Khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng và bán định lượng đồng thời acid gallic và acid caffeic trong hai loài thuộc chi balanophora j rg forst ở việt nam

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ THẢO KHẢO SÁT MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG VÀ BÁN ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ACID GALLIC VÀ ACID CAFFEIC TRONG HAI LOÀI THUỘC CHI Balanophora J.R&G.Forst Ở VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2020 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ THẢO Mã sinh viên: 1501458 KHẢO SÁT MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG VÀ BÁN ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ACID GALLIC VÀ ACID CAFFEIC TRONG HAI LOÀI THUỘC CHI Balanophora J.R&G.Forst Ở VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: DS.NCS Nguyễn Thanh Tùng Nơi thực hiện: Bộ môn Dược liệu HÀ NỘI - 2020 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Bộ mơn Dược liệu, trường Đại học Dược Hà Nội, nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ, bảo tận tình thầy cơ, bạn bè gia đình Lời đầu tiên, với tất lòng biết ơn kính trọng, tơi xin chân thành cảm ơn DS.NCS Nguyễn Thanh Tùng, người thầy tận tụy truyền cho nhiệt huyết trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình thực khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể thầy cô, anh chị kỹ thuật viên giúp đỡ, tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành khóa luận Cảm ơn bạn Dương Phương Lan bạn Lê Thị Hiền toàn thể anh chị, bạn nghiên cứu Bộ môn Dược liệu động viên, giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài Xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phịng Đào tạo, tồn thể thầy giáo, cán Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện để tơi lĩnh hội kiến thức quý giá ngành Dược suốt năm học Cuối cùng, xin gửi lời biết ơn vơ sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè bên cạnh, động viên, giúp đỡ, ủng hộ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu hồn thành khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 21 tháng 06 năm 2020 Sinh viên Lê Thị Thảo MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm thực vật chi Balanophora J.R.&G.Forst 1.1.1 Vị trí phân loại chi Balanophora J.R.&G.Forst 1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Balanophora J.R.&G.Forst 1.1.3 Phân bố loài thuộc chi Balanophora J.R.&G.Forst 1.1.3.1 Trên giới 1.1.3.2 Tại Việt Nam 1.2 Thành phần hóa học chi Balanophora J.R.&G.Forst 1.2.1 Các nghiên cứu thành phần hóa học chi Balanophora J.R.&G.Forst giới 1.2.1.1 Tanin 1.2.1.2 Các phenylpropanoid 1.2.1.3 Flavonoid 11 1.2.1.4 Terpenoid 11 1.2.1.5 Sterol 11 1.2.1.6 Các hợp chất khác 12 1.2.2 Các nghiên cứu thành phần hóa học chi Balanophora J.R.&G.Forst Việt Nam 12 1.3 Tác dụng sinh học chi Balanophora J.R.&G.Forst 13 1.3.1 Tác dụng chống oxy hóa dọn gốc tự 14 1.3.2 Tác dụng hạ acid uric máu ức chế enzym xanthin oxidase 14 1.3.3 Tác dụng hạ đường huyết 14 1.3.4 Tác dụng chống viêm giảm đau 15 1.3.5 Tác dụng sinh học khác 15 1.4 Cơng dụng lồi thuộc chi Balanophora J.R.