Phân lập và nghiên cứu gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn của thực vật

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN _ Nguyễn Duy Phương PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN _ Nguyễn Duy Phương PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62420116 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Phạm Xuân Hội GS.TS Phan Tuấn Nghĩa Hà Nội – 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án cơng trình nghiên cứu thực cá nhân, thực hướng dẫn khoa học PGS.TS Phạm Xuân Hội GS.TS Phan Tuấn Nghĩa Các số liệu, kết luận án trung thực chưa tác giả công bố cơng trình khác Tơi xin chịu trách nhiệm nghiên cứu Hà Nội, ngày 20 tháng 02 năm 2016 Nghiên cứu sinh Nguyễn Duy Phương LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Phạm Xuân Hội (Viện Di truyền Nông nghiệp), GS.TS Phan Tuấn Nghĩa (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên) TS Narendra Tuteja (Trung tâm Kỹ thuật Di truyền Công nghệ sinh học Quốc tế, New Delhi, Ấn Độ) người thầy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập, thực hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Phòng Sau Đại học (Trường ĐH KHTN) Ban lãnh đạo Viện Di truyền Nông nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tất thủ tục cần thiết q trình học tập thực luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn thầy, cô giáo Bộ mơn Sinh lý thực vật - Hóa sinh (Khoa Sinh học, Trường ĐH KHTN) giảng dạy suốt khóa học tập thể cán nghiên cứu Bộ mơn Bệnh học Phân tử (Viện DTNN), nhóm nghiên cứu TS Narendra Tuteja bạn bè, đồng nghiệp giúp đỡ, đóng góp ý kiến cho tơi để hồn thành luận án tốt nghiệp Tơi xin cảm ơn gia đình người thân ln bên cạnh tôi, quan tâm, cảm thông giúp đỡ suốt thời gian học tập thực luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới Quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) cấp kinh phí nghiên cứu thông qua Đề tài mã số 106.06-2011.69 Trung tâm Kỹ thuật Di truyền Công nghệ Sinh học Quốc tế (Italy) hỗ trợ mặt tài khoa học thơng qua Chương trình học bổng “Sandwich PhD Fellowship” Hà Nội ngày 20 tháng 02 năm 2016 Nguyễn Duy Phương MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 HẠN HÁN VÀ ĐẶC TÍNH CHỐNG CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT 1.1.1 Giới thiệu chung hạn hán 1.1.2 Ảnh hƣởng hạn hán đến sản xuất nông nghiệp 1.1.3 Ảnh hƣởng hạn hán thực vật 1.1.4 Đáp ứng thực vật với điều kiện hạn 1.1.5 Cơ sở phân tử đáp ứng chống chịu hạn thực vật 1.2 ĐIỀU HÒA HOẠT ĐỘNG GEN TRONG ĐIỀU KIỆN HẠN 1.2.1 Promoter cảm ứng với điều kiện hạn 1.2.2 Điều hòa hoạt động gen sau phiên mã 1.2.3 Điều hòa dịch mã 1.2.4 Phân vùng mRNA tế bào chất 1.2.5 Điều hòa sau dịch mã 1.2.6 Vai trò điều hòa hoạt động gen RNA khơng mã hóa 1.3 VAI TRÒ CỦA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ TRONG ĐÁP ỨNG HẠN 1.3.1 Nhân tố phiên mã AP2/ERF 1.3.2 Nhân tố phiên mã NAC 1.3.3 Nhân tố phiên mã WRKY 1.3.4 Một số nhân tố phiên mã khác 1.4 NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA LÚA BẰNG CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN THỰC VẬT 1.4.1 Nghiên cứu chuyển gen vào lúa 1.4.2 Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen chịu hạn Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.2 Chủng vi sinh vật 2.1.3 Vector