Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ 24 (2008) 205-210 Ảnh hưởng nguồn chất kiểu lên men ñến suất chất lượng cellulose vi khuẩn Nguyễn Thúy Hương* Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường ðại học Bách Khoa, ðại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 268 Lý Thường Kiệt, phường 14, quận 10, Hồ Chí Minh, Việt Nam Nhận ngày tháng năm 2007 Tóm tắt Nghiên cứu nhằm khảo sát khả lên men BC nhiều loại nguyên liệu, ảnh hưởng nguồn chất kiểu lên men ñến suất chất lượng cellulose vi khuẩn Kết thu ñược sau: - Có thể lên men sản xuất BC từ rỉ ñường, nước mía, dịch thải trái Chủng BC16 thích hợp cho kiểu lên men môi trường rỉ đường, BC17 với nước mía, BC18 với dịch trái - Khảo sát tính ổn định giống cho thấy: Mật ñộ Cel- (mất khả tạo BC) tăng dần sau ñợt cấy chuyền ngày chiếm ưu Mật độ Cel- cao mơi trường khơng bổ sung ethanol - Ngồi hình dạng bên ngồi hồn tồn khác nhau, độ chịu lực BC ni cấy bề mặt cao nhiều so với nuôi cấy chìm Tuy nhiên khả giữ nước ẩm độ BC ni cấy chìm cao BC ni bề mặt Từ khóa: Acetobacter xylinum, Bacterial Cellulose, BC Mở ñầu∗ nguồn chất kiểu lên men ñến suất chất lượng cellulose vi khuẩn [3] Cellulose vi khuẩn (Bacterial Cellulose BC) Acetobacter xylinum tạo có nhiều ứng dụng lĩnh vực khác [1,2] Ở Việt Nam, nguồn cellulose vi khuẩn ñược sản xuất từ nguồn nguyên liệu nước dừa già Nguồn nguyên liệu nước dừa già có số lượng hạn chế, có số địa phương phía Nam Ngun liệu nước dừa già hồn tồn khơng đáp ứng cho sản xuất BC quy mơ lớn khó ứng dụng rộng rãi Vật liệu phương pháp - Giống vi sinh vật: Các chủng A.xylinum có sưu tập giống [4] - Mơi trường ni cấy: Các mơi trường điều chế từ nguồn ngun liệu rỉ đường,nước mía, dịch trái phế thải, dịch chua ñậu nành - Kiểu lên men: Ni cấy bề mặt khay nhựa có kích thứơc 30x25x7cm, nhiệt độ phịng, pH=4,5 Ni cấy chìm điều kiện lắc (250 vịng/phút) sục khí bình erlen 1000 ml Nghiên cứu nhằm khảo sát khả lên men BC nhiều loại nguyên liệu, ảnh hưởng _ ∗ ðT: 84-8-8639341 E-mail: nthuong13567@yahoo.com 205 206 N.T Hương / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ 24 (2008) 205-210 lượng khơng đổi để xác định trọng lượng BC khơ - Xác định ẩm độ theo TCVN 4326-2001, tro theo TK.AOAC 900-02, cellulose theo TCVN 4329-93 - Xác ñịnh ñộ chịu lực theo TCVN 358-70 - Nghiên cứu tính ổn định giống: Tính ổn định giống ñược nghiên cứu phương pháp cải tiến Ben-Bassat [5] Trong điều kiện ni cấy bề mặt, mơi trường ủ 48 giờ, thu nhận dịch huyền phù Lớp màng cellulose dùng để cấy vào mơi trường lần ni cấy Q trình lặp lại lần Huyền phù tế bào sau lần chuyển pha lỗng trải mơi trường thạch đĩa, ủ 300C Sau khoảng thời gian đó, khuẩn lạc A.xylinum khảo sát kiểm tra độ phóng đại 12 lần Chọn lọc ñếm thể ñột biến Cel- Q trình áp dụng tương tự cho ni cấy lắc Thành phần hố học nguyên liệu thay nước dừa già sử dụng báo cáo trình bày tóm tắt qua bảng - ðịnh lượng vi sinh vật phương pháp đếm gián tiếp khuẩn lạc mơi trường thạch đĩa - Xác định khối lượng BC thơ: sau thu hoạch để nước hồn tồn (30 phút) cân trọng lượng tươi sấy 1050C cho ñến Qua kết khảo sát sơ bộ, dựa vào nhu cầu dinh dưỡng ñăc ñiểm sinh lý A.xylinum, nguồn nguyên liệu ñược sử dụng làm môi trường dinh dưỡng nuôi cấy, nhân giống lên men thu nhận BC Kết bàn luận 3.1 Phân tích sơ thành phần nguyên