Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 549:2002 về Quy trình kiểm dịch nhập khẩu giống cây có múi áp dụng cho việc Kiểm dịch thực vật đối với các lô giống cây có múi nhập khẩu vào lãnh thổ Việt Nam qua các cửa khẩu đường bộ, đường thuỷ, đường sắt, đường hàng không, các cơ sở Kiểm dịch thực vật Sau nhập khẩu và các cơ sở cách ly khác trong phạm vi cả nước.
TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 549- 2002 QUY TRÌNH KIỂM DỊCH NHẬP KHẨU GIỐNG CÂY CÓ MÚI Hà Nội - 2002 Cơ quan biên soạn: Trung tâm Kiểm dịch thực vật Sau nhập I Cơ quan đề nghị ban hành: Vụ Khoa học Công nghệ CLSP & Cục Bảo vệ thực vật Cơ quan trình duyệt: Vụ Khoa học Công nghệ CLSP Cơ quan xét duyệt, ban hành: Bộ Nông nghiệp PTNT Quyết định số: 142/QĐ - BNN ngày 06 tháng 12 năm 2002 Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 549 - 2002 QUI TRÌNH KIỂM DỊCH NHẬP KHẨU GIỐNG CÂY CÓ MÚI Import quarantine procedure for citrus variety Phạm vi đối tượng áp dụng - Quy trình áp dụng cho việc Kiểm dịch thực vật lơ giống có múi nhập vào lãnh thổ Việt Nam qua cửa đường bộ, đường thuỷ, đường sắt, đường hàng không, sở Kiểm dịch thực vật Sau nhập sở cách ly khác phạm vi nước Thuật ngữ định nghĩa Trong qui trình thuật ngữ hiểu sau: - Cây có múi: Bao gồm ăn thuộc họ Rutaceae - Giống có múi: Bao gồm hạt, phận có múi dùng để nhân làm giống - Giống có múi nhập nội: Là giống có múi nhập vào lãnh thổ Việt Nam - Điều kiện cách ly: Là điều kiện tách biệt với bên trồng cây, tác nhân sinh học lan truyền xâm nhập từ vào - Kiểm dịch Sau nhập khẩu: Là biện pháp kỹ thuật kiểm tra sinh vật hại tiềm ẩn lô giống nhập điều kiện cách ly - Sinh vật hại tiềm ẩn: Là sinh vật hại theo giống nhập mắt thường phương tiện thô sơ chưa phát Trình tự bước kiểm dịch 3.1 Kiểm dịch cửa 3.1.1 Kiểm tra hồ sơ giấy tờ - Thực theo qui định hành Bộ Nông nghiệp Phát triển nơng thơn - Các giấy tờ có liên quan (Nếu có) 3.1.2 Kiểm tra lơ giống nhập Việc kiểm tra lô giống nhập áp dụng theo TCVN 4731- 89;10 TCN 336 - 98; 10 TCN 337 98;10 TCN 338 - 98 3.2 Kiểm dịch Sau nhập 3.2.1 Kiểm tra sơ sinh vật hại lô giống nhập 3.2.2 Xử lý trước gieo trồng - Nếu ni cấy mơ khơng phải xử lý - Nếu hạt giống phải ngâm dung dịch 8- Hydroxyquinoline Sunphat 1% phút - Nếu cây, phận loại sản phẩm khác: + Phải khử trùng Methyl Bromide (CH3Br); + Nhúng dung dịch Sodium Hypochlorite (Na ClO2 4H2O) có chứa 1% clo phút; 3.2.3 Gieo trồng: Các vật liệu giống nhân trồng điều kiện cách ly 3.2.4 Kiểm tra sinh vật tiềm ẩn: Kiểm tra vật liệu giống nhập sở Kiểm dịch thực vật Sau nhập nhằm xác định sinh vật gây hại tiềm ẩn Riêng bệnh Vi khuẩn, Virus, Viroid Mycoplasma sử dụng phương pháp cụ thể sau để chẩn đoán: + PCR - Phản ứng chuỗi Polymerasa (Polymerasa Chain Reaction) + ELISA - Men liên kết miễn dịch (Enzyme - Linked Immuno - Sorbent Assays) + Chỉ thị sinh học (Biological Indexing) (Các phương pháp giới thiệu phụ lục kèm theo) 3.2.5 Thời gian kiểm tra Thời gian kiểm tra sở Kiểm dịch thực vật Sau nhập từ - 12 tháng 3.2.6 Kết kiểm tra Danh mục Đối tượng Kiểm dịch thực vật sinh vật hại tiềm ẩn phát giống có múi nhập 3.2.7 Kết luận 1) Tình hình dịch hại 2) Xử lý lơ giống 3) Cấp giấy chứng nhận Kiểm dịch thực vật Sau nhập (nếu đủ điều kiện) PHỤ LỤC: KIỂM DỊCH THỰC VẬT SAU NHẬP KHẨU Kiểm tra Kiểm dịch Sau nhập Bảng Các phương pháp kiểm tra Phản ứng chuỗi Polymerasa Sử dụng chẩn đoán số loại bệnh ẩn Men liên kết miễn dịch Virus tàn lụi cam quýt (Citrus tristeza closterovirus) Xylella fastidiosa Spiroplasma citri Virus lùn Satsuma (Satsuma dwarf ilarvirus) Virus nhỏ cam quýt (Citrus tatter leaf capillovirus) Chỉ thị sinh học Các loài Các giống thị Citrus sinensis Cam Tổ hợp Virus bệnh đốm (Psorosis complex) Spiroplasma citri Liberobacter asiaticum Liberobacter africanum Citrus limon Chanh Eureka Virus tàn lụi cam quýt (Citrus tristeza closterovirus) Virus quăn cam quýt (Citrus leaf rugose virus) Virus khảm (Citrus variegation ilarvirus) Citrus medica L Chanh Yên Viroid vẩy vỏ (Citrus exocortis viroid) Citrus aurantifolia Chanh Tây ấn Virus tàn lụi cam quýt (Citrus tristeza closterovirus) Virus biến dạng gân (Citrus veinenation virus) Poncirus trifoliata X C sinensis Chanh ba quất Swingle Bệnh nhỏ cam quýt (Citrus tatter leaf capillovirus) 1.1 Phương pháp PCR Mỗi lồi sinh vật có cấu trúc DNA khác giống loài có khác Trong giống, DNA lồi có đoạn cấu trúc giống nhau, có đoạn có cấu trúc khác mà cấu trúc đặc trưng cho loài mà loài khác khơng có Đây sở di truyền để phân biệt loài loài khác Phương pháp PCR nhằm nhân lên gấp bội số lượng đoạn DNA đặc trưng để từ chẩn đốn xác lồi 1.2 Phương pháp ELISA Kỹ thuật dựa kết hợp men với kháng thể kháng nguyên thành vật đánh dấu men sau chúng lại có phản ứng với kháng nguyên kháng thể tương ứng thành hợp chất miễn dịch men đánh dấu Men kết hợp hợp chất miễn dịch gặp chất đệm thúc đẩy phản ứng thuỷ phân chất đệm tạo màu vàng Tốc độ phản ứng thuỷ phân nhanh, màu vàng rõ, chứng tỏ men nhiều, điều chứng tỏ nồng độ kháng nguyên cao Do tính đặc hiệu phản ứng ELISA ta xác định đặc tính kháng nguyên Bộ Kit để kiểm tra sử dụng cho bệnh sau: - Xylella fastidiosa - Spiroplasma citri - Lùn Satsuma (Satsuma dwarf ilarvirus) - Tàn lụi có múi (Citrus tristeza closterovirus) - Virus nhỏ có múi (Citrus tatter leaf cappillovirus) 1.3 Chỉ thị sinh học Dùng thị để xác định bệnh ẩn có múi hai mức nhiệt độ: * Nhiệt độ 18 - 25oC (tốt 20 - 22 oC) cho tác nhân gây bệnh sau: - Virus tàn lụi có múi (Viruses Citrus tristeza closterovirus) - Virus biến dạng gân có múi (Citrus veinenation virus) - Virus khảm (Citrus varegation ilarvirus) - Vius quăn có múi (Citrus leaf rugose virus) - Virus bé có múi (Citrus tatter leaf capillovirus) * Nhiệt độ 25 - 35oC (tốt 30 - 35 oC) cho tác nhân gây bệnh: - Viroid vảy vỏ có múi (citrus exocortis viroid) - Viroid mạch dẫn có múi (citrus cachexia viroid) - Spiroplasma citri - Liberobacter asiaticum Liberobacter africanum Bảng 1.3.1 Số thị cần nhân giống Dải nhiệt độ Cây thị Số chậu ((15cm)Số chậu Lạnh 18-25oC Cam Chanh Eureka Chanh Tây ấn Chanh Rusk Cam Chanh yên 2 Nóng 25-35oC Bảng 1.3.2 Cây thị dùng cho việc kiểm tra bệnh Bệnh Cây thị thích hợp Cây thị khác Cachexia (Xyloporosis) Chanh yên - Chanh sần - Poncirus trifoliata Virus quăn (Citrus leaf rugose) Chanh Tây ấn - Citrus limon - Bưởi đỏ Duncan Virus khảm (Citrus variegation) Chanh yên Đậu tương đậu đen Giòn (Crinkly leaf) Chanh Eureka - Cristacortis Cam - Quýt Orlando - Cam chua Vảy vỏ (Exocortis) Chanh yên Chanh sần Bảng 1.3.2 Cây thị dùng cho việc kiểm tra bệnh Bệnh Cây thị thích hợp Cây thị khác Greening and Dieback Cam - Quýt Sexton - Bưởi Duncan Impietratura Cam Bưởi Tổ hợp bệnh đốm Virus (Psorosis complex) Cam - Quýt Homosassa, Emperor Đốm vòng dòngB (Ringspot (Psorosis B )) Cam - Chanh Tây ấn - Lùn Satsuma (Satsuma dwarf) - Quýt Satsuma - Sesamum indicum Stubborn Cam - Quất Sexton - Bưởi Duncan Nhỏ lá/Lùn (Tatter leaf/ stunt) Chanh ba quất Swingle - Chanh Troyer - Đậu đen (Vigna cilindrica) - Citrus excelsa - Nicotiana clevelandii Hai chủng tàn lụi cam quýt (Tristeza - stem pitting and seedling yellows) Chanh Tây ấn - Cam đắng Seville Chanh Eureka - Cam chua (Citrus aurantium) Chanh Mexica Biến dạng gân/U thân gỗ (Vein enation/ woody Gall) Chanh Tây ấn Chanh sần Bảng 1.3.3 Triệu chứng bệnh thị Dải nhiệt độ Bệnh Cam Quăn Chanh Eureka CF Chanh Tây ấn Chanh ba lá, quýt Chanh yên LP (Citrus leaf rugose) Biến dạng gân AS (Citrus variegation) Giòn (Crinkly leaf) Lạnh AS Cristacortis OL Impietratura OL Đốm dòng A CF LP (Psorosis A) Đốm dòng B OL (Psorosis B) Nhỏ lá/lùn (Tatter leaf / stunt) CM &S Đốm tàn lụi (Tristeza – stempitting) Vàng tàn lụi (Tristeza – yellows) CVF&WP LY & S Bảng 1.3.3 Triệu chứng bệnh thị Biến dạng/u thân gỗ (Veinenation / woody gall) VE Exocortis Nóng LE Greening and dieback VY & LM Stubborn CM AS - Asteroid spots (đốm dạng sao) CM - Chlorotic mottling (đốm màu) vàng gân) CF - Chlorotic flecks (đốm vàng) CVF - Chlorotic vein flecking (đốm màu LE - Leaf epinasty LM - Leaf mottle (đốm lá) LP - Leaf puckering (nhăn lá) LY - Leaf yellowing (vàng lá) OL - Oak leaf pattern (dải sùi lá) S - Stunting (lùn cây) VE - Veinenation (biến dạng gân) VY - Vein yellowing (vàng gân) WP - Wood pitting (Đốm thân gỗ) Nhân giống, chăm sóc bảo quản sở Sau nhập 2.1 Nhân gốc ghép thị Các hạt gieo để làm thị sinh học gốc ghép lấy từ sở bệnh có uy tín, hạt đem gieo khay để nhiệt độ 20 - 25oC Cây