oligonucleotide 2.1.4 Hóa chất 2.1.5 Thiết bị 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Xử lý mẫu thực vật 2.2.2 Tách chiết, định lƣợng DNA/RNA 2.2.3 Nhân dòng gen OsNLI-IF vào vector pGEM-T 2.2.4 Thiết kế vector biểu gen OsNLI-IF 2.2.5 Sàng lọc gen từ thƣ viện cDNA 2.2.6 Tạo kháng thể đa dòng kháng protein OsNLI-IF tái tổ hợp 2.2.7 Tạo chuyển gen biểu OsNLI-IF Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN C U & THẢO LUẬN 3.1 PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ Ở LÚA 3.1.1 Tổng hợp thƣ viện cDNA thứ cấp 3.1.2 Phân lập gen mã hoá nhân tố phiên mã kỹ thuật Y1H 3.1.3 Nhân dòng gen mã hóa protein OsNLI-IF 3.2 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CHỨC NĂNG CỦA PROTEIN OsNLI-IF .80 3.2.1 Biểu gen OsNLI-IF điều kiện stress phi sinh học 80 3.2.2 Hoạt tính liên kết đặc hiệu với đoạn DNA đích OsNLI-IF .84 3.2.3 Hoạt tính hoạt hóa q trình phiên mã OsNLI-IF 88 3.2.4 Nghiên cứu protein tƣơng tác với OsNLI-IF 93 3.3 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN OsNLI-IF 98 3.3.1 Thiết kế hệ vector biểu pCAMBIA1301 98 3.3.2 Thiết kế hệ vector biểu pBI101 103 3.4 NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN OsNLI-IF TRONG CÂY CHUYỂN GEN 107 3.4.1 Biến nạp vector biểu vào A tumefaciens LBA4404 107 3.4.2 Nghiên cứu biểu OsNLI-IF thuốc .108 3.4.3 Nghiên cứu biểu OsNLI-IF lúa chuyển gen 121 KẾT LUẬN 132 KIẾN NGHỊ 133 DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .134 TÀI LIỆU THAM KHẢO 135 PHỤ LỤC 147 2,4-D 3-AT A thaliana A tumefaciens ABA ABRE AD AMP ADP ATP BAP BD BĐKH bp BSA CBB cDNA Ct dCTP DEPC DMSO dNTP DRE DREB E coli EDTA EtBr HSP IPTG kb LB LEA (dehydration responsive element-binding protein) Escherichia coli Ethylenediaminetetraacetic acid Ethidium bromide Protein sốc nhiệt (Heat shock protein) Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Kilobase Môi trƣờng ni cấy vi khuẩn Luria-Bertani LiAc Protein hình thành giai đoạn phát triển muộn phôi (late embryogenesis abundant) Lithium acetate MCS đa điểm cắt (multiple cloning site) MOPS Acid 3-(N-morpholino) propansulfonic mRNA Messenger ribonucleic acid MS Môi trƣờng nuôi cấy thực vật Murashige & Skoog MS-R Môi trƣờng MS nuôi cấy lúa MS-T Môi trƣờng MS nuôi cấy thuốc NAA 1-naphthaleneacetic acid NAC NAM/ATAF1/2/CUC2 NACRS Trình tự nhận biết protein NAC (NAC recognition sequence) NLI-IF Nhân tố tƣơng tác với yếu tố tƣơng tác LIM nhân (nuclear LIM interactor-interacting factor) NST Nhiễm sắc thể OD Mật độ quang học (optical density) ORF Khung đọc mở (open reading frame) PCR Phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction) PEG ROS RT-PCR S cerevisiae SDM SDS SDS-PAGE TAE TBE TE TF Ti-plasmid -Trp/-Ura/Leu/-His/-Ade X-Gal Y1H Y2H YEM YPD 143 104 Shen Y.G., Zhang W K., Yan D.Q., Du B.X., Zhang J.S., Liu Q., Chen S.Y (2003), Characterization of a DRE-binding transcription factor from a halophyte Atriplex hortensis”, Theor Appl Genet., 107(1), pp 155-161 105 Shinha K., Khanna-Chopra R., Aggarwal K., Chanturvedi G.S., Koundal K.R (1982), “Effects of drought on shoot growth Significance of metabolism to growth and yeild”, Drought Resistance in Crops, IRRI, Los Banos, Laguna, Philippines 106 Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (1996), “Molecular responses to drought and cold