính 24 dịch chiết BiodentineTM, MTA Bioaggregate với nồng độ chưa pha loãng (100%), nồng độ pha loãng 50%, 25%, 10%, 2% tế bào gốc trung mô (tế bào dòng C3H10F1/2) Kết cho thấy BiodentineTM nồng độ chưa pha loãng độc với tế bào, pha loãng 50%, 25% , 10%, 2% khơng độc Ở nồng độ 25%, 10%, 2% khơng có khác biệt BiodentineTM với MTA phần trăm tế bào sống [40] Margunato S cộng (2015) tiến hành giá độc tính 24 tăng sinh vào ngày 1, 3, 7, 14 dịch chiết (chưa pha loãng) BiodentineTM, MTA, MM – MTA tế bào gốc trung mô tủy xương người Kết cho thấy ba dịch chiết không độc với tế bào Phần trăm tế bào sống tiếp xúc với dịch chiết (chưa pha loãng) tăng sinh tuyến tính từ ngày 1, qua ngày đến ngày tăng sinh mạnh mẽ vào ngày 14 Khơng có khác biệt BiodentineTM, MTA MM – MTA phần trăm tế bào sống ngày 1, 3, 7, 14 [44] 1.3.2 Nghiên cứu nƣớc Hiện chưa có nghiên cứu thực đánh giá độc tính khả tăng sinh tế bào gốc trung mô tủy xương người tiếp xúc với dịch chiết BiodentineTM MTA 1.3.3 Nhận xét nghiên cứu thực Nhìn chung, nghiên cứu đánh giá đáp ứng tế bào gốc trung mô tế bào gốc trung mô tủy xương tiếp xúc với dịch chiết BiodentineTM, MTA có nồng độ khác thấy khơng có thống kết nghiên cứu Nghiên cứu Lee B.N cộng cho BiodentineTM nồng độ cao (chưa pha lỗng) độc với tế bào dịng C3H10T1/2, nghiên cứu Margunato S cộng (2015) tiến hành đánh giá độc tính tăng sinh tế bào gốc trung mô tủy xương người cho tiếp xúc với dịch chiết (chưa pha loãng) BiodentineTM, MTA, MM – MTA Kết cho BiodentineTM nồng độ chưa pha lỗng khơng độc với tế bào Tế bào tiếp xúc với dịch chiết nồng độ chưa pha loãng tăng sinh mạnh vào ngày 14 BiodentineTM có tính tương hợp sinh học tương tự MTA CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1 Tế bào gốc trung mô tủy xƣơng ngƣời Tế bào gốc trung mô tủy xương sử dụng nghiên cứu cụ thể tế bào gốc trung mơ tủy xương người (hBMSCs) cung cấp nhóm nghiên cứu vật liệu y sinh thuộc phịng thí nghiệm môn sinh lý học công nghệ sinh học động vật trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Thành Phố Hồ Chí Minh 2.1.2 Vật liệu BiodentineTM dạng bột chứa nhộng có số lơ B15498, hạn sử dụng tháng năm 2017 MTA dùng là: Proroot®MTA trắng dạng bột có số lơ 0000100366, hạn sử dụng tháng năm 2017 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu Thời gian nghiên cứu: từ tháng 10 năm 2015 đến tháng năm 2016 Nghiên cứu tiến hành phòng thí nghiệm mơn sinh lý học cơng nghệ sinh học động vật trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Thành Phố Hồ Chí MinhNghiên cứu in vitro có nhóm chứng 2.2.3 Chuẩn bị trƣớc nghiên cứu 2.3 THỰC HIỆN NGHIÊN CỨU Hình 2.2: Proroot®MTA (Dentsply) 2.3.1 Cấy chuyền tế bào: cấy chuyền thứ cấp; Cấy chuyền từ bình Roux sang bình Roux 2.3.2 Chuẩn bị tế bào Cấy tế bào gốc trung mô tủy xƣơng ngƣời (P4) đĩa 96 giếng Thực hiện: - Dùng pipette hút bỏ môi trường nuôi cấy cũ Roux Mật độ tế bào trung bình 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 Nhóm chứng BD MTA Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày 10 Thời gian BD: BiodentineTM Biểu đồ 3.5: Đường biểu diễn tăng sinh hBMSCs tiếp xúc với BiodentineTM MTA nồng độ 6,25%; nhóm chứng vào ngày 0, 