&G.Forst 15 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.2 Phương tiện nghiên cứu 18 2.2.1 Thuốc thử, dung mơi, hóa chất 18 2.2.2 Thiết bị dụng cụ 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu: 19 2.3.1 Khảo sát số tiêu chất lượng dược liệu 19 2.3.1.1 Đặc điểm hiển vi 19 2.3.1.2 Định tính thành phần hóa học 19 2.3.1.3 Xác định tro toàn phần 20 2.3.1.4 Xác định chất chiết dược liệu 21 2.3.1.5 Định lượng polyphenol toàn phần (TPC) dược liệu 22 2.3.2 Bán định lượng đồng thời acid gallic acid caffeic dược liệu 24 2.3.2.1 Nguyên tắc 24 2.3.2.2 Cách tiến hành 24 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26 3.1 Khảo sát số tiêu chất lượng dược liệu 26 3.1.1 Đặc điểm hiển vi 26 3.1.1.1 Mô tả đặc điểm giải phẫu thực vật 26 3.1.1.2 Mô tả đặc điểm bột dược liệu 29 3.1.2 Định tính thành phần hóa học 32 3.1.2.1 Định tính phản ứng hóa học 32 3.1.2.2 Định tính sắc ký lớp mỏng 33 3.1.3 Xác định tro toàn phần 34 3.1.4 Xác định chất chiết dược liệu 35 3.1.5 Định lượng polyphenol toàn phần dược liệu 36 3.2 Bán định lượng đồng thời acid gallic acid caffeic dược liệu 39 3.3 Bàn luận 41 3.3.1 Khảo sát số tiêu chất lượng dược liệu 41 3.3.2 Bán định lượng đồng thời acid gallic acid caffeic dược liệu 43 KẾT LUẬN 45 KIẾN NGHỊ 45 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Nội dung XOD Xanthin oxidase TLC Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng) HPTLC TPC NP/PEG High performance thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng hiệu cao) Total polyphenol content (Hàm lượng polyphenol toàn phần) Natural products/ Polyethylenglycol P/ư Phản ứng STT Số thứ tự TT Thuốc thử GAE Gallic Acid Equivalent (Đương lượng acid gallic) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 1.2 1.3 1.4 2.1 3.1 Tên bảng Trang Phân bố loài thuộc chi Balanophora J.R.&G.Forst giới Phân bố loài thuộc chi Balanophora J.R.&G.Forst Việt Nam Các lignan phân lập từ chi Balanophora J.R.&G.Forst Các coumarin phân lập từ chi Balanophora J.R.&G.Forst Thông tin mẫu nghiên cứu So sánh khác đặc điểm bột mẫu nghiên cứu 11 17 31 3.2 Kết định tính nhóm chất mẫu nghiên cứu 32 3.3 Kết xác định tro toàn phần mẫu nghiên cứu 34 3.4 Kết xác định chất chiết dược liệu 35 3.5 Kết thẩm định độ phù hợp hệ thống phương pháp TPC 36 3.6 Kết thẩm định độ lặp lại phương pháp TPC 37 3.7 Kết thẩm định độ phương pháp TPC 37 3.8 Kết thẩm định LOD LOQ phương pháp TPC 38 3.9 Kết thẩm định độ vững phương pháp TPC 38 3.10 3.11 3.12 Kết xác định hàm lượng polyphenol toàn phần dược liệu Thẩm định phương pháp bán định lượng HPTLC: độ tuyến tính, khoảng tuyến tính, LOD LOQ Hàm lượng acid gallic acid caffeic mẫu thử 38 40 41 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 Tên hình Cấu trúc tanin thủy phân chi Balanophora J.R.&G.Forst Cấu trúc hóa học số phenylpropanoid chi Balanophora J.R.&G.Forst Cấu trúc hóa học số lignan phân lập từ chi Balanophora J.R.&G.Forst Một số khung flavonoid hợp chất phân lập từ chi Balanophora J.R.&G.Forst Một số hợp chất khác phân lập từ chi Balanophora J.R.&G.Forst Việt Nam Trang 8 11 13 3.1 Vi phẫu củ B fungosa subsp indica 27 3.2 Vi phẫu B fungosa subsp indica 27 3.3 Vi phẫu củ B fungosa var globosa 27 3.4 Vi phẫu B fungosa var globosa 27 3.5 Vi phẫu củ B tobiracola 28 3.6 Vi phẫu B tobiracola 28 3.7 Một số đặc điểm bột B fungosa subsp indica 29 3.8 Một số đặc điểm bột B fungosa var globosa 30 3.9 Một số đặc điểm bột B tobiracola 31 3.10 3.11 3.12 3.13 Sắc ký đồ định tính lồi nghiên cứu sau phun TT NP/PEG quan sát bước sóng 366 nm Sắc ký đồ mẫu nghiên cứu sau phun thuốc thử NP/PEG quan sát bước sóng 366 nm Đường biểu diễn tương quan lượng mẫu đưa lên mỏng diện tích pic Đồ thị biểu diễn độ đặc hiệu độ chọn lọc phương pháp HPTLC 33 39 39 40 ĐẶT VẤN ĐỀ Chi Balanophora J.R.