stress”, Curr Opin Biotechnol., 7(2), pp 161-167 107 Smith L.M., Sanders J.Z., Kaiser R.J., Hughes P., Dodd C., Connell C.R., Heiner C., Kent S.B., Hood L.E (1986) "Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis", Nature, 321(6071), pp 674-679 108 (2012), Sreenivasulu N., Harshavardhan V.T., Govind G., Seiler C., Kohli A “Contrapuntal role of ABA: does it mediate stress tolerance or plant growth retardation under long-term drought stress?”, Gene, 506(2), pp 265-273 109 Takasaki H., Maruyama K., Kidokoro S., Ito Y., Fujita Y., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K., Nakashima K (2010), “The abiotic stress-responsive NAC-type transcription factor OsNAC5 regulates stress-inducible genes and stress tolerance in rice”, Mol Genet Genomics, 284(3), pp 173-183 110 Tie W., Zhou F., Wang L., Xie W., Chen H., Li X., Lin Y (2012), “Reasons for lower transformation efficiency in indica rice using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation: lessons from transformation assays and genome-wide expression profiling”, Plant Mol Biol., 78(1-2), pp 1-18 111 Topfer R., Matzeit V., Gronenborn B., Schell J., Steinbiss H.H (1987), “A set of plant expression vectors for transcriptional and translational fusions”, Nucleic Acids Res., 15(14), pp 5890 112 Tran L.S., Nakashima K., Sakuma Y., Osakabe Y., Qin F., Simpson S.D., Maruyama K., Fujita Y., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2006), “Coexpression of the stress-inducible zinc finger homeodomain ZFHD1 and NAC transcription factors enhances expression of the ERD1 gene in Arabidopsis”, Plant J., 49(1), pp 46-63 113 Tran L.S., Nakashima K., Sakuma Y., Simpson S.D., Fujita Y., Maruyama K., Fujita M., Seki M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2004), “Isolation and functional analysis of Arabidopsis stress-inducible NAC transcription factors that bind to a drought-responsive cis-element in the early responsive to dehydration stress promoter”, Plant Cell, 16(9), pp 2481-2498 144 114 Vanjildorj E., Song H.J., Kim J.H., Lim Y.P (2010), “An establishment of Agrobacterium-mediated transformation to rapeseed (Brassica napus L cvs WH3 and WH10) and functional analysis of Arabidopsis transcription factor AtGRFs in growth and developmental alternations of transgenic rapeseed”, Plant & Animal Genome (PAG) XVIII Conference, January 9-13, 2010, Town & Country Convention Center in San Diego, California, USA 115 Verweire D., Verleyen K., De Buck S., Claeys M., Angenon G (2007), “Marker-free transgenic plants through genetically programmed auto-excision”, Plant Physiol., 145(4), pp.1220-1231 116 Vierstra R.D (1996), “Proteolysis in plant: mechanisms and functions”, Plant Mol Biol., 32(1-2), pp 275-302 117 Walley J.W., Kelley D.R., Nestorova G., Hirschberg D.L., Dehesh K (2010), “Arabidopsis deadenylases AtCAF1a and AtCAF1b play overlapping and distinct roles in mediating environmental stress responses”, Plant Physiol., 152(2), pp 866-875 118 Wang C., Deng P., Chen L., Wang X., Ma H., Hu W., Yao N., Feng Y., Chai R., Yang G., He G (2013), “A wheat WRKY transcription factor TaWRKY10 confers tolerance to multiple abiotic stresses in transgenic Tobacco”, PLoS ONE, 8(6), pp e65120, DOI: 10.1371/journal.pone.0065120 119 Wang K (2006), Agrobacterium