2, 4, 6, 10 Dựa vào phép kiểm t-test biểu đồ 3.6 nhận thấy mật độ tế bào trung bình hBMSCs nhóm BiodentineTM nhỏ mật độ tế bào trung bình nhóm MTA vào ngày 2, 4, 6, 10 theo thứ tự, khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (α=0,05) Mật độ tế bào trung bình hBMSCs vào ngày 2, 4, cuả nhóm chứng cao nhóm BiodentineTM MTA, khác biệt có ý nghĩa thống kê (α=0,05) Trong đó, mật độ tế bào trung bình hBMSCs vào ngày nhóm chứng cao nhóm BiodentineTM MTA, khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (α=0,05) Vào ngày 10, mật độ tế bào trung bình hBMSCs nhóm MTA cao so với nhóm BiodentineTM nhóm chứng, khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (α=0,05) Mât độ tế bào trung bình 10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 * * * Nhóm chứng BD MTA Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày 10 Thời gian (ngày) BD: BiodentineTM *: Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (α=0,05) nhóm chứng với BiodentineTM MTA Biểu đồ 3.6: So sánh mật độ tế bào trung bình hBMSCs nhóm BiodentineTM, MTA nhóm chứng CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1 Xác định nồng độ pha loãng dịch chiết Những nghiên cứu trước thực MTA BiodentineTM đánh giá dịch chiết mà cịn dịch chiết pha lỗng theo cách khác Có ba cách pha lỗng khác pha loãng theo nồng độ, pha loãng theo tỷ lệ thể tích, pha lỗng dựa vào hàm lượng vật liệu có dịch chiết (lượng vật liệu có 1ml dịch chiết, tính đơn vị mg/ml) Đầu tiên kể đến cách pha loãng dịch chiết theo nồng độ Để thực theo phương pháp này, Laurent P cộng (năm 2008) tiến hành đánh giá độc tính nguyên bào sợi tủy người tiếp xúc với dịch chiết BiodentineTM, MTA Dycal chia thành nồng độ (nồng độ chưa pha loãng 100%, nồng độ pha loãng 50% 10%) Kết cho thấy BiodentineTM không gây độc cho nguyên bào sợi tủy người nồng độ chức tế bào không thay đổi BiodentineTM dùng che tủy trám lót sau đánh giá độc tính dịng tế bào [38] Vào năm 2013, Yoshino P cộng thực đánh giá độc tính nguyên bào sợi dây chằng nha chu tiếp xúc với dịch chiết MTA, MTA Fillapex xi măng Portland chia thành nồng độ chưa pha loãng (100%), nồng độ pha loãng 50%, 25%, 12,5% 6,25% Kết cho thấy xét độc tính 24 giờ, MTA nồng độ chưa pha lỗng độc với tế bào, với nồng độ cịn lại khơng độc với tế bào [64] Cách pha loãng thứ hai theo tỷ lệ thể tích Khi nghiên cứu độc tính MTA Ma J cộng (2011) thực so sánh tính tương hợp sinh học với nguyên bào sợi nướu người cách tiếp xúc với dịch chiết ERRM Putty, ERRM Paste, MTA xám, IRM Cavit G có tỷ lệ chưa pha lỗng, tỷ lệ pha loãng 1:1, 1:2, 1:4 1:8 Kết cho thấy khơng có khác biệt phần trăm tế bào sống tỷ lệ pha loãng 24 đầu [42] Năm 2013, Zhou H.M cộng thực nghiên cứu đánh giá độc tính dịch chiết BiodentineTM, MTA, GIC với tỷ lệ chưa pha loãng, tỷ lệ pha loãng 1:1, 1:2, 1:4 1:8 lên nguyên bào sợi nướu người Kết cho thấy dịch chiết BiodentineTM chưa pha loãng độc với tế bào hơn, pha loãng theo tỷ lệ 1:1 đến 1:8 khơng độc, khơng có khác biệt tỷ lệ pha loãng Và đánh giá độc tính ngun bào sợi nướu người khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (α=0,05) MTA BiodentineTM [67] Cách thứ ba xác định hàm lượng dịch chiết độc