&G.Forst., tên tiếng Việt: Dó đất, mười sáu chi thuộc họ Dó đất (Balanophoraceae Rich.) Các loài thuộc chi gọi với tên: Nấm ngọc cẩu, Tỏa dương, Dó đất, Cu chó Trên giới ghi nhận khoảng 19 loài, phân bố chủ yếu vùng nhiệt đới châu Phi châu Úc, từ vùng ôn đới đến nhiệt đới châu Á đảo Thái Bình Dương [52] Theo tài liệu: Danh lục loài thực vật Việt Nam [3] Sách đỏ Việt Nam [4] Nguyễn Tiến Bân, Cây cỏ Việt Nam [10] Từ điển thực vật thông dụng [8] Võ Văn Chi số nghiên cứu gần đây, chi Balanophora J.R.&G.Forst Việt Nam có lồi, thứ, lồi phụ Các loài thuộc chi Balanophora J.R.&G.Forst Việt Nam từ lâu sử dụng dân gian với nhiều công dụng khác như: trị bệnh đau bụng đau toàn thân, dùng làm thuốc ngâm rượu uống bổ tinh, cường tráng, mạnh gân cốt, làm thuốc bổ máu, kích thích ăn ngon miệng, hồi phục sức khỏe, phụ nữ sau sinh Các tác dụng ghi nhận tài liệu cuốn: Từ điển thuốc Việt Nam Võ Văn Chi [7] Cây thuốc Việt Nam thuốc thường dùng Nguyễn Viết Thân [13] Mặc dù sử dụng dân gian từ lâu khai thác, buôn bán với số lượng lớn, nghiên cứu Việt Nam chi Balanophora J.R.&G.Forst hạn chế, hầu hết tập trung vào lồi Dó đất hoa thưa (B laxiflora Hemsl.) Việc thiếu thông tin tiêu đánh chất lượng dược liệu dẫn đến khó khăn thu hái sử dụng cách hiệu Bên cạnh đó, nghiên cứu giới thành phần hóa học các lồi thuộc chi Balanophora J.R.&G.Forst cho thấy loài chứa hàm lượng đáng kể hợp chất phenolic, kể đến acid gallic acid caffeic Đây hợp chất có nhiều tác dụng sinh học đáng ý Cụ thể, acid gallic có có hoạt tính chống oxy hóa, chống viêm độc tính tế bào có tác dụng trị liệu rối loạn tiêu hóa, thần kinh, chuyển hóa tim mạch [33]; acid caffeic có hoạt tính chống oxy hóa, chống di ứng bảo vệ tế bào thần kinh [38] Chính vậy, nhằm mục tiêu cung cấp thêm thông tin khoa học giúp đánh giá chất lượng dược liệu xác định hàm lượng hai hợp chất: acid gallic acid caffeic loài thuộc chi Balanophora J.R.&G.Forst Việt Nam, tiến hành đề tài: “Khảo sát số tiêu chất lượng bán định lượng đồng thời acid gallic acid caffeic hai loài thuộc chi Balanophora J.R&G.Forst Việt Nam” với nội dung chính: Khảo sát số tiêu chất lượng dược liệu hai loài thuộc chi Balanophora J.R.&G.Forst Việt Nam gồm: đặc điểm hiển vi, định tính thành phần hóa học, xác định tro toàn phần, xác định chất chiết dược liệu định lượng polyphenol toàn phần dược liệu Bán định lượng đông thời acid gallic acid caffeic hai loài thuộc chi Balanophora J.R&G.Forst Việt Nam sắc ký lớp mỏng hiệu cao 23 Haruna Mitsumasa, Koube Tomoko, et al (1982), "Balanophonin, a new neo-lignan from Balanophora japonica Makino", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 30(4), pp 1525-1527 24 Henning Heide-Jørgensen (2008), Parasitic flowering plants, Brill, pp 248 25 Ho Shang-Tse, Tung Yu-Tang, et al (2012), "The hypouricemic effect of Balanophora laxiflora extracts and derived phytochemicals in hyperuricemic mice", Evidence-based complementary alternative medicine, pp 1-7 26 Hosokawa Akihiro, Sumino Megumi, et al (2004), "A new lignan from Balanophora abbreviata and inhibition of lipopolysaccharide (LPS)-induced inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression", Chemical and pharmaceutical bulletin, 52(10), pp 1265-1267 27 Hosoya Takahiro, Nakata Asami, et al (2010), "Papuabalanols A and B, new tannins from Balanophora papuana", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 58(5), pp 738-741 28 Huu Tai Bui, Xuan Nhiem Nguyen, et al (2019), "Three new muurolane-type sesquiterpene glycosides from the whole plants of Balanophora fungosa subsp indica", Natural