Protocols, 2nd ed., in Methods Mol Biol 343, Humana Press, Totowa, New Jersey, pp 409 120 Xiao B., Huang Y., Tang N., Xiong L (2007), “Over-expression of a LEA gene in rice improves drought resistance under the field conditions”, Theor Appl Genet., 115(1), pp 35-46 121 Xie Z., Zhang Z.L., Zou X., Huang J., Ruas P., Thompson D., Shen Q.J (2005), “Annotations and functional analyses of the rice WRKY gene superfamily reveal positive and negative regulators of abscisic acid signaling in aleurone cells”, Plant Physiol., 137(1), pp 176-189 122 Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K (1994), “A novel cis-acting element in an Arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought, lowtemperature, or high-salt stress”, Plant Cell, 6(2), pp 251-264 123 Yao Y., Ni Z., Peng H., Sun F., Xin M., Sunkar R., Zhu J.K., Sun Q (2010), “Non-coding small RNAs responsive to abiotic stress in wheat (Triticum aestivum L.)”, Funct Integr Genomics, 10(2), pp 187-190 124 Ye R., Huang H., Yang Z., Chen T., Liu L., Li X., Chen H., Lin Y (2009), “Development of insect-resistant transgenic rice with Cry1C*-free endosperm”, Pest Manag Sci., 65(9), pp 1015-1020 145 125 Ye X., Al-Babili S., Klöti A., Zhang J., Lucca P., Beyer P., Potrykus I (2000), “Engineering the pro-Vitamin A (beta-carotene) biosynthetic pathway into (carotenoid-free) rice endosperm”, Science, 287(5451), pp 303-305 126 Yi N., Kim Y.S., Jeong M.H., Oh S.J., Jeong J.S., Park S.H., Jung H., Choi Y.D., Kim J.K (2010), “Functional analysis of six drought-inducible promoters in transgenic rice plants throughout all stages of plant growth”, Planta, 232(3), pp 743-754 127 Yin H., Chen C.J., Yang J., Weston D.J., Chen J.G., Muchero W., Ye N., Tschaplinski T.J., Wullschleger S.D., Cheng M., Tuskan G.A., Yang X (2014), “Functional genomics of drought tolerance in bioenergy crops”, Crit Rev Plant Sci., 33(2-3), pp 205-224 128 Oda K Yokotani N., Ichikawa T., Kondou Y., Matsui M., Hirochika H., Iwabuchi M., (2009), “Tolerance to various environmental stresses conferred by the salt-responsive rice gene ONAC063 in transgenic Arabidopsis”, Planta, 229(5), pp 1065-1075 129 Zhang J., Addepalli B., Yun K.Y., Hunt A.G., Xu R., Rao S., Li Q.Q., Falcone D.L (2008), “A polyadenylation factor subunit implicated in regulating oxidative signaling in Arabidopsis thaliana”, PLoS ONE, 3(6), pp e2410, DOI: 10.1371/ journal pone.0002410 130 Zheng X., Chen B., Lu G., Han B (2009), “Overexpression of a NAC transcription factor enhances rice drought and salt tolerance”, Biochem Biophys Res Commun., 379(4), pp 985-989 131 Zhou L., Liu Y., Liu Z., Kong D., Duan M., Luo L (2010), “Genome-wide identification and analysis of drought-responsive microRNAs in Oryza sativa”, J Exp Bot., 61(15), pp 4157-4168 132 Wang Zhou Q.Y., Tian A.G., Zou H.F., Xie Z.M., Lei G., Huang, J., Wang C.M., H.W., Zhang J.S., Chen S.Y (2008), “Soybean WRKY-type transcription factor genes, GmWRKY13, GmWRKY21, and GmWRKY54, confer differential tolerance to abiotic stresses in transgenic Arabidopsis plants”, Plant Biotechnol J., 6(5), pp 486-503 133 Zhu J., Shi H., Lee B.H., Damsz B., Cheng S., Stirm V., Zhu J.K., Hasegawa P.M., Bressan R.A (2004), “An Arabidopsis homeodomain transcription factor gene, HOS9, mediates cold