với tế bào Theo kết nghiên cứu Zhao X cộng tế bào gốc tủy người vào năm 2012 cho thấy hàm lượng MTA>2mg/ml độc tế bào [79] Hai năm sau đó, Luo Z cộng đánh giá độc tính dịch chiết BiodentineTM tế bào gốc tủy người kết cho thấy BiodentineTM hàm lượng 20mg/ml độc với tế bào [41] Nhưng nghiên cứu trước Zanini M cộng (2012) tìm hàm lượng trung gian 1mg/ml BiodentineTM không độc tế bào tủy chuột [65] Năm 2015 Gomes-Cornelio A.L cộng thực đánh giá độc tính tăng sinh tế bào dòng Saos-2 MTA Plus, BiodentineTM, xi măng calcium silicate có nhựa Resin với Zirconium (CSCRZrO2), xi măng calcium silicate có nhựa Resin với Niobium (CSCNb2O5) có hàm lượng ban đầu 516mg/ml, pha loãng theo tỷ lệ 1:1, 1:2, 1:4 1:8 Kết cho thấy khác biệt có ý nghĩa phần trăm tế bào sống tiếp xúc với nhóm vật liệu MTA plus nhiều so với phần trăm tế bào sống tiếp xúc với nhóm vật liệu BiodentineTM [27] Qua nghiên cứu khơng có thống cách pha loãng dịch chiết kết nghiên cứu khác Nghiên cứu cho thấy BiodentineTM nồng độ chưa pha loãng độc tế bào, pha lỗng khơng độc [67] Và có nghiên cứu cho thấy dịch chiết BiodentineTM tỷ lệ pha lỗng 1:1 độc với tế bào dịng Saos-2, với tỷ lệ pha lỗng 1:2, 1:4 1:8 dịch chiết BiodentineTM khơng độc với tế bào [27] Tương tự với MTA, dịch chiết MTA độc với tế bào nồng độ chưa pha lỗng, với nồng độ pha lỗng khơng độc với tế bào [64] Cũng có nghiên cứu cho thấy dịch chiết BiodentineTM nồng độ chưa pha lỗng nồng độ pha lỗng khơng độc với tế bào [27], [38] Dựa kết chúng tơi tiến hành nghiên cứu độc tính tế bào hBMSCs với dịch chiết BiodentineTM MTA nồng độ sau: nồng độ chưa pha loãng (100%), nồng độ pha loãng 50%, 25%, 12,5% 6,25% Từ chúng tơi xác định nồng độ gây độc dịch chiết nồng độ tiến hành đánh giá tăng sinh tế bào hBMSCs 4.1.4 Đánh giá độc tính dựa vào tiêu chuẩn ISO 10993-5:2009, tạo dịch chiết dựa theo tiêu chuẩn ISO 10993-12:2012 Trước có nghiên cứu thiết kế đánh giá độc tính với thử nghiệm dịch chiết dựa vào tiêu chuẩn ISO 10993-5:2009 nghiên cứu độc tính MTA Fillex dòng nguyên bào sợi Balb/c 3T3 Silva E.J.N.L cộng năm 2013, cách tạo dịch chiết không theo tiêu chuẩn ISO 10993-12:2012 mà thực tạo dịch chiết với tỷ lệ diện tích bề mặt mẫu thử 1ml chất chiết 150mm2: 1ml [54] Tương tự nghiên cứu độc tính BiodentineTM, MTA, GIC nguyên bào sợi nướu người nghiên cứu Zhou H.M cộng vào năm 2013 dựa tiêu chuẩn ISO 10993-5:2009, cách tạo dịch chiết không theo tiêu chuẩn ISO 10993-12:2012 mà thực với tỷ lệ diện tích bề mặt mẫu thử 1ml chất chiết 250mm2: 1ml [67] Dịch chiết tạo phụ thuộc vào tỷ lệ diện tích bề mặt mẫu thử 1ml chất chiết [2] Trong nghiên cứu chúng tơi tiến hành đánh giá độc tính BiodentineTM MTA tế bào hBMSCs thử nghiệm dịch chiết Quy trình chiết mẫu thực dựa tiêu chuẩn ISO 10993-12:2012 diện tích bề mặt mẫu thử 1ml chất chiết 300mm2: 1ml, dịch chiết có nồng độ sau: nồng độ chưa pha loãng (100%), nồng độ pha loãng 50%, 25%, 12,5% 6,25% 4.2 Bàn luận kết đánh giá độc tính dịch chiết BiodentineTM, MTA tế bào gốc trung mô tủy xƣơng ngƣời 4.2.1 Nguồn tế bào chuẩn bị cho nghiên cứu Khi tế bào đạt 80-90% độ phủ kín bề mặt dụng cụ ni, tiến hành cấy chuyền nhằm cung cấp không gian, chất dinh dưỡng