product research, pp 1-7 29 ICH (2005), Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology, International Conference on Harmonization (ICH), Q2(R1) , Geneva, pp 17 30 Ikeda Hideko, Fukuda Tatsuya, et al (2016), "Endophytic fungi associated with a holoparasitic plant, Balanophora japonica (Balanophoraceae)", American Journal of Plant Sciences, 7(1), pp 152-158 31 Jiang Z H., Wen X Y., et al (2008), "Cytotoxic hydrolyzable tannins from Balanophora japonica", J Nat Prod, 71(4), pp 719-23 32 Jiang Zhi-Hong, Tanaka Takashi, et al (2005), "Ellagitannins and lignan glycosides from Balanophora japonica (Balanophoraceae)", Chemical and pharmaceutical bulletin, 53(3), pp 339-341 33 Kahkeshani Niloofar, Farzaei Fatemeh, et al (2019), "Pharmacological effects of gallic acid in health and diseases: A mechanistic review", Iranian journal of basic medical sciences, 22(3), pp 225 34 Kanchanapoom Tripetch, Picheansoonthon Chayan, et al (2001), Abstract: "New Glucosides from Thai Medicinal Plant Balanophora Iatisepala", Natural medicines, 55(4), pp 213-216 35 Kim Joo Hwan, Won Hyosig (2013), "Identification of host plant species of Balanophora fungosa var indica from Phnom Bokor National Park of Cambodia using DNA barcoding technique", Korean Journal of Plant Taxonomy, 43(4), pp 252-262 36 Konta Fumihiro, Sakio Hitoshi (1982), Abstract: "Notes on the Plant Communities in Shizuoka Prefecture II: A Community of Balanophora nipponica Makino which was found out in the South Japanese Alps", 静岡大学理学部研究報告, 16, pp 109115 37 Luu Hong Truong, Nguyen Hieu Cuong, et al (2020), Balanophora aphylla (Balanophoraceae), a new holoparasitic species from Vietnam, Annales Botanici Fennici, BioOne, pp 67-70 38 Nam Seung-Hee, Kim Young-Min, et al (2017), "Synthesis and functional characterization of caffeic acid glucoside using Leuconostoc mesenteroides dextransucrase", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 65(13), pp 27432750 39 Nguyen Thanh Tung, Nguyen Viet Than, et al (2017), "Balanophora subcupularis PC Tam (Balanophoraceae): New Record Species for Flora of Vietnam", J Pharmacogn Nat Prod, 3(142), pp 2472-0992 40 Nguyen Thanh Tung Nguyen Viet Than, Nguyen Quang Hung (2018), "First record of Balanophora tobiracola Makino (Balanophoraceae) from Viet Nam", Bioscience Discovery, 9(2), pp 297-301 41 Pan Jian-yu, Zhou Yuan, et al (2008), "Chemical constituents of Balanophora involucrata", Chinese Traditional and Herbal Drugs, 39(3), pp 327 42 Panthama Natcha, Kanokmedhakul Somdej, et al (2009), "Galloyl and hexahydroxydiphenoyl esters of phenylpropanoid glucosides, phenylpropanoids and phenylpropanoid glucosides from rhizome of Balanophora fungosa", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 57(12), pp 1352-1355 43 Ruan HL, Li J, et al (2003), "Studise on anti-inflammatory and analgesic effects of Balanophora involucrata", Chin Arch Tradit Chin Med, 21, pp 910-911 44 She Gai‐Mei, Zhang Ying‐Jun, et al (2009), "Phenolic Constituents from Balanophora laxiflora with DPPH Radical‐Scavenging Activity", Chemistry & biodiversity, 6(6), pp 875-880 45 Teng Rongwei, Wang Dezu, et al (2000), "Chemical constituents from Balanophora harlandii", Acta Botanica Yunnanica, 22(2), pp 225-233 46 Tian JY, Ji TF, et al (2007), Abstract: "Studies on hypoglycemic effect of extract of Balaophora polyandra in mice", Zhongguo Zhong yao za zhi= Zhongguo zhongyao zazhi= China journal of Chinese materia medica, 32(12), pp 1194-1198 47 