thị chanh yên (Citrus medica L.) nhân giống từ cành nhiệt độ 30 - 35oC Cây trồng hỗn hợp chất độn (của Trường Đại học California) theo tỷ lệ thể tích phù hợp gồm: than bùn : cát bột đá phân vô tiệt trùng theo phương pháp Paster (ở 60oC 30 phút) thêm vào nhiều 10% vỏ trấu (tính theo thể tích) Trước sử dụng làm thị gốc ghép khơng bón thúc cho Sau chuyển chúng vào chậu túi nilon có chứa 250 – 300g hỗn hợp chất theo công thức Trường Đại học California Nếu biểu triệu chứng thiếu dinh dưỡng bón bổ sung hỗn hợp chất độn với tỷ lệ máu khô bột xương: Dolomit Sau đưa ghép trồng điều kiện nhiệt độ 30 - 35oC 2.2 Nhân giống từ mắt ghép Hai nhân giống từ mắt ghép gốc chanh Sần Ba đến bốn tuần sau ghép mắt, cắt chồi nách chanh sần để tập trung cho mắt ghép phát triển Chọn làm thị Nếu cần tiến hành ghép đỉnh sinh trưởng Cây nhân lên từ thị trả lại cho chủ hàng 2.3 Phòng trừ dịch hại Sử dụng thuốc hoá học, dầu thực vật thuốc sinh học để phòng trừ sinh vật hại nhà kính Các sinh vật hại thường có nhện hai chấm, nhện to bụng, rệp phấn, rệp sáp Chú ý rệp muội đen có múi phải sớm diệt trừ triệt để nhằm ngăn chặn việc truyền Virus Loại bỏ tác nhân gây bệnh nhân giống Ghép đỉnh sinh trưởng kỹ thuật nhân dòng giống có múi loại bỏ bệnh, với khả tạo dòng Virus tác nhân gây bệnh khác Tất có múi phải ghép đỉnh sinh trưởng lần trước xuất khỏi sở Kiểm dịch Sau nhập Điều có nghĩa đảm bảo Xanthomonas campestris pv citrumelo, phytoplasma, Viroid Virus Các bước kiểm tra làm nhiều lần đến cho kết kiểm tra khẳng định bệnh Những gốc ghép sản xuất từ tổ chức giới có chứng nhận đạt tiêu chuẩn khơng cần phải ghép lại Việt Nam 3.1 Mắt ghép dùng ghép đỉnh sinh trưởng Việc ghép đỉnh sinh trưởng thực có mắt ghép thích hợp đưa tới Nếu có chồi ghép nhập khơng thích hợp cho việc ghép ban đầu mắt ghép ghép vào thân mẹ sau chọn mắt ghép thời điểm thích hợp để tiến hành ghép 3.2 Xử lý mắt ghép để ghép đỉnh sinh trưởng Tiệt trùng bề mặt mắt ghép trước bắt đầu ghép Nhúng mắt ghép dung dịch Ethanol 70 % phút, sau nhúng dung dịch Clorin (Clo) 0,2% Sodium hypochrorite 10 phút Bảo quản mắt ghép nhiệt độ 26oC cát ẩm tiệt trùng với chu kỳ chiếu sáng 16 đến đem sử dụng 3.3 Sản xuất gốc ghép để ghép đỉnh sinh trưởng Sử dụng chanh ba lá, chanh sần bưởi Citrus grandis (Chỉ dùng cho giống bưởi Pomelo) làm gốc ghép Lấy hạt từ tươi sau rửa thịt Tách bỏ lớp vỏ ngồi hạt bảo quản giấy lọc ẩm đến đem sử dụng Khử trùng bề mặt hạt dung dịch Clorin 0,5 % Sodium hypochlorite (Có chứa 1% clo) 10 phút Sau rửa kỹ nước tiệt trùng tối thiểu lần Đưa hạt vô trùng vào môi trường Agar để buồng cấy, sau đưa vào tủ ấm 26 oC bóng tối Nếu hạt khơng dùng sau tách khỏi quả, ta phơi giá đỡ Hạt tiệt trùng bề mặt bảo quản cách nhúng dung dịch Clorin % Sodium hypochlorite Sau tiến hành làm hạt tươi Sau - ngày hạt mọc Chuẩn bị