cho tế bào tăng sinh phát triển, trì dịng tế bào có Qua nhiều lần cấy chuyền, tế bào có khả bám dính tăng sinh nhân lên số lượng, giúp loại bỏ dần tế bào không mong muốn, giữ lại tế bào tiềm tăng sinh dài hạn tự làm Khi vừa cấy chuyền, tế bào có dạng hình trịn lơ lửng môi trường Tế bào bắt đầu bám bề mặt dụng cụ ni sau 24 cấy chuyền (Hình 3.1) Tế bào lúc có hình dạng trải rộng, dạng hình thoi đặc trưng giống nguyên bào sợi, nhân lớn hình oval, tế bào chất nhiều, có bào tương, khả tăng sinh chậm ảnh hưởng Trypsin-EDTA 0,25% tách tế bào Sau ngày, tế bào thích nghi dần với bề mặt ni cấy bắt đầu tăng sinh mạnh Sau ngày cấy chuyền tế bào trải thành lớp đơn phủ kín bề mặt dụng cụ ni chủ yếu có dạng hình thoi ngun bào sợi, sẵn sàng để cấy chuyền sang hệ (Hình 3.7) Theo nghiên cứu Ren J cộng (năm 2013) cho thấy tế bào hBMSCs hệ P3-P5 [52] có độ đồng cao Tế bào ổn định lặp lại thử nghiệm, làm giảm thiểu sai biệt thí nghiệm Trong nghiên cứu chúng tơi, hệ P4 chọn để tiến hành thí nghiệm đánh giá đáp ứng tế bào hBMSCs tiếp xúc với BiodentineTM MTA 4.2.2 Phần trăm tế bào sống tế bào gốc trung mô tủy xƣơng ngƣời tiếp xúc với dịch chiết BiodentineTM MTA Nghiên cứu chúng tơi thực đánh giá độc tính BiodentineTM, MTA dạng dịch chiết với nồng độ khác 100%, 50%, 25%, 12,5% 6,25% tế bào hBMSCs Kết cho thấy nồng độ chưa pha lỗng (100%) BiodentineTM MTA độc, phần trăm tế bào sống nhóm BiodentineTM thấp so với nhóm MTA, khác biệt có ý nghĩa thống kê (α=0,05) Từ nồng độ pha lỗng 50% dịch chiết BiodentineTM MTA không độc tế bào Bên cạnh đó, nồng độ pha lỗng 50%, 25%, 12,5% 6,25% phần trăm tế bào sống nhóm BiodentineTM thấp so với nhóm MTA, khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (α=0,05) Kết nghiên cứu cho thấy MTA nồng độ chưa pha loãng độc với tế bào hBMSCs, điều phù hợp với kết nghiên cứu Yoshino P cộng (2013) Tác giả cho dịch chiết MTA nồng độ chưa pha loãng độc với nguyên bào sợi nướu người [64] Trong Margunato S cộng (năm 2015) nghiên cứu độc tính dịch chiết chưa pha lỗng BiodentineTM, MTA, MM – MTA tế bào hBMSCs, kết cho thấy sau 24 ba dịch chiết không độc [44] Kết khác với kết thu Sự khác nghiên cứu thực tạo dịch chiết khối vật liệu vừa đơng cứng hồn tồn, nghiên cứu Marguno cộng thực mẫu dịch chiết MTA đơng cứng hồn tồn sau 24 Theo kết nghiên cứu Keiser K.C cộng (năm 2000) cho nồng độ chưa pha lỗng, MTA dạng vừa đơng cứng hồn tồn độc dạng đơng cứng hồn tồn sau 24 [33] Do đó, nghiên cứu chúng tơi cho thấy dịch chiết MTA có nồng độ chưa pha lỗng độc với tế bào hBMSCs hồn tồn hợp lí Trong nghiên cứu nhận thấy BiodentineTM nồng độ chưa pha loãng độc với tế bào hBMSCs, điều phù hợp với kết nghiên cứu Lee B.N cộng (2014), BiodentineTM nồng độ chưa pha lỗng độc với tế bào dịng C3H10T1/2 [40] Trong nhiều nghiên cứu khác cho BiodentineTM nồng độ chưa pha lỗng khơng độc với tế bào Nghiên cứu Laurent P.và cộng (2008) kết luận BiodentineTM không gây độc cho nguyên bào sợi tủy người nồng độ [38] Nhóm nghiên cứu Kucukkaya S (2016) cho thấy dịch chiết chưa pha lỗng BiodentineTM khơng gây độc cho nguyên bào sợi dây chằng nha chu [37] Sự khác nghiên cứu thực dịng tế bào khơng giống Cịn với nghiên cứu chúng