Tim Martin Peter de Lange, Shona Myers, Gerald McCormack, Edwin Apera, Colin Rattle (2012), Survey of endemic flora of Rarotonga and preparation of IUCN threat assessments, Contract Report No 2497, Editor 2012 48 Wang Kai‐Jin, Zhang Ying‐Jun, et al (2006), "New phenolic constituents from Balanophora polyandra with radical‐scavenging activity", Chemistry & biodiversity, 3(12), pp 1317-1324 49 Wang Wei, Zeng Shu‐Fen, et al (2009), "A new hydrolyzable tannin from Balanophora harlandii with radical‐scavenging activity", Helvetica Chimica Acta, 92(9), pp 1817-1822 50 Wang Xiaohong, Liu Zizhen, et al (2012), "Phytochemicals and biological studies of plants from the genus Balanophora", Chemistry Central Journal, 6(1), pp 79 51 Wei Jiangchun, Huo Xiaokui, et al (2017), "Phenolic acids from Balanophora involucrata and their bioactivities", Fitoterapia, 121, pp 129-135 52 Wu ZhengYi Raven PH, et al (1988) Flora of China, Science Press, Vol Ulmaceace through Basellaceae, pp 272-276 53 Zhou Jie, Du Si-Yu, et al (2019), "New butenolides with anti-inflammatory activity from Balanophora fungosa", Natural product research, pp 1-5 54 Zhou Tong, Zhang Xiao-hui, et al (2011), "New phenylpropanoids and in vitro αglucosidase inhibitors from Balanophora japonica", Planta medica, 77(05), pp 477481 55 Dai Z, Wang G, et al (2006), "Chemical constituents of Balanophora simaoensis (III)", Chinese Traditional And Herbal Drugs, 37(11), pp 1608 56 HOU Qin-yun, DAI Zhong, et al (2009), "Comparative study on chemical components of species of Balanophora", Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 29(5), pp 697-701 Trang web 57 http://www.theplantlist.org/1.1/browse/A/Balanophoraceae/Balanophora/, truy cập ngày 11/06/2020 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các phản ứng hóa học dùng để định tính nhóm chất hữu dược liệu Phụ lục 2: Quy trình thẩm định đánh giá phương pháp định lượng polyphenol toàn phần dược liệu Phụ lục 3: Biên giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu PHỤ LỤC 1: Các phản ứng hóa học dùng để định tính nhóm chất hữu dược liệu  Alcaloid Cho khoảng 10 g bột dược liệu vào bình nón, thấm ẩm dung dịch amoniac đặc, đậy kín bình nón 30 phút Cho thêm 15 ml cloroform, lắc đều, ngâm 12 Lọc lấy dịch chiết vào bình gạn, sau lắc kỹ với dung dịch H2SO4 1N lần, lần 10 ml Để phân lớp, gạn lấy dịch chiết acid, cho vào ống nghiệm, ống nghiệm ml dịch chiết acid - Ống 1: ml dịch chiết + giọt TT Mayer - Ống 2: ml dịch chiết + giọt TT Bouchardat - Ống 3: ml dịch chiết + giọt TT Dragendorff Phản ứng dương tính xuất tủa ống nghiệm  Định tính Flavonoid, Coumarin Cân khoảng g bột dược liệu vào bình nón, thêm 50 ml ethanol 70%, bọc kín, đem siêu âm lần, lần 10 phút, sau lọc qua giấy lọc thu dịch chiết dược liệu cồn Dịch chiết sử dụng để định tính nhóm chất: flavonoid, coumarin Định tính Flavonoid Phản ứng Cyanidin: Cho ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm bột magie kim loại, nhỏ từ từ 4-5 giọt acid HCl đậm đặc Phản ứng dương tính dung dịch có màu từ hồng đến đỏ Phản ứng với dung dịch NaOH 10%: cho vào ống nghiệm ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% Phản ứng dương tính dịch chiết chuyển từ vàng sang vàng đậm, thêm 1ml nước cất tủa tan màu vàng dung dịch tăng thêm Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2-3 giọt dung dịch FeCl 5%, lắc nhẹ Phản ứng dương tính dịch chiết chuyển sang màu xanh đen Định tính Coumarin Phản ứng mở, đóng vịng lacton: Cho vào hai