ống nghiệm để trồng giữ mơi trường đồng có chứa mơi trường hỗn hợp Murshige Skoog + đường + agar, tiệt trùng 121oC 20 phút Đặt hạt nảy mầm lên bề mặt agar ống nghiệm nuôi cấy chồi bắt đầu mọc Khi chồi ghép đạt đến độ dài thích hợp - cm, sau 10 - 12 ngày đưa ống nghiệm vào buồng tối - 7oC Chọn thẳng đưa vào buồng lạnh để ghép chồi đỉnh Thời gian lưu giữ năm 3.4 Ghép đỉnh sinh trưởng Ngâm dụng cụ cồn 70% khoảng trước dùng Chuẩn bị mẩu dao cạo tra vào cán Nhúng dao cắt vào chất tẩy sau làm cồn hơ khơ lần cắt Không làm cháy lưỡi dao sau nhúng cồn Thay đổi lưỡi dao chúng bị cùn Tiệt trùng bề mặt cành ghép trực tiếp dung dịch Clorin 0,5 % Sodium hypochlorite 5-10 phút, tuỳ thuộc vào điều kiện cành ghép Nếu chúng tiệt trùng trồng cát, chúng sử dụng Nếu chúng bị nhiễm bẩn đặt chúng vải xử lý dung dịch Chlorin 0,01 % Sodium hypochlorite phút sau rửa cẩn thận lần nước lọc Cắt tỉa mầm chồi bên, mở vết ghép hình chữ T tiến hành ghép Loại bỏ hết cành ghép để lộ mô phân sinh Sử dụng lưỡi dao cho mô phân sinh Đặt mô phân sinh lên vết ghép đóng nắp vết ghép lại Đặt giấy lọc trồng ống nghiệm có hỗn hợp môi trường Murshige Skoog + đường + muối sắt hồ tan + White's vitamin Xử lý mơi trường nhiệt độ 121oC 10 phút Giữ nhiệt độ 28 oC với chu kỳ chiếu sáng 16 Chăm sóc tối thiểu - tuần dài Cây cần cắt tỉa mầm giai đoạn sinh trưởng ống nghiệm chuyển vào môi trường 3.5 Chuyển ghép đỉnh sinh trưởng khỏi ống nghiệm Sau - tuần, mắt ghép mọc chồi cm với lá, đưa khỏi ống nghiệm, tỉa bớt rễ trồng chậu có chứa hỗn hợp chất độn Giữ điều kiện ánh sáng yếu tuần Duy trì ẩm độ cao vài ngày đầu cách dùng nhựa che phủ Khi cứng cáp ta loại bỏ dần nhựa che phủ Có thể sử dụng biện pháp tương tự thấy mắt ghép xanh chưa phát triển Hàng ngày tưới 2g/l Ca(NO3)2 Kiểm tra dòng ghép để khẳng định loại bỏ hết bệnh 3.6 Mụi truờng nuụi cấy Các hợp chất Hàm lượng Môi trường Rắn Lỏng Dung dịch muối KNO3 1,90 g/l 1,90 g/l Murashige & Skoog NH4NO3 1,65 g/l 1,65 g/l CaCl2.2H2O 440 mg/l 440 mg/l MgSO4.7H2O 370 mg/l 370 mg/l KH2PO4 170 mg/l 170 mg/l MnSO4.H2O 16,9 mg/l 16,9 mg/l ZnSO4.7H2O 8,6 mg/l 8,6 mg/l H3BO3 6,2 mg/l 6,2 mg/l Kl 0,82 mg/l 0,82 mg/l Na2MoO4.2H2O 0,25 mg/l 0,25 mg/l CuSO4.5H2O 0,025 mg/l 0,025 mg/l CoCl2.6H2O 0,025 mg/l 0,025 mg/l Na2-EDTA - 37,3 mg/l FeSO4.7H2O - 27,8 mg/l Myo-I-Inositol - 37,3 mg/l Nicotinic - 27,8 mg/l Pyridoxine - 100,0 mg/l Thiamine HCl - 1,0 mg/l Đường Sucrose 30 g/l 1,00,2 mg/l Agar Agar 10 g/l 75 g/l Muối sắt hoà tan Một số chất khác PHỤ LỤC KIỂM DỊCH THỰC VẬT SAU NHẬP KHẨU Kiểm tra Kiểm dịch Sau nhập Bảng Các phương pháp kiểm tra Phản ứng chuỗi Polymerasa Sử dụngchẩn đoán số loại bệnh ẩn Men liên kết miễn dịch Citrus tristeza closterovirus ( Virus tàn lụi cam quýt) Xylella fastidiosa Spiroplasma citri Satsuma dwarf ilarvirus (Virus lùn Satsuma) Citrus