tơi thực với tế bào hBMSCs phân lập trực tiếp từ mẫu xương hàm Dịch chiết BiodentineTM nồng độ chưa pha lỗng độc nhóm MTA giải thích BiodentineTM MTA khác phần chất lỏng BiodentineTM calcium cloride chất hydrosolube polymer biến đổi MTA nước cất (cịn phần bột hai có thành phần tương tự nhau) Năm 2013, Kang J.Y cộng chứng minh MTA trộn với calcium cloride độc với tế bào MTA trộn với nước cất [32] Cho nên calcium cloride xem nguyên nhân dẫn đến tính độc tế bào dịch chiết nồng độ chưa pha loãng BiodentineTM so với MTA Những nghiên cứu đánh giá độc tính lên tế bào sử dụng dịch chiết BiodentineTM, MTA pha loãng theo nhiều cách khác nhìn chung, pha lỗng chúng khơng độc với tế bào tế bào dòng Saos-2, nguyên bào sợi tủy người, tế bào dòng C3H10T1/2, nguyên bào sợi dây chằng nha chu người khơng có khác biệt BiodentineTM MTA [27], [38], [40] Điều hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu (Biểu đồ 3.1) Trong nghiên cứu cho thấy phần trăm tế bào sống tăng nồng độ dịch chiết BiodentineTM MTA pha loãng, nồng độ dịch chiết pha loãng đến giá trị định khơng có khác biệt phần trăm tế bào sống nồng độ (Biểu đồ 3.1 3.2) Điều hoàn phù hợp với nghiên cứu trước thực tế bào dòng Saos-2, nguyên bào sợi tủy ngươi, tế bào dòng C3H10T1/2 [27], [38], [40] Mặc dù nhiều kết nghiên cứu in vitro độc tính MTA độc khơng dạng chưa pha lỗng thực tế lâm sàng chứng minh MTA có nhiều thành công xem tiêu chuẩn vàng điều trị che tuỷ trực tiếp, trám ngược vĩnh viễn, đóng chóp vĩnh viễn gần hai mươi năm qua [50] Rõ ràng có khác biệt kết nghiên cứu in vitro thực tế ứng dụng lâm sàng Trên lâm sàng, MTA BiodentineTM sử dụng môi trường miệng , chúng tiếp xúc với mơ có chứa dịch sinh lý [35] Dịch sinh lý bao gồm máu, huyết thanh, huyết tương, dịch ngà, dịch nướu… nguồn cung cấp ion Phosphate thể Nên dựa đặc tính nghiên cứu Gandolfia M.G cộng (năm 2010) chứng minh đặc tính lý hố bề mặt calcium silicate thay đổi theo thời gian dung dịch đệm Phosphate dẫn đến thay đổi nguyên bào xương [25] Những dịch mô pha loãng nồng độ vật liệu theo thời gian Điều khác với thiết kế nghiên cứu in vitro vật liệu tiếp xúc trực tiếp với tế bào Nhiều nghiên cứu in vitro cho thấy MTA nồng độ pha lỗng khơng độc với tế bào [38], [40], [64] Kết nghiên cứu chúng tơi nhận thấy độc tính BiodentineTM MTA lên tế bào hBMSCs khơng có khác biệt mặt thống kê Điều phù hợp với nhiều nghiên cứu khác nguyên bào sợi dây chằng nha chu người, nguyên bào sợi tủy người, tế bào dòng C3H10T1/2 tế bào hBMSCs Sự khác biệt độc tính BiodentineTM MTA khơng có ý nghĩa [37], [38], [40], [44] Như kết luận BiodentineTM có tính tương hợp sinh học in vitro tương tự MTA 4.3 Bàn luận phƣơng pháp đánh giá tăng sinh dịch chiết BiodentineTM MTA tế bào gốc trung mô tủy xƣơng ngƣời 4.3.1 Chọn dịch chiết nồng độ pha loãng 6,25% Cho đến nay, có hai cách chọn lựa dịch chiết để đánh giá tăng sinh tế bào chọn tất nồng độ để đánh giá tăng sinh tế bào, chọn nồng độ pha loãng để đánh giá tăng sinh Đầu tiên cách chọn tất nồng độ để đánh giá tăng sinh tế bào Điển hình trường hợp nghiên cứu Yoshino P cộng (2013) tiến hành đánh giá tăng sinh nguyên bào sợi dây chằng nha chu người tất dịch chiết