tolerance through a CBF-independent pathway”, Proc Natl Acad Sci USA, 101(26), pp 9873-9878 134 http://www.ers.usda.gov 135 http://www.fao.org 146 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Sơ đồ vector sử dụng nghiên cứu 147 (A) (B) Phụ lục 2: Trình tự promoter JRC0332 JRC0528 Ghi chú: (A) Trình tự promoter JRC0332 (mã số AC090713.6) (B) Trình tự promoter JRC0528 (mã số AF254558.1) 148 Phụ lục 3: Kiểm tra vector pLacZi pHISi mang đoạn DNA đích PCR Ghi chú: Sản phẩm PCR kiểm tra vector pLacZi pHISi mang đoạn DNA đích JRC0332 JRC0528 điện di gel agarose 1% Giếng M: thang chuẩn DNA kb; giếng 2: PCR với cặp mồi LAC-Fw/LAC-Rv; giếng 4: PCR với cặp mồi HIS-Fw/HIS-Rv; giếng 1: khuôn pLacZi/JRC0332; giếng 2: khuôn pLacZi/JRC0528; giếng 3: khuôn pHISi/JRC0528; giếng 4: khuôn pHISi/JRC0332 Phụ lục 4: Khảo sát mức độ biểu gen thị lacZ Ghi chú: (A) Tế bào nấm men cấy ria môi trường YPD (B) Đánh giá hoạt tính phân giải chất X-Gal β-galactosidase 60 phút Phụ lục 5: Khảo sát mức độ biểu gen thị HIS3 Ghi chú: (A) Môi trường YPD (B) Môi trường chọn lọc SD/-His có bổ sung 3-AT nồng độ 10 mM (C) Mơi trường chọn lọc SD/-His có bổ sung 3-AT nồng độ 20 mM 149 Phụ lục 6: Sàng lọc khuẩn lạc dựa biểu gen HIS3 lacZ Ghi chú: (A) Mơi trường SD/-Leu/-Ura/-His khơng có 3-AT; (B) mơi trường SD/-Leu/Ura/-His có 3-AT 10 mM; (C) mơi trường SD/-Leu/-Ura/-His có 3-AT 30 mM; (D) βgalactosidase phân giải chất X-Gal tạo màu xanh Phụ lục 7: Sàng lọc kích thƣớc dịng cDNA PCR Ghi chú: Sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc điện di gel agarose 1% Giếng M: thang chuẩn DNA kb; giếng – 14 16 – 28: khn khuẩn lạc mang dịng cDNA; giếng 15: đối chứng âm (khuẩn lạc nấm men S cerevisiae nguyên bản) Phụ lục 8: Trình tự nucleotide gen OsNLI-IF (mã số NM_001050330.1) 150 Phụ lục 9: Trình tự acid amin protein OsNLI-IF (mã số NP_001043795.2) Phụ lục 10: Sàng lọc thƣ viện cDNA kỹ thuật Y2H Ghi chú: Thể biến nạp chọn lọc môi trường ni cấy khuyết dưỡng hoạt tính β-galactosidase (A) Môi trường SD/-Trp/-Ura/-His; (B) môi trường SD/-Trp/-Ura/-His/Ade; (C) β-galactosidase phân giải chất X-Gal tạo màu xanh Phụ lục 11: Sàng lọc thƣ viện cDNA PCR Ghi chú: Sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc nấm men cặp mồi BD-Fw/BD-Rv điện di gel agarose 1% Giếng M: Thang chuẩn DNA kb; giếng – 19: khuôn khuẩn lạc nấm men S cerevisiae AH109 tái tổ hợp mang dòng cDNA 151 Phụ lục 12: PCR trực tiếp khuẩn lạc mang pBI-Lip9, pBI-Ubi pCAMBIA1301 Ghi chú: Sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc A tumefaciens điện di gel agarose 1% Giếng – 6: PCR với cặp mồi Lip9-Fw/Nos-Rv; giếng 1: đối chứng dương (khuôn pBI-Lip9); giếng – 5: khuôn khuẩn lạc số – biến nạp pBI-Lip9; giếng 6: đối chứng âm (khơng có DNA khuôn) Giếng – 12: PCR với cặp mồi Ubi-Fw/Nos-Rv; giếng 7: đối chứng dương (khuôn pBI-Ubi); giếng – 11: khuôn khuẩn lạc số – biến nạp pBI-Ubi; giếng 12: đối chứng âm (khơng có DNA khn) Giếng 13 – 17: PCR với cặp mồi 35S-Fw/Nos-Rv; giếng 13: đối chứng dương (khuôn pCAMBIA1301); giếng 14 – 16: khuôn khuẩn lạc số – biến nạp pCAMBIA1301; giếng 17: đối chứng âm (khơng có DNA khn) Giếng M: thang chuẩn DNA kb Phụ lục 13: Cây thuốc chuyển gen nảy mầm mơi trƣờng có Hygromycin Ghi chú: Hạt T1 dòng thuốc chuyển cấu trúc 35S:OsNLI-IF:Nos (TL9) nảy mầm môi trường