tatter leaf capillovirus (Virus nhỏ cam quýt) Chỉ thị sinh học Các loài Các giống thị Citrus sinensis Maltese Blood or Ruby Blood (Cam) Psorosis complex (Tổ hợp Virus bệnh đốm) Spiroplasma citri Liberobacter asiaticum Liberobacter africanum Citrus limon Lambert Eureka (Chanh Eureka) (Chanh) Citrus tristeza closterovirus, yellows strain (Virus tàn lụi cam quýt) Citrus leaf rugose virus (Virus quăn cam quýt) Citrus variegation ilarvirus Citrus medica L Etrog (Chanh Yên) Citrus exocortis viroid (Viroid vẩy vỏ) West Indian lime (Chanh Tây ấn) Citrus tristeza closterovirus-stem pitting strain (Virus tàn lụi cam quýt) (Chanh yên) Citrus aurantifolia (Quýt) Citrus veinenation virus (Virus biến dạng gân lá) Poncirus trifoliata X C sinensis Rusk or Swingle, Citrange (Rusk or Swingle chanh) Citrus tatter leaf capillovirus (Nhỏ cam quýt) 1.1 Phương pháp PCR Mỗi lồi sinh vật có cấu trúc DNA khác giống loài có khác Trong giống, DNA lồi có đoạn cấu trúc giống nhau, có đoạn có cấu trúc khác mà cấu trúc đặc trưng cho loài mà loài khác khơng có Đây sở di truyền để phân biệt loài loài khác Phương pháp PCR nhằm nhân lên gấp bội số lượng đoạn DNA đặc trưng để từ chẩn đốn xác lồi 1.2 Phương pháp ELISA Kỹ thuật dựa kết hợp men với kháng thể kháng nguyên thành vật đánh dấu men sau chúng lại có phản ứng với kháng nguyên kháng thể tương ứng thành hợp chất miễn dịch men đánh dấu Men kết hợp hợp chất miễn dịch gặp chất đệm thúc đẩy phản ứng thuỷ phân chất đệm tạo màu vàng Tốc độ phản ứng thuỷ phân nhanh, màu vàng rõ, chứng tỏ men nhiều, điều chứng tỏ nồng độ kháng nguyên cao Do tính đặc hiệu phản ứng ELISA ta xác định định lượng định tính kháng nguyên Bộ Kit để kiểm tra sử dụng cho bệnh sau: - Xylella fastidiosa - Spiroplasma citri - Satsuma dwarf ilarvirus (Lùn Satsuma) - Citrus tristeza closterovirus (Tàn lụi có múi) - Citrus tatter leaf cappillovirus (Virus nhỏ có múi) 1.3 Chỉ thị sinh học Dùng thị để xác định bệnh ẩn có múi hai mức nhiệt độ: * Nhiệt độ 18 - 25oC (tốt 20 - 22 oC) cho tác nhân gây bệnh sau: - Viruses Citrus tristeza closterovirus (Virus tàn lụi có múi) - Citrus veinenation virus (Virus biến dạng gân có múi) - Citrus varegation ilarvirus - Citrus leaf rugose virus (Vius quăn có múi) - Citrus tatter leaf capillovirus (Virus bé có múi) * Nhiệt độ 25 - 35oC (tốt 30 - 35 oC) cho tác nhân gây bệnh: - citrus exocortis viroid (Viroid vảy vỏ có múi) - citrus cachexia viroid (Viroid mạch dẫn có múi) - Spiroplasma citri - Liberobacter asiaticum - Liberobacter africanum Bảng 1.3.1 Số thị cần nhân giống Dải nhiệt độ Cây thị Số chậu (15cm) Số chậu Lạnh 18-25oC Sweet Orange (Cam ngọt) Eureka Lemon (Chanh Eureka) West Indian Lime (Chanh Tây ấn) Rusk Citrange (Chanh Rusk) Sweet Orange (Cam ngọt) Etrog Citron Rooted (Chanh yên) 2 Nóng 25-35oC Bảng 1.3.2 Cây