ống nghiệm mối ống ml dịch chiết - Ống 1: Thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10% - Ống 2: Để nguyên Đun sôi hai ống nghiệm, để nguội Quan sát có tượng sau dương tính: - Ống 1: Dung dịch có tủa vàng tủa đục có màu vàng - Ống 2: Trong Thêm vào hai ống nghiệm, ống ml nước cất Lắc đều, thấy: - Ống 1: Trong suốt - Ống 2: Có tủa đục Acid hóa ống vài giọt HCl đặc, ống trở lại đục ống Phản ứng chuyển dạng đồng phân cis-trans: Nhỏ vài giọt dịch chiết cồn lên giấy thấm, nhỏ thêm vài giọt NaOH 10% chồng lên, sấy nhẹ Che phần dịch chiết giấy lọc miếng kim loại chiếu tia tử ngoại vài phút Bỏ miếng kim loại ra, quan sát đèn tử ngoại Phản ứng dương tính phần khơng bị che có huỳnh quang sáng phần bị che, tiếp tục chiếu tia tử ngoại, phần bị che sáng dần lên , sau vài phút hai phần phát quang  Định tính tanin, anthranoid, saponin, acid hữu Cân khoảng g dược liệu, thêm 50 ml nước, đun sơi 10 phút, lọc dịch chiết cịn nóng qua giấy lọc, dịch lọc thu đem làm nguội tiến hành phản ứng Dịch chiết nước sử dụng để định tính nhóm chất: tanin, anthranoid, saponin, acid hữu Định tính tanin - Ống 1: ml dịch lọc, thêm giọt FeCl3 5% Phản ứng dương tính xuất tủa xanh đen - Ống 2: ml dịch lọc, thêm giọt chì acetat 10% Phản ứng dương tính xuất tủa - Ống 3: ml dịch lọc, thêm giọt dung dịch gelatin 1% Phản ứng dương tính xuất tủa bơng trắng Định tính saponin Phản ứng tạo bọt: Thêm nước cất, bịt ống nghiệm ngón tay cái, lắc mạnh ống nghiệm theo chiều dọc phút, để yên quan sát Phản ứng dương tính cột bọt tạo cịn bền vững sau 15 phút Định tính acid hữu Phản ứng acid-base: Cho ml dịch chiết dược liệu nước vào ống nghiệm thêm tinh thể Na2CO3 Phản ứng dương tính có bọt khí lên Định tính anthranoid Định tính dạng tự do: Lấy khoảng g bột dược liệu cho vào ống nghiệm lớn (10 ml) Thêm ml nước cất, đun trực tiếp với nguồn nhiệt sơi Lọc dịch chiết cịn nóng qua lớp bơng mỏng vào bình gạn dung tích 50 ml Làm nguội dịch lọc Thêm ml cloroform, lắc nhẹ Gạn bỏ lớp nước, giữ lớp cloroform để làm phản ứng - Lấy ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ Thêm ml dung dịch amoniac 10%, lắc nhẹ Phản ứng dương tính lớp nước có màu đỏ sim Nếu lớp cloroform có màu vàng chứng tỏ dược liệu có chứa acid chrysophanic Thêm tiếp tục giọt dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ Lớp dung môi hữu màu vàng, cịn lớp nước có màu đỏ thẫm lúc ban đầu - Lấy ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ, thêm ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ Phản ứng dương tính lớp nước có màu đỏ sim Định tính anthranoid tồn phần (dạng glycosid dạng tự do): Lấy g bột dược liệu cho vào ống nghiệm lớn, thêm ml dung dịch H2SO4 1N Đun trực tiếp nguồn nhiệt đến sôi Tiếp tục lọc chiết - Lấy ml dịch chiết cloroform, thêm ml dung dịch amoniac Lắc nhẹ Phản ứng dương tính lớp nước có màu đỏ sim Nếu lớp nước có màu vàng tiếp tục nhỏ giợt dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ Lớp cloroform màu lớp nước có màu đỏ đậm - Lấy ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ Thêm ml dung dịch NaOH 10% Lắc nhẹ Phản ứng dương tính lớp nước có màu đỏ sim  Định tính triterpen/sterol Phản ứng Lieberman-Burchard: Lấy ml dịch chiết ether dầu hỏa, cô lấy cắn, thêm ml anhydrid aceric, lắc kỹ Đặt nghiêng ống nghiệm 45 o, thêm từ từ 0,5 ml H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm Phản ứng dương tính xuất vòng tròn màu nâu đỏ hai lớp chất lỏng PHỤ LỤC 2: Quy trình thẩm định đánh giá phương pháp định lượng