MTA, MTA Fillapex (Angelus) xi măng Portland với nồng độ chưa pha loãng, nồng độ pha loãng 50%, 25%, 12,5% 6,25% [64] Cịn xét pha lỗng theo tỷ lệ Ma J cộng (2011) đánh giá tăng sinh tế bào tất tỷ lệ dịch chiết ERRM Putty, ERRM Paste MTA xám, IRM, Cavit G gồm có tỷ lệ chưa pha loãng, tỷ lệ pha loãng 1:1, 1:2, 1:4 1:8 để đánh giá tăng sinh nguyên bào sợi nướu người [42] Khi đánh giá tăng sinh nguyên bào sợi nướu người Zhou H.M cộng (năm 2013) tiến hành với dịch chiết BiodentineTM, MTA GIC gồm tỷ lệ chưa pha loãng, tỷ lệ pha loãng 1:1, 1:2, 1:4 1:8 [67] Hay chọn tất hàm lượng vật liệu dịch chiết để đánh giá tăng sinh tế bào Năm 2014, Luo Z cộng nghiên cứu tăng sinh tế bào gốc tủy người tiếp xúc với dịch chiết BiodentineTM hàm lượng 0,02 mg/ml, 0,2 mg/ml, mg/ml, 20mg/ml [41] Cách thứ hai chọn tỷ lệ pha loãng dịch chiết, nồng độ pha loãng dịch chiết hay hàm lượng định để đánh tăng sinh tế bào Trong nghiên cứu trước Zanini M cộng (năm 2012) dùng hàm lượng trung gian 1mg/ml BiodentineTM để đánh giá tăng sinh tế bào tủy chuột [65] Năm 2015, Gomes-Cornelio A.L cộng thực đánh giá tăng sinh tế bào dòng Saos-2 nhóm vật liệu MTA Plus, BiodentineTM, xi măng calcium silicate có nhựa Resin với Zirconium (CSCRZrO2), xi măng calcium silicate có nhựa Resin với Niobium (CSCNb2O5) tỷ lệ pha lỗng 1:8 [27] Hiện chưa có nghiên cứu đánh giá tăng sinh tế bào hBMSCs BiodentineTM MTA dạng dịch chiết pha loãng Do đó, nghiên cứu chúng tơi thực để đánh giá tăng sinh tế bào hBMSCs tiếp xúc với dịch chiết pha loãng BiodentineTM, MTA Sự khác biệt nồng độ pha loãng lựa chọn tùy thuộc vào dòng tế bào khác Trong nghiên cứu chúng tơi, nồng độ pha lỗng chọn để đánh giá tăng sinh dòng tế bào hBMSCs 6,25% Chúng chọn BiodentineTM MTA nồng độ pha lỗng 6,25% dựa vào tiêu chuẩn đánh giá độc tính cấp tính vật liệu theo tiêu chuẩn ISO 10993-5:2009 dịch chiết vật liệu phải khơng độc Sau tiến hành nghiên cứu đánh giá tăng sinh tế bào tiếp xúc với dịch chiết không độc Cho nên để đánh giá tăng sinh tế bào hBMSCs vật liệu yêu cầu tiên nồng độ pha lỗng định vật liệu khơng độc với tế bào Dịch chiết BiodentineTM, MTA có nồng độ pha lỗng 50%, 25%, 12,5% 6,25% không độc với tế bào hBMSCs Khi bốn nồng độ pha lỗng lựa chọn Nồng độ pha lỗng 50% 25% khơng lựa chọn tế bào hBMSCs tiếp xúc với dịch chiết BiodentineTM, MTA nồng độ có phần trăm tế bào sống thấp so với nhóm chứng âm, khác biệt có ý nghĩa thống kê (α=0,05) Tuy nhiên nồng độ pha lỗng 12,5% 6,25% phần trăm tế bào sống nhóm BiodentineTM nhóm MTA khơng có khác biệt so với nhóm chứng âm (Biểu đồ 3.1) Do chúng tơi định chọn nồng độ pha lỗng 6,25% dịch chiết BiodentineTM MTA để đánh giá tăng sinh tế bào hBMSCs 4.3.2 Xác định mật độ tế bào gốc trung mô tủy xƣơng ngƣời phƣơng pháp buồng đếm hồng cầu tiếp xúc với dịch chiết BiodentineTM, MTA Khi đánh giá tăng sinh tế bào đánh giá phương pháp gián tiếp trực tiếp Phương pháp gián tiếp đánh giá thơng qua mật độ quang, từ tính phần trăm tế bào sống thời điểm Dựa vào phần trăm tế bào sống thời điểm đưa nhận xét tăng trưởng tế bào Đã có nhiều nghiên cứu thực theo phương pháp để đánh giá tăng sinh tế bào Có thể kể đến Zanini M cộng (năm 2012) tiến hành đánh