thị cho kiểm tra bệnh Bệnh Cây thị thích hợp Cây thị khác Cachexia (Xyloporosis) Etrog citron (Chanh yên) Rough lemon (Chanh sần) Poncirus trifoliata Citrus leaf rugose (Virus quăn lá) West Indian lime (Chanh Tây ấn) Citrus limon Citrus variegation (Virus biến dạng) Etrog citron (Chanh yên) Bean and cowpea (Đậu tương đậu đen) Crinkly leaf (Giòn lá) Eureka lemon (Chanh Eureka) - Cristacortis Sweet orange (Cam ngọt) Orlando tangelo (Quýt Orlando) Duncan grapefruit Red (Bưởi đỏ Duncan) Sour orange (Cam chua) Exocortis (Vảy vỏ) Etrog citron (Chanh yên) Rough lemon (Chanh sần) Greening and Dieback Sweet orange (Cam ngọt) Sexton tangelo (Quýt Sexton) (chết khô) Duncan grapefruit (Bưởi Duncan) Impietratura Sweet orange (Cam ngọt) Grapefruit (Bưởi) Psorosis complex (Tổ hợp bệnh đốm Virus) Sweet orange (Cam ngọt) Homosassa, Emperor mandarin (Quýt Homosassa, Emperor) West Indian lime (Chanh Tây ấn) Ringspot (Psorosis B ) (Đốm vòng dòngB) Sweet orange (Cam ngọt) Satsuma dwarf (Lùn Satsuma) Satsuma mandarin (Quýt Satsuma) Sesamum indicum Stubborn Sweet orange (Cam ngọt) Sexton tangelo (Quýt Sexton) Duncan grapefruit (Bưởi Duncan) Tatter Leaf/ Stunt Citrange (Chanh) Troyer citrange (Chanh Troyer) (Nhỏ lá/Lùn cây) Citrus excelsa cowpea Nicotiana clevelandii Tristeza - Stem pitting and West Indian lime (Chanh Seedling Yellows (2 chủng tàn lụi Tây ấn) Eureka lemon cam quýt) (Chanh Eureka) Bitter sweet seville (Cam đắng Seville) Sweet orange (Cam ngọt) Sour orange (Cam chua) Mexica lime (Chanh Mexica) Vein Enation/ Woody Gall (Biến dạng gân/U thân gỗ) West Indian lime (Chanh Tây ấn) Rough lemon (Chanh sần) Bảng 1.3.3 Triệu chứng bệnh thị Dải nhiệt độ Bệnh Sweet Orange (Cam ngọt) Citrus leaf rugose (Quăn lá) Eureka Lemon (Chanh Eureka) CF West Indian Lime (Chanh Tây ấn) LP Citrange cv Rusk or Swingle (Chanh, bưởi quýt) Citrus medica L (Chanh yên) Bảng 1.3.3 Triệu chứng bệnh thị Citrus variegation AS (Biến dạng gân lá) Crinkly leaf AS LP (Giòn lá) Lạnh Cristacortis OL Impietratura OL Psorosis A CF (Đốm dòng A) Psorosis B OL (Đốm dòng B) Tatter Leaf / Stunt CM &S (Nhỏ lá/lùn) Tristeza - Stempitting CVF&WP (Đốm tàn lụi) Tristeza - Yellows LY & S (Vàng tàn lụi) Veinenation / Woody Gall (Biến dạng/u thân gỗ) VE Exocortis Nóng LE Greening and Dieback (Greening khơ cành) VY & LM Stubborn CM AS - Asteroid spots (Đốm dạng sao) CM - Chlorotic mottling (Đốm màu) vàng gân) LE - Leaf epinasty LP - Leaf puckering (Nhăn lá) CF - Chlorotic flecks (Đốm vàng) CVF - Chlorotic vein flecking (Đốm màu LM - Leaf mottle (Đốm lá) LY - Leaf yellowing (Vàng lá) OL - Oak leaf pattern (Dải sùi lá) S - Stunting (Lùn cây) VE - Veinenation (Biến dạng gân) VY - Vein yellowing (Vàng gân) WP - Wood pitting (Đốm thân gỗ) Nhân giống, chăm sóc bảo quản sở Sau nhập 2.1 Nhân gốc ghép thị Các hