Nghiên cứu phân lập và chuyển gen liên quan đến tính chịu hạn vào giống lúa ở việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN _ Cao Lệ Quyên NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ CHUYỂN GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN VÀO GIỐNG LÚA Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN _ Cao Lệ Quyên NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ CHUYỂN GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN VÀO GIỐNG LÚA Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Phạm Xuân Hội PGS.TS Đinh Đoàn Long Hà Nội – 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án cơng trình nghiên cứu thực cá nhân, đƣợc thực dƣới hƣớng dẫn khoa học PGS.TS Phạm Xuân Hội PGS.TS Đinh Đoàn Long Các số liệu, kết luận án trung thực chƣa đƣợc tác giả công bố cơng trình khác Tơi xin chịu trách nhiệm nghiên cứu Hà Nội, ngày 20 tháng 09 năm 2017 Nghiên cứu sinh Cao Lệ Quyên LỜI CẢM ƠN NCS xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Phạm Xuân Hội (Viện Di truyền Nông nghiệp), PGS TS Đinh Đoàn Long (Khoa Y Dược, Trường Đại học Quốc Gia Hà Nội) TS Michel Nicole (Trung tâm Nghiên cứu Vì Sự Phát triển, Montpellier, Pháp) người thầy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho NCS suốt thời gian học tập, thực hoàn thành luận án NCS xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên , Phòng Sau Đại học , Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh học (Trường ĐH KHTN) Ban lãnh đạo Viện Di truyền Nông nghiệp tạo điều kiện thuận lợi q trình học tập, nghiên cứu hồn luận án NCS xin chân thành cảm ơn thầy,các cô Bộ môn Di truyền (Khoa Sinh học, Trường ĐH KHTN) giảng dạy NCS trình học tập tập thể cán nghiên cứu Bộ môn Bệnh học Phân tử (Viện DTNN) bạn bè, đồng nghiệp giúp đỡ, đóng góp ý kiến để NCS hồn thiện luận án Tơi xin cảm ơn gia đình người thân ln bên cạnh tôi, quan tâm, cảm thông giúp đỡ suốt thời gian học tập thực luận án Hà Nội ngày 20 tháng 09 năm 2017 NCS Cao Lệ Quyên MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .5 DANH MỤC HÌNH .9 DANH MỤC BẢNG 12 MỞ ĐẦU 14 Chƣơng TỔNG QUAN 20 1.1 HÁN HẠN-YẾU TỐ KÌM HÃM TRONG SẢN XUẤT NÔNG NGHIỆP .20 1.1.1 Khái niện hạn hán 20 1.1.2 Tác động tiêu cực hạn hán đến sản xuất nông nghiệp 21 1.2 PHẢN ỨNG CỦA THỰC VẬT TRONG ĐIỀU KIỆN HẠN 24 1.2.1 Ảnh hƣởng hạn hán thực vật 24 1.2.2 Đáp ứng chống, chịu hạn thực vật 26 1.2.3 Cơ sở phân tử đáp ứng chống chịu hạn thực vật 29 1.3 CÁC NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Ở THỰC VẬT .34 1.3.1 Nhóm nhân tố phiên mã NAC .36 1.3.2 Nhóm nhân tố phiên mã MYB/MYC 37 1.3.3 Nhóm nhân tố phiên mã bZIP 38 1.3.4 Nhóm nhân tố phiên mã AP2/ERF 40 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG LÚA CHUYỂN GEN CHỊU HẠN TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 41 1.4.1 Nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen chịu hạn giới 44 1.4.2 Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen Việt Nam 50 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .53 2.1 VẬT LIỆU VÀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 53 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 53 2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 54 2.1.3 Thiết bị 57 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 57 2.2.1 Xƣƣ̉ lý lúa điều kiện hạn .57 2.2.2 Tách chiết, định lƣợng DNA/RNA .58 2.2.3 Sinh tởng hợp DNA bở sung hồn chỉnh (full-length cDNA) .60 2.2.4 Nhân đoạn DNA đặc hiệu kĩ thuật PCR .62 2.2.5 Thiết kế vector chuyển gen 65 2.2.6 Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn A tumefaciens 67 2.2.7 Đánh giá khả hình thành callus tái sinh lúa 68 2.2.8 Chuyển gen vào lúa thông qua vi khuẩn Agrobacterium .69 2.2.9 Đánh giá số lƣợng gen chuyển 71 2.2.10 Đánh giá sinh trƣởng, phát triển, khả chịu hạn lúa chuyển gen .74 2.2.11 Đánh giá biểu gen OsDREB1A phƣơng pháp PCR định lƣợng 2.2.12 Đánh giá biểu gen phƣơng pháp PCR bán định lƣợng76 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN OsDREB1A/OsDREB2A 3.1.1 Phân lập trình tự mã hóa OsDREB1A/OsDREB2A 3.1.2 Thiết kế vector chuyển gen OsDREB1A/OsDREB2A 3.1.3 Biến nạp vector biểu vào A tumefaciens chủng LBA4404 3.2 NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH CHUYỂN GEN VÀO GIỐNG LÚA Ở VIỆT NAM 3.2.1 Khả hình thành callus tập đoàn giống lúa Việt Nam 3.2.2 Khả tái sinh tập đoàn giống lúa Việt Nam 3.2.3 Khảo sát khả tiếp nhận gen giống lúa Việt Nam 3.3 TẠO GIỐNG LÚA CHÀNH TRỤI CHUYỂN GEN 3.3.1 Biến nạp trình tự mã hóa OsDREB1A/OsDREB2A vào lúa Chành trụi 3.3.2 Sàng lọc dòng Chành Trụi chuyển gen 3.4 ĐÁNH GIÁ KIỂU HÌNH CÂY CHUYỂN GEN 3.4.1 Đánh giá sinh trƣởng phát triển dòng lúa chuyển gen T2 3.4.2 Đánh giá khả giữ nƣớc phục hồi dòng lúa chuyển gen T2 3.4.3 Đánh giá khả chịu hạn tạo hạt dòng chuyển gen T3 124 3.4.4 Đánh giá biểu OsDREB1A gen liên quan chịu hạn khác chuyển gen hệ T3 127 KẾT LUẬN 130 KIẾN NGHỊ .132 DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 133 TÀI LIỆU THAM KHẢO 134 PHỤ LỤC 151 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid 3-AT 3-Amino-1, 2, 4-triazole A thaliana Arabidopsis thaliana A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens ABA Abscisic acid ABRE Yếu tố đáp ứng acid abscisic chứa trình tự ACGT (ACGT-containing abscisic acid response element) AD Vùng tác động (acting domain) ADB Ngân hàng phát triển châu Á (Asian Development Bank) AMP Adenosine monophosphate ADP Adenosine diphosphate ATP Adenosine triphosphate BAP 6-Benzylaminopurine BD Vùng liên kết (binding domain) BĐKH Biến đởi khí hậu bp Cặp bazơ (base pair) CBB Coomassie Brilliant Blue cDNA DNA bổ sung (complementary deoxyribonucleic acid) CDBK protein kinase phụ thuộc canxi (calciumdependent protein kinase) Ct Chu kỳ ngƣỡng (threshold cycle) dCTP Deoxy cytidin e triphos phate DEPC Diethylpyrocarbonate DMSO Dimethyl sulfoxide dNTP Deoxyribonucleoside Triphosphate DRE Yếu tố đáp ứng hạn (dehydration responsive element) DREB Protein liên kết với yếu tố đáp ứng hạn DRE (dehydration responsive element-binding protein) E coli Escherichia coli EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EtBr Ethidium bromide FAO Tổ chức lƣơng thực Nông nghiệp Liên Hợp quốc (Food and Agriculture Organization of United Nations) GMP Guanosine monophate Phụ lục 05 Kết giải trình tự vector tái tở hợp pBIG-Ubi:OsDREB2A Phụ lục 06 Kết giải trình tự vector tái tở hợp pBIG-Lip9:OsDREB2A 155 Phụ lục 07 Đánh giá hiệu suất qRT-PCR cho hai cặp mồi Hyg-Fw/Rv REF#3 156 Phụ lục 08 Kết kiểm tra số lƣợng copy dòng lúa chuyển trình tự mã hóa OsDREB1A STT (Lip9) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 157 Phụ lục 09 Kết kiểm tra số lƣợng copy dòng lúa chuyển trình tự mã hóa OsDREB2A STT (Lip9) 10 11 12 13 14 15 158 Av 2ΔCt±SD 0.63±0.012 0.105±0.057 0.55±0.029 0.113±0.016 0.41±0.018 0.49±0.030 0.48±0.021 1.15±0.019 0.42±0.025 0.61±0.009 1.27±0.014 0.53±0.044 0.111±0.027 0.57±0.014 0.49±0.029 Phụ lục 10 Kết kiểm tra số lƣợng copy dòng lúa chuyển gen mang vector trống STT (Lip9) 10 11 12 13 14 15 159 Phụ lục 11 Kết kiểm tra kiểu gen dòng lúa chuyển gen cấu trúc Lip9:OsDREB1A STT L11 L12 L13 L14 L15 L16 L17 L18 L21 L22 L23 L24 L25 L31 L32 L33 160 Phụ lục 12 Kết kiểm tra kiểu gen dòng lúa chuyển cấu trúc Ubi:OsDREB1A STT U11 U12 U13 U14 U15 U16 U17 U21 U22 U23 U24 161 Phụ lục 13 Kết qRT-PCR xác định số lƣợng copy chuyển gen Phụ lục 14 Đánh giá hệ rễ lúa chuyển gen giai đoạn sinh trƣởng 162 Phụ lục 15: Kết kiểm định giá trị trung bình khả tái sinh 26 giống lúa nghiên cứu có khả tạo callus tốt phần mềm GraphPad Prism 6.0 Compare row means (main row effect) Number of families Number of comparisons per family Alpha 163 164 165 10 vs 24 10 vs 25 10 vs 26 10 vs 27 10 vs 28 10 vs 33 10 vs 34 10 vs 35 10 vs 41 10 vs 42 10 vs 44 10 vs 46 10 vs 47 14 vs 15 14 vs 17 14 vs 19 14 vs 20 14 vs 23 14 vs 24 14 vs 25 14 vs 26 14 vs 27 14 vs 28 14 vs 33 14 vs 34 14 vs 35 14 vs 41 14 vs 42 14 vs 44 14 vs 46 14 vs 47 15 vs 17 15 vs 19 15 vs 20 15 vs 23 15 vs 24 15 vs 25 15 vs 26 15 vs 27 15 vs 28 15 vs 33 15 vs 34 15 vs 35 15 vs 41 15 vs 42 15 vs 44 15 vs 46 15 vs 47 17 vs 19 17 vs 20 17 vs 23 166 17 vs 24 17 vs 25 17 vs 26 17 vs 27 17 vs 28 17 vs 33 17 vs 34 17 vs 35 17 vs 41 17 vs 42 17 vs 44 17 vs 46 17 vs 47 19 vs 20 19 vs 23 19 vs 24 19 vs 25 19 vs 26 19 vs 27 19 vs 28 19 vs 33 19 vs 34 19 vs 35 19 vs 41 19 vs 42 19 vs 44 19 vs 46 19 vs 47 20 vs 23 20 vs 24 20 vs 25 20 vs 26 20 vs 27 20 vs 28 20 vs 33 20 vs 34 20 vs 35 20 vs 41 20 vs 42 20 vs 44 20 vs 46 20 vs 47 23 vs 24 23 vs 25 23 vs 26 23 vs 27 23 vs 28 23 vs 33 23 vs 34 23 vs 35 23 vs 41 167 23 vs 42 23 vs 44 23 vs 46 23 vs 47 24 vs 25 24 vs 26 24 vs 27 24 vs 28 24 vs 33 24 vs 34 24 vs 35 24 vs 41 24 vs 42 24 vs 44 24 vs 46 24 vs 47 25 vs 26 25 vs 27 25 vs 28 25 vs 33 25 vs 34 25 vs 35 25 vs 41 25 vs 42 25 vs 44 25 vs 46 25 vs 47 26 vs 27 26 vs 28 26 vs 33 26 vs 34 26 vs 35 26 vs 41 26 vs 42 26 vs 44 26 vs 46 26 vs 47 27 vs 28 27 vs 33 27 vs 34 27 vs 35 27 vs 41 27 vs 42 27 vs 44 27 vs 46 27 vs 47 28 vs 33 28 vs 34 28 vs 35 28 vs 41 28 vs 42 168 28 vs 44 28 vs 46 28 vs 47 33 vs 34 33 vs 35 33 vs 41 33 vs 42 33 vs 44 33 vs 46 33 vs 47 34 vs 35 34 vs 41 34 vs 42 34 vs 44 34 vs 46 34 vs 47 35 vs 41 35 vs 42 35 vs 44 35 vs 46 35 vs 47 41 vs 42 41 vs 44 41 vs 46 41 vs 47 42 vs 44 42 vs 46 42 vs 47 44 vs 46 44 vs 47 46 vs 47 169 ... HÌNH NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG LÚA CHUYỂN GEN CHỊU HẠN TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 41 1.4.1 Nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen chịu hạn giới 44 1.4.2 Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen. .. liệu quan trọng việc tạo giống trồng chuyển gen có khả chống chịu điều kiện hạn Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu chung: Phân lập chuyển đƣợc gen liên quan đến tính chịu hạn vào giống lúa Việt Nam. .. tâm nghiên cứu để chuyển vào lúa gen liên quan đến tính kháng sâu, gen chống chịu bệnh, gen kháng thuốc diệt cỏ, gen liên quan đến chất lƣợng gạo suất, gen liên quan đến khả chống chịu stress (hạn,