Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 9131:2011 về Thức ăn chăn nuôi – Định tính zearalenone quy định phương pháp định tính zearalenone trong thức ăn chăn nuôi và đặc biệt là trong ngô. Phương pháp này chỉ dùng cho mục đích sàng lọc. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.
Dùng ống đong (4.13) thêm cẩn thận 20 ml axetonitril (3.1), 60 ml nước 20 ml dung dịch chì axetat (3.7) vào lượng lại thu sau bay Trộn để tách pha 10 nồi cách thủy (4.10) trì 60 oC Kết tủa tạo thành Thêm g diatomit (3.9) lọc qua giấy lọc (4.3) Dùng pipet (4.14) chuyển 50 ml dịch lọc vào phễu chiết thực chiết ba lần liên tiếp, lần dùng 50 ml cloroform (3.3) Làm khô phần cloroform natri sulfat Thu phần cloroform bình cầu đáy tròn cô quay (4.4) làm bay gần đến khơ áp suất giảm Chuyển lượng lại sau bay vào ống nghiệm (4.8) dùng cloroform để tráng rửa, sau làm bay đến khơ dòng khí nitơ (3.10) nồi cách thủy (4.10) Cẩn thận dùng microxyranh thêm 0,5 ml hỗn hợp benzen/axetonitril (3.4) đậy chặt nắp ống nghiệm 6.5 Sắc ký lớp mỏng hai chiều 6.5.1 Sử dụng dung dịch (xem Hình 1) Vạch lên sắc ký (4.6) hai đường thẳng song song sát với hai cạnh liền kề (ở 50 mm 60 mm tương ứng tính từ từ cạnh) để đánh dấu giới hạn dịch chuyển dung mơi phía trước Đưa dung dịch sau lên sắc ký cách dùng microxyranh - điểm A, 25 μl dịch chiết tinh (6.4); - điểm B, 10 μl dung dịch chuẩn (3.11); - điểm C, μl dung dịch chuẩn (3.11); - điểm D, 10 μl dung dịch chuẩn (3.11); - điểm E, 15 μl dung dịch chuẩn (3.11) Làm khơ dòng khơng khí nitơ Các vết chấm thu phải có đường kính khoảng mm 6.5.2 Khai triển Phát triển sắc phổ theo hướng l sử dụng dung môi khai triển (3.5.1) (lớp 10 mm bể bão hòa) tránh ánh sáng, dung môi đạt đến vạch đánh dấu Lấy sắc ký hỏi bể để khơ 15 nhiệt độ môi trường, tránh ánh sáng Để thuận tiện hơn, sau khai triển theo hướng l, quan sát sắc phổ nhanh ánh sáng tử ngoại 253 nm khoanh chấm zearalenone nhanh bút chì (chấm điểm B cho thấy vị trí zearalenone) Hình – Chấm mẫu triển khai sắc ký đồ Sau đó, khai triển sắc ký theo hướng ll sử dụng dung môi triển khai (3.5.2) (lớp 10 mm bể chưa bão hòa) tránh ánh sáng, dung môi đến vạch đánh dấu Lấy sắc ký khỏi bể để khô nhiệt độ môi trường, tránh ánh sáng 6.6 Xác định 6.6.1 Yêu cầu chung Có thể sử dụng hai phương pháp xác định: quan sát mắt thường đo mật độ huỳnh quang Nếu có sẵn máy đo mật độ huỳnh quang nên dùng phương pháp 6.6.2 Quan sát mắt thường Xác định lượng zearalenone điểm chấm mẫu cách so sánh cường độ huỳnh quang ánh sáng UV điểm chấm từ chất chiết với cường độ điểm chấm C, D E dung dịch chuẩn, với sắc ký đặt cách đèn UV (4.7) 10 cm Dùng phương pháp nội suy, cần Nếu cường độ huỳnh quang điểm chấm 25 μl chất chiết lớn so với điểm chấm 15 μl dung dịch chuẩn, dùng thể tích nhỏ điểm A pha loãng chất chiết với hỗn hợp benzen/axetonitril (3.4) lặp lại sắc ký lớp mỏng (6.5) 6.6.3 Đo mật độ huỳnh quang Đo cường độ huỳnh quang chấm sử dụng máy đo mật độ huỳnh quang (4.9), ví dụ, bước sóng kích thích 313 nm bước sóng phát xạ 443 nm (bước sóng phát xạ cực đại 470 nm) Xác định hàm lượng zearalenone chấm mẫu cách so sánh cường độ huỳnh quang điểm chấm từ chất chiết với cường độ điểm chấm C, D E từ dung dịch chuẩn 6.7 Phép khẳng định zearalenone Phun thuốc thử benzidin bis-diazo hóa (3.8) lên sắc ký thu 6.5 Zearalenone cho chấm màu gạch đỏ tươi nhiệt độ phòng, nhạt dần sau tiếp xúc với khơng khí 15 Biểu thị kết 7.1 Phương pháp quan sát mắt thường Hàm lượng zearalenone, biểu thị microgam kilogam sản phẩm, tính cơng thức sau: c V1 V3 m V2 Trong đó: c nồng độ zearalenone dung dịch chuẩn (3.11), tính microgam mililit (μg/ml); m khối lượng phần mẫu thử tương ứng với thể tích chất chiết phụ thuộc vào q trình tinh (12,5 g), tính gam (g); V1 thể tích cuối dịch chiết có tính đến khả pha lỗng, tính microlit (μl); V2 V3 thể tích tương ứng chất chiết dung dịch chuẩn zearalenone (3.11) áp dụng cho sắc ký, cho cường độ huỳnh quang tương tự, tính microlit (μl) 7.2 Phép đo máy đo mật độ huỳnh quang Hàm lượng zearalenone, biểu thị microgam kilogam sản phẩm, tính theo cơng thức sau: m1 V1 m V2 Trong đó: m khối lượng phần mẫu thử (trong trường hợp 12,5 g) tương ứng với thể tích chất chiết phụ thuộc vào trình tinh (12,5 g), tính gam (g); m1 khối lượng zearalenone chấm chất chiết (có tính đến thể tích V 2), suy từ phép xác định, tính nanogam (ng); V1 thể tích cuối dịch chiết có tính đến khả lỗng, tính microlit (μl); V2 thể tích dịch chiết đưa vào sắc ký (trong trường hợp 25 μl), tính microlit (μl) Độ chụm Các chi tiết phép thử liên phòng thử nghiệm độ chụm phương pháp nêu Phụ lục A Các giá trị thu từ phép thử liên phòng thử nghiệm khơng áp dụng cho dải nồng độ chất khác với dải nồng độ chất nêu Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: - thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; - phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; - phương pháp thử dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; - phương pháp xác định sử dụng (quan sát mắt thường sử dụng máy đo huỳnh quang); - tất chi tiết thao tác không quy định tiêu chuẩn này, tùy chọn với chi tiết bất thường khác ảnh hưởng tới kết quả; - kết thu PHỤ LỤC A (Tham khảo) PHÉP THỬ LIÊN PHÒNG THỬ NGHIỆM Một phép thử liên phòng thử nghiệm quốc tế gồm có 20 phòng thử nghiệm tham gia (chỉ 16 phòng thử nghiệm số cung cấp kết sử dụng cho ngơ B) phòng thử nghiệm tiến hành ba phép xác định, cho kết thống kê (đánh giá theo ISO 5725:1986 1)) cho liệu nêu Bảng A.1 Bảng A.1 – Kết thử nghiệm liên phòng Ngơ B Mẫu Ngơ A (mẫu ngơ A pha lỗng đến 1/3) Số lượng phòng thử nghiệm lại sau trừ ngoại lệ 20 15 Trung bình, μg/kg 734 219 Độ lệch chuẩn lặp lại, sr, μg/kg 78 34 Hệ số biến thiên lặp lại, % 11 15 1) ISO 5725 (đã hủy bỏ) sử dụng để thu liệu độ chụm Giới hạn lặp lại, r(2,83 sr), μg/kg 221 96 Độ lệch chuẩn tái lập, sR, μg/kg 282 125 Hệ số biến thiên tái lập, % 38 57 Giới hạn tái lập, R (2,83 sR), μg/kg 798 354 ... tinh (6.4); - điểm B, 10 μl dung dịch chuẩn (3.11); - điểm C, μl dung dịch chuẩn (3.11); - điểm D, 10 μl dung dịch chuẩn (3.11); - điểm E, 15 μl dung dịch chuẩn (3.11) Làm khơ dòng khơng khí nitơ... phương pháp thử dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; - phương pháp xác định sử dụng (quan sát mắt thường sử dụng máy đo huỳnh quang); - tất chi tiết thao tác không quy định tiêu chuẩn này, tùy chọn với chi... D E dung dịch chuẩn, với sắc ký đặt cách đèn UV (4.7) 10 cm Dùng phương pháp nội suy, cần Nếu cường độ huỳnh quang điểm chấm 25 μl chất chiết lớn so với điểm chấm 15 μl dung dịch chuẩn, dùng thể