polyphenol toàn phần dược liệu Độ phù hợp hệ thống Độ phù hợp hệ thống đánh giá khả hoạt động quy trình phân tích bao gồm thiết bị, dụng cụ, mẫu thử phương pháp thử Cách tiến hành: Chuẩn bị dung dịch đo quang từ dung dịch thử, xác định độ hấp thụ máy đo quang phổ bước sóng cực đại hấp thụ Mẫu trắng làm song song với mẫu thử Tiến hành độ hấp thụ dung dịch thử lần Xác định khoảng nồng độ tuyến tính Độ tuyến tính phương pháp phân tích phụ thuộc tuyến tính đại lượng đo (y) nồng độ chất cần phân tích (x) khoảng xác định, biểu thị phương trình y = ax + b hệ số tương quan r2 (r2 ≥ 0,99) - Cách xác định: + Chuẩn bị dung dịch đo quang từ dãy dung dịch chuẩn có nồng độ 20 μg/ml, 40 μg/ml, 60 μg/ml, 80 μg/ml, 100 μg/ml + Xác định độ hấp thụ máy đo quang phổ bước sóng cực đại hấp thụ Mỗi mẫu lặp lại lần, lấy giá trị trung bình + Mẫu trắng chuẩn bị song song, không chứa chất nghiên cứu Độ lặp lại phương pháp Độ lặp lại phương pháp khả cho kết tương đồng thực phép thử đối tượng điều kiện phân tích Độ lặp lại đánh giá phân bố giá trị đo phép thử quanh giá trị trung bình, biểu thị giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD Tiến hành định lượng lặp lại lần mẫu thử theo quy trình: - Chuẩn bị dung dịch đo quang từ dung dịch thử, xác định độ hấp thụ máy đo quang phổ bước sóng cực đại hấp thụ - Mẫu trắng chuẩn bị song song, không chứa dung dịch thử - Xác định độ lệch chuẩn giá trị Độ (độ thu hồi) Độ phương pháp thể mức độ phù hợp kết trung bình phép phân tích với giá trị thực mẫu phân tích Độ đánh giá dựa tỷ lệ thu hồi R% lượng chất chuẩn biết thêm vào mẫu phân tích Giá trị R% tính theo cơng thức: R% = Mm+c − Mm x 100 Mc Trong đó: Mm+c: lượng acid gallic dung dịch thử thêm chuẩn (µg); Mm: lượng acid gallic dung dịch thử (µg); Mc: lượng acid gallic dung dịch chuẩn thêm vào (lý thuyết) (µg) Tiến hành đánh giá độ phương pháp thêm chuẩn Tạo mẫu thử thêm chuẩn với nồng độ tương ứng 80%, 100% 120% lượng acid gallic có mẫu thử, kí hiệu mẫu thử A, B, C Với nồng độ thêm chuẩn, tiến hành tạo mẫu thử thêm chuẩn Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) Để xác định LOD LOQ, tiến hành chuẩn bị dung dịch mẫu trắng cách lấy 10 bình định mức cỡ 10 ml, cho vào bình chứa sẵn ml methanol Sau thêm 2,5 mL thuốc thử Folin-Ciocalteu 10% để phản ứng phút Thêm ml dung dịch Na2CO3 2%, định mức nước cất hai lần Sau 60 phút phản ứng nhiệt độ phòng, xác định độ hấp thụ máy đo quang phổ bước sóng 754,5 nm LOD = 3,3 x LOQ = 10 x SD a SD a Trong đó: SD: độ lệch chuẩn phép phân tích mẫu trắng; a : độ dốc đường tuyến tính Độ vững Độ vững phương pháp mức độ lặp lại kết phân tích có thay đổi nhỏ số thông số phương pháp Cách tiến hành: Đo mẫu thử ba bước sóng 752,5nm, 754,5nm, 756,5nm PHỤ LỤC 3: Biên giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu ... Mã sinh viên: 1501458 KHẢO SÁT MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG VÀ BÁN ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ACID GALLIC VÀ ACID CAFFEIC TRONG HAI LOÀI THUỘC CHI Balanophora J.R&G.Forst Ở VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP... giá chất lượng dược liệu xác định hàm lượng hai hợp chất: acid gallic acid caffeic loài thuộc chi Balanophora J.R.&G.Forst Việt Nam, tiến hành đề tài: ? ?Khảo sát số tiêu chất lượng bán định lượng. .. đồng thời acid gallic acid caffeic hai loài thuộc chi Balanophora J.R&G.Forst Việt Nam? ?? với nội dung chính: Khảo sát số tiêu chất lượng dược liệu hai loài thuộc chi Balanophora J.R.&G.Forst Việt