liệu Bảng Một số thành phần hoá học nguyên liệu thay nước dừa già Rỉ ñường ðường tổng: 52% Protein: 2,5% pH:7,5 Nước mía ðường tổng:14% ðộ khô, 0Bx: 18,5 pH: 5,3 Môi trường rỉ ñường Tiến hành phân lập nhân giống môi trường rỉ ñường ñể sơ tuyển chủng vi khuẩn phù hợp nguồn nguyên liệu rỉ ñường Kết sau ngày ni cấy thu sau: Xét yếu tố mật ñộ tế bào khả sản sinh cellulose, có chủng phát triển nhanh ðó Phụ phẩm dịch trái ðường tổng: 8,7% ðộ khô, 0Bx: 15 pH: 5,5 chủng A.xylinum BC16, BC25 BC34 Mật ñộ tế bào chủng ñạt 45 triệu tế bào/ml khả sản sinh BC cao Trong chủng trên, A.xylinum BC16 BC 34 có ưu lên men bề mặt lên men chìm (bảng 2) Bảng Tuyển chọn giống qua mật ñộ tế bào sản lượng BC mơi trường rỉ đường Tên chủng Mật độ tế bào (triệu tế bào/ml) Lên men bề mặt (g/l) Sản lượng BC tươi Sản lượng BC khô BC7 BC8 BC16 BC17 BC18 BC25 BC34 12,81 35,60 46,90 40,54 40,07 45,65 45,05 Phát triển chậm sau ngày, màng mỏng 400 3,49 810 7,11 450 3,55 380 3,45 780 7,02 800 7,10 Lên men chìm (g/l) Sản lượng BC tươi Sản lượng BC khô 128 515 Phát triển chậm 210 Không phát triển 650 1,09 4,59 1,78 5,65 N.T Hương / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Cơng nghệ 24 (2008) 205-210 Trên mơi trường rỉ đường chủng vi khuẩn A.xylinum BC16, BC25 BC34 ñều tạo BC tốt lên men bề mặt ñạt lượng BC khơ từ 7,02 đến 7,11 g BC khơ/l mơi trường Trong ni cấy chìm có chủng BC 34 tốt đạt 5,10gBC khơ /l ni cấy lắc 5,65 g/l có sục khí 207 sát ñều phát triển tốt, cho mật ñộ tế bào sau ngày nuôi cấy cao chênh lệch từ 32,80 đến 48,20 triệu tế bào /ml Vì chúng tơi sử dụng chủng để khảo sát thử nghiệm mơi trường nước mía Kết bảng cho thấy, chủng ñều phát triển nhanh sản sinh BC cao theo kiểu lên men bề mặt Với kiểu lên men chìm có chủng ñựợc ghi nhận A.xylinum BC 17 Môi trường nước mía Trên mơi trường nước mía, chủng khảo Bảng Tuyển chọn giống qua mật ñộ tế bào sản lượng BC mơi trường nước mía Tên chủng Mật ñộ tế bào (triệu tế bào/ml) BC7 BC8 BC16 BC17 BC18 BC25 BC34 32,80 40,58 45,95 45,05 48,20 41,76 42,85 Lên men bề mặt (g/l) Sản lượng BC Sản lượng BC tươi khô Phát triển chậm 740 6,70 725 6,66 810 7,12 755 6.85 750 6,85 750 6,85 Lên men chìm (g/l) Sản lượng BC Sản lượng BC tươi khô Không phát triển 90 480 360 186 Không phát triển 0,70 4,30 3,20 1,25 dịch trái MT1 MT2 với kiểu lên men bề mặt, lắc sục khí thể qua bảng Mơi trường tận dụng phụ phẩm trái Nghiên cứu nhằm việc lên men sản xuất BC từ nguồn nguyên liệu phụ phẩm trái cây, cụ thể nước ép mắt dứa phụ phẩm xồi – dứa từ quy trình sản xuất xồi – dứa đóng hộp nhà máy chế biến thực phẩm Phat-Sin (Bình Dương) phương pháp lên men khác Tuyển chọn nhanh chủng vi khuẩn A.xylinum BC7, BC8, BC16, BC17, BC18, BC25, BC34 mơi trường dịch trái cây, chúng tơi sàng lọc chủng sản sinh cellulose môi trường dịch trái ðó chủng A.xylinum BC16, BC17, BC25, BC28 Sản lượng BC thu từ mơi trường So sánh với môi trường khác (nước dừa già, rỉ ñường, nước mía), rõ ràng sản lượng BC thu ñược từ mơi trường phụ phẩm trái đạt khoảng 70%-80% (với A.xylinum BC25 chủng cho hiệu cao nhất) Tuy nhiên việc sử dụng nguồn phụ phẩm cịn có ý nghĩa giải nhiễm mơi trường Sản lượng BC khơng cao cịn khâu tuyển chọn giống chưa ñầy ñủ Trong giới hạn báo, dừng lại mức thăm dị ban đầu Bảng Sản lượng BC thu từ môi trường phụ phẩm trái (g/l) Chủng BC16 