MS (A) MS có bổ sung Hygromycin 50 mg/l (B) Phụ lục 14: Kết sàng lọc dòng thuốc T1 PCR Ghi chú: Sản phẩm PCR thuốc chuyển gen T1 với cặp mồi NLI-t-Fw/Nos-Rv điện di gel agarose 1%; giếng - 20: khuôn mẫu DNA tách chiết từ 20 thuốc T1 chuyển cấu trúc 35S:OsNLI-IF:Nos, giếng 21: khuôn mẫu DNA tách chiết từ dòng thuốc T1 chuyển cấu trúc pCAMBIA1301; giếng 22: khuôn mẫu DNA tách chiết từ thuốc không chuyển gen; giếng M: thang chuẩn DNA kb 152 Phụ lục 15: Biểu protein tái tổ hợp OsNLI-IF tế bào E coli Rosetta Ghi chú: (A) Kết điện di dịch chiết tế bào gel SDS-PAGE 12% (B) Kết lai thẩm tách miễn dịch sử dụng kháng thể anti – His-tag pha loãng 1:50.000 Giếng M: thang chuẩn protein; giếng – 3: pha lỏng dịch chiết tế bào; giếng – 6: pha cặn dịch chiết tế bào; giếng 4: đối chứng âm (không cảm ứng IPTG); giếng 5: cảm ứng IPTG 0,1 mM giờ; giếng 6: cảm ứng IPTG 0,1 mM Phụ lục 16: Kiểm tra protein tái tổ hợp OsNLI-IF qua xử lý Thrombin Ghi chú: (A) Kết điện di protein tinh gel SDS-PAGE 12% (B) Kết lai thẩm tách miễn dịch sử dụng kháng thể anti – His-tag pha loãng 1:50.000 Giếng M: thang chuẩn protein; giếng 1: OsNLI-IF dung hợp tinh sạch; giếng 2: OsNLI-IF tinh xử lý Thrombin tinh lại hệ thống cột Ni-NTA mắc nối tiếp Heparin-Sepharose Phụ lục 17: Kiểm tra đáp ứng miễn dịch kháng huyết kỹ thuật lai thẩm tách miễn dịch Ghi chú: (A) Kháng huyết trước gây miễn dịch (pha loãng 1:10000) (B) Kháng huyết sau gây miễn dịch (pha loãng 1:10.000) Giếng M: thang chuẩn protein; giếng 1: dịch chiết tế bào E coli; giếng 2: OsNLI-IF tái tổ hợp tinh 153 Phụ lục 18: PCR kiểm tra số dòng lúa tái sinh T0 Ghi chú: Sản phẩm PCR chuyển gen với cặp mồi NLI-t-Fw/Nos-Rv điện di gel agarose 1% (A) Giếng 1: đối chứng âm (khuôn DNA tách chiết từ lúa dại); giếng – 10: khuôn mẫu DNA tách chiết từ dòng lúa chuyển cấu trúc Lip9:OsNLIIF:Nos; giếng 11: đối chứng dương (khuôn pBI-Lip9/OsNLI-IF) (B) Giếng 1: đối chứng dương (khuôn pBI-Ubi/OsNLI-IF); giếng – 10: khuôn DNA dòng lúa chuyển cấu trúc Ubi:OsNLI-IF:Nos; giếng 11: đối chứng âm (khuôn DNA tách chiết từ lúa dại) Giếng M: thang chuẩn DNA kb Phụ lục 19: PCR kiểm tra số dòng lúa tái sinh T1 Ghi chú: Sản phẩm PCR chuyển gen T1 điện di gel agarose 1% (A) PCR với cặp mồi Actin-Fw/Actin-Rv; giếng 1: đối chứng âm (khuôn H2O); giếng 2: khuôn DNA tách chiết từ lúa dại; giếng – 14: khuôn mẫu DNA tách chiết từ lúa T1 chuyển cấu trúc Ubi:OsNLI-IF:Nos (B) PCR với cặp mồi NLI-t-Fw/Nos-Rv; giếng 1: đối chứng âm (khuôn DNA tách chiết từ lúa dại); giếng – 15: khuôn mẫu DNA tách chiết từ lúa chuyển cấu trúc Ubi:OsNLI-IF:Nos; giếng 16: đối chứng dương (khuôn pBI-Ubi/OsNLI 154 ... chống chịu hạn thực vật, đặc biệt nhóm gen mã hóa nhân tố phiên mã , chúng tơi tiến hành đề tài luận án tiến sĩ ? ?Phân lập nghiên cứu gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn thực vật? ??... chịu hạn thực vật Do đó, việc nghiên cứu phân lập đặc tính gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến chịu hạn trở thành xu hƣớng triển vọng nhận đƣợc quan tâm đặc biệt Hàng loạt gen mã hóa nhân tố. .. Mục tiêu nghiên cứu - Phân lập xác định trình tự gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNLI-IF điều khiển tính chịu hạn từ lúa - Nghiên cứu số đặc tính gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNLI-IF phân lập đƣợc