giá tăng sinh tế bào tủy chuột cho tiếp xúc với BiodentineTM nồng độ 1mg/ml phương pháp MTS [65] Năm 2013, Yoshino P cộng tiến hành đánh giá tăng sinh nguyên bào sợi dây chằng nha chu tất nồng độ chưa pha loãng, nồng độ pha loãng 50%, 25%, 12,5% 6,25% phương pháp MTT [64] Năm 2014, Luo Z cộng nghiên cứu tăng sinh tế bào gốc tủy người phương pháp MTT tiếp xúc với BiodentineTM hàm lượng 0,02mg/ml, 0,2mg/ml, 2mg/ml, 20mg/ml [41] Thực vậy, phần lớn nghiên cứu thực thường đánh giá tăng sinh tế bào thông qua mật độ quang Tuy nhiên phương pháp không xác định mật độ tế bào mà cho thấy diện tế bào dịch chiết thông qua mật độ quang Từ đó, đánh giá khả tăng trưởng tế bào thời điểm khảo sát Trong nghiên cứu thực xác định mật độ tế bào (số lượng tế bào trung bình giếng) phương pháp buồng đếm hồng cầu, phương pháp xem tiêu chuẩn để đếm tế bào chúng có độ xác cao, trực quan hiệu [43], [56] 4.4 Bàn luận kết tăng sinh tế bào gốc trung mô tủy xƣơng ngƣời tiếp xúc với dịch chiết BiodentineTM MTA nồng độ pha loãng 6,25% vào ngày 2, 4, 6, 10 Nhiều nghiên cứu thực đánh giá tăng sinh nhiều dòng tế bào khác cho kết khác Nhìn chung nhóm vật liệu có dịch chiết pha lỗng tăng sinh cực đại vào ngày nguyên bào sợi nướu người [42], [67] hay ngày thứ tế bào gốc tủy người [41] Gần có nghiên cứu Margunato S cộng (2015) đánh giá tăng sinh tế bào hBMSCs tiếp xúc với dịch chiết chưa pha loãng BiodentineTM, MTA MM – MTA Kết cho thấy ba dịch chiết không độc với tế bào, phần trăm tế bào sống tiếp xúc với dịch chiết (chưa pha lỗng) tăng sinh tuyến tính từ ngày 1, qua ngày đến ngày tăng sinh mạnh mẽ vào ngày 14 Khơng có khác biệt BiodentineTM, MTA MM – MTA phần trăm tế bào sống ngày 1, 3, 7, 14 [44] Nghiên cứu đánh giá tăng sinh tế bào hBMSCs tiếp xúc với dịch chiết BiodentineTM, MTA nồng độ pha loãng 6,25% thơng qua mật độ tế bào trung bình vào ngày thứ 2, 4, 6, 10 Kết thu cho thấy nhóm BiodentineTM MTA có mật độ tế bào trung bình tăng từ ngày đến ngày 4, đạt giá trị lớn vào ngày thứ 4, giảm dần đến ngày 10 Sự tăng sinh tế bào hBMSCs hai nhóm BiodentineTM, MTA đạt đỉnh vào ngày 4, nhóm chứng vào ngày (biểu đồ 3.5) Mật độ tế bào trung bình hai nhóm BiodentineTM MTA vào ngày thấp so với nhóm chứng, khác biệt có ý nghĩa thống kê (α=0,05) Điều khác với nghiên cứu Margunato S cộng (2015) cho thấy tế bào hBMSCs nhóm BiodentineTM MTA tăng sinh tuyến tính từ ngày đến đạt đỉnh vào ngày 14 Tế bào tăng sinh hai nhóm BiodentineTM, MTA cao so với nhóm chứng, khác biệt có ý nghĩa thống kê (α=0,05) [44] Sự khác biệt nghiên cứu với Margunato S tác giả đánh giá tăng sinh dịch chiết chưa pha loãng BiodentineTM MTA Trong đó, nghiên cứu lại thực dịch chiết với nồng độ pha lỗng 6,25% Tuy nhiên có điểm giống hai nghiên cứu khơng có khác biệt tăng sinh tế bào hai nhóm MTA BiodentineTM [44] Kết mật độ tế bào trung bình nhóm chứng cho thấy khoảng thời gian từ ngày đến ngày giai đoạn hồi phục quần thể tế bào sau trình cấy chuyền đạt bám dính ổn định Mật độ tế bào bắt đầu tăng từ ngày đến ngày (biểu đồ 3.5) Đây giai đoạn tăng sinh quần thể tế bào, giai đoạn tế bào ổn định phát triển, trình trao đổi chất diễn mạnh mẽ giai đoạn Tế bào tăng sinh đạt đỉnh cực đại vào ngày Sau thời điểm mật độ cực đại, tế bào vào giai đoạn cân bằng, tốc độ phân chia trao đổi chất tế bào bắt đầu giảm, số lượng tế bào chết cân với lượng tế bào sinh Mật độ tế bào giảm từ ngày xuống ngày 10 (biểu đồ 3.5) Diện tích bề mặt ni cấy khơng đổi, tế bào liên tục tăng sinh gây tượng kìm hãm tiếp xúc, tế bào bắt đầu chết đi, số tế bào chết cao số tế bào sinh Sự sống tế bào bị ảnh hưởng nhiều yếu tố, yếu tố quan trọng pH Theo quy định ISO 10993-5:2009 yêu cầu pH tối ưu cho môi trường nuôi cấy tế bào 7,2-7,4 [57] Trong đó, BiodentineTM MTA biết đến vật liệu dạng hydrate hố có pH kiềm [34], [45], [67] Điều phù hợp với kết thu thực đo pH vật liệu Trước đây, có nghiên cứu in vitro chứng minh pH kiềm ảnh hưởng đến tăng sinh tế bào [45] Do đó, khác biệt mật độ tế bào trung bình với nhóm chứng giải thích pH kiềm ảnh hưởng đến sống tế bào nhóm BiodentineTM MTA Hai vật liệu mà chúng tơi nghiên cứu có khả phóng thích ion calcium ion hydroxide dạng đơng cứng, ion hydroxide tạo môi trường pH kiềm Tuy nhiên điều kiện lâm sàng, pH kiềm giúp trung hồ pH acid q trình viêm Sự điều hồ giúp môi trường trở pH tối ưu cho lành thương Bên cạnh ion calcium phóng thích từ vật liệu quan trọng q trình lành thương khống hố mơ [34] Trong nghiên Tran X.V cộng (năm 2012) nghiên cứu ảnh hưởng xi măng có thành phần calcium silicate che tủy trực tiếp chuột chứng minh pH kiềm cho nguyên nhân gây hoại tử mô tủy chỗ tiếp xúc trực tiếp với vật liệu MTA BiodentineTM Tuy nhiên sau ngày trình viêm giảm, sau 14 ngày tạo cầu ngà sửa chữa [62] Mặc dù mật độ tế bào trung bình hBMSCs tiếp xúc với dịch chiết BiodentineTM, MTA thấp mật độ tế bào trung bình nhóm chứng, BiodentineTM, MTA có tác dụng tích cực lên khống hố tái tạo mô cứng nhờ khả tiết ion calcium đóng vai trị quan trọng q trình lành thương mô xương [22] 4.5 Hạn chế đề tài Trong q trình thí nghiệm, chúng tơi đánh giá định tính pH dịch chiết BiodentineTM MTA nồng độ khác mà chưa định lượng pH q trình tăng sinh tế bào Hiện chưa có nghiên cứu BiodentineTM vai trò mối liên quan ion calcium phóng thích từ vật liệu với tăng sinh tế bào phần bàn luận sử dụng kết nghiên cứu MTA thành phần hai vật liệu BiodentineTM MTA giống nhau, nhiên điều chưa xác BiodentineTM có bổ sung calcium carbonate 4.6 Ý nghĩa lâm sàng ứng dụng đề tài Nghiên cứu nghiên cứu sở, bước đầu xác định tính tương hợp sinh học với tế bào gốc trung mô tủy xương người BiodentineTM so với MTA Kết nghiên cứu cung cấp chứng khoa học hiệu vật liệu mức độ tế bào ứng dụng điều trị thủng buồng tủy , thủng ống tủy , trám ngược ... nghiên cứu in vitro nhằm đánh giá hiệu BiodentineTM MTA nguyên bào xương MG-63 Kết cho thấy BiodentineTM có tính tương hợp sinh học tương tự MTA, thời gian đông BiodentineTM ngắn so với MTA Cũng... thương xương BiodentineTM, đặc biệt so sánh với MTA Để hiểu rõ vấn đề thực nghiên cứu Tương hợp sinh học in vitro Biodentine với nguyên bào xương Mục tiêu tổng quát: Xác định khả đáp ứng tế bào. .. bào dòng C3H10T1/2 tế bào hBMSCs Sự khác biệt độc tính BiodentineTM MTA khơng có ý nghĩa [37], [38], [40], [44] Như kết luận BiodentineTM có tính tương hợp sinh học in vitro tương tự MTA 4.3 Bàn