BC17 BC25 BC28 Môi trường mắt dứa MT1 Bề mặt Lắc BC BC BC BC tươi khô tươi khô 498 4,35 0,00 0,00 532 4,89 308 2,79 650 5,66 455 4,15 480 4,28 0,00 0,00 Sục khí BC tươi 0,00 485 520 0,00 BC khô 0,00 4,28 4,92 0,00 Môi trường phụ phẩm xoài dứa MT2 Bề mặt Lắc Sục khí BC BC BC BC BC tươi khơ tươi khơ tươi 400 3,50 0,00 0,00 0,00 406 3,52 325 2,85 450 572 5,15 396 3,2 445 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 BC khô 0,00 4,13 4,10 0,00 208 N.T Hương / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Cơng nghệ 24 (2008) 205-210 3.2 Nghiên cứu tính ổn ñịnh chủng A.xylinum ñược sàng lọc mơi trường rỉ đường theo kiểu ni cấy Trở ngại gặp phải ni cấy chìm, A.xylinum-chủng giống sản sinh cellulose có khuynh hướng trở lại dạng đột biến không sản sinh cellulose (ký hiệu Cel-) Các thể ñặc ñiểm sinh học A.xylinum ñã ñược nhiều tác giả ñề cập ñến [5] Nuôi cấy bề mặt Khảo sát mơi trường rỉ đường kiểu ni cấy bề mặt khơng có ảnh hưởng tác động đáng kể đến hình thành thể Cel- Trong tồn đợt cấy chuyền ni cấy bề mặt hịan tồn khơng thu nhận dạng Cel- Ni cấy chìm Bảng Mật độ Cel- sau ñợt cấy chuyền (%) Lần cấy chuyền Chủng BC16 BC25 BC34 BC16 BC25 BC34 BC16 BC25 BC34 Mật ñộ Cel- tăng dần sau ñợt cấy chuyền Khi mật ñộ Cel- tăng, dẫn ñến sinh trưởng phát triển Cel- chiếm ưu Giữa kiểu ni cấy lắc sục khí có khác mật độ Cel- chủng giống Trong chủng khảo sát, BC16 có mật độ Cel- xuất sau đợt ni cấy thấp Khảo sát chủng BC16 môi trường rỉ đường kiểu ni cấy lắc, mơi trường có khơng có bổ sung ethanol, xu hướng gia tăng mật độ Cel- mơi trường khơng có ethanol (sau lần cấy chuyền thứ mật độ Cel- mơi trường có bổ sung ethanol 18 %, môi trường không bổ sung ethanol 25%) Về mặt lý thuyết tế bào Cel- thường xuất điều kiện ni cấy chìm ni cấy môi trường quen thuộc Trong số Nuôi cấy lắc 15 25 10 20 38 15 28 80 30,5 Ni cấy sục khí 5,5 28 15 10 40 17 15,5 58,5 30 nghiên cứu số nhóm tác giả có kết luận chung có mặt ethanol từ 2-5% làm tăng hiệu suất lên men cellulose vi khuẩn [6] Mật độ Cel- giảm mơi trường có ethanol chi phối đến suất lên men BC 3.3 Khảo sát số tính chất BC Nhằm ña dạng sản phẩm BC phù hợp hướng ứng dụng, tạo dạng sản phẩm BC t kiểu nuôi cấy bề mặt (S-BC) nuôi cấy chìm (A-BC) Một số hình ảnh đặc tính dạng sản phẩm S-BC (BC nuôi cấy bề mặt) A-BC (BC ni cấy chìm) thể qua hình 1, bảng N.T Hương / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ 24 (2008) 205-210 Bảng ðặc tính sản phẩm BC STT Sản phẩm BC (Kích thước) ðộ chịu lực ðộ hút nước Cellulose Tro (%) (N/cm2) (g nước/g (%) cellulose Màng S-BC (20cmx25cm) 48.105 45 68 0,05 Miếng nhỏ S-BC 48.105 (5mm x3-5mm) 36 68 0,05 36.104 120 61 0,04 36.104 115 61 0,04 Hạt nhỏ A-BC (1-1,5 mm) Bột, Sợi A-BC (4-5mm) Hình Hình ảnh sản phẩm BC 209 210 N.T Hương / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Cơng nghệ 24 (2008) 205-210 Phương pháp tạo dạng sản phẩm BC sau: - BC dạng màng: Màng S-BC sau xử lý, sấy (ẩm ñộ từ 10-15%), khử trùng 1210 C - 20 phút - BC dạng miếng nhỏ: Màng S-BC cắt thành miếng nhỏ kích thước 2x2cm, sau xử lý, sấy (ẩm ñộ từ 10-15%), khử trùng 1210C-20 phút - BC dạng hạt nhỏ: Hạt A-BC sau xử lý, sấy (ẩm ñộ từ 10-15%), khử trùng 1210 C - 20 phút - BC dạng sợi, bột: Sợi A-BC sau xử lý, sấy phun Quá trình sấy phun thực máy Mini Spray Dryer – Yamoto với thơng số phù hợp qua thăm dị (Lưu lượng dịch phun: cm3/s, áp suất phun: kg/cm2, nhiệt ñộ vào: 1500C, nhiệt ñộ ra: 800C) Kết luận - Có thể lên men sản xuất BC từ rỉ đường, nước mía, dịch thải trái Chủng BC16 thích hợp cho kiểu lên men môi trường rỉ ñường BC17 với nước mía, BC18 với dịch trái - Khảo sát tính ổn định giống cho thấy: Mật ñộ Cel- (mất khả tạo BC ) tăng dần sau ñợt cấy chuyền ngày chiếm ưu Mật độ Cel- cao mơi trường khơng bổ sung ethanol - Ngồi hình dạng bên ngồi khác nhau, độ chịu lực BC ni cấy bề mặt (S-BC) cao nhiều so với nuôi cấy chìm (A-BC) Tuy nhiên khả giữ nước ẩm ñộ ABC cao S-BC Tài liệu tham khảo [1] E.J Vandamme, S De Baets, A Vanbaelen, K Joris, P De Wulf, Improved production of bacterial cellulose and its application potential, Polymer Degradation and Stability 59 (1998) 93 [2] F Yoshinaga, N Tonuochi, K Wanatabe, Research progress in production of bacteria cellulose by aeration and agitation culture and its application as a new industrial material, Biosci Biotechnol Biochem 61 (1997) 219 [3] T Tsuchida, F Yoshinaga, Production of bacterial cellulose by agitation culture systems, Pure Appl Chem 69 (1997) 2453 [4] Nguyễn Thúy Hương, Phạm Thành Hổ, Chọn lọc dịng Acetobacter xylinum thích hợp cho loại mơi trường dùng sản xuất cellulose vi khuẩn với quy mô lớn, Tạp chí Di truyền học ứng dụng (2003) 49 [5] A Krystynowicz, W Czaja, A WiktorowskaJezierska, M Goncalves-Miskiewicz, M Turkiewicz, S Bielecki, Factors affecting the yield and properties of bacterial cellulose, Industrial Microbiology and Biotechnolody 29 (2002) 189 [6] T Naritomi, T Kouda, H Yano, F Yoshinaga, Effect of ethanol on bacterial cellulose production from fructose in continuous culture, Fermentation and Bioengineering 85, (1998) 598 Influences of the substrate sources and the fermentation types to the yield and quality of bacterial cellulose Nguyen Thuy Huong Department of Biotechnology, University of Technology, Vietnam National University, Ho Chi Minh City, 268 Ly Thuong Kiet, Ward 14, Dist 10, Ho Chi Minh, Vietnam The bacterial cellulose (BC) produced by Acetobacter xylinum has many applications in different fields This study focused on the BC production by using different raw materials, on detecting the ability of BC production and on the yield of BC strains such as BC16, BC17, BC18 by using the culture of different fermentations We also investigated the mechano-physical characteristics of BC The studies related to the quality of BC show that the tensile strength of BC obtained by static culture is much higher than that obtained by submerged fermentation However, the water absorption ability and humidity of the latter is higher than that of the former ... mặt ethanol từ 2-5% làm tăng hiệu suất lên men cellulose vi khuẩn [6] Mật độ Cel- giảm mơi trường có ethanol chi phối ñến suất lên men BC 3.3 Khảo sát số tính chất BC Nhằm đa dạng sản phẩm BC... 48,20 41,76 42,85 Lên men bề mặt (g/l) Sản lượng BC Sản lượng BC tươi khô Phát triển chậm 740 6,70 725 6,66 810 7,12 755 6.85 750 6,85 750 6,85 Lên men chìm (g/l) Sản lượng BC Sản lượng BC tươi khô... 34 có ưu lên men bề mặt lên men chìm (bảng 2) Bảng Tuyển chọn giống qua mật ñộ tế bào sản lượng BC môi trường rỉ ñường Tên chủng Mật ñộ tế bào (triệu tế bào/ml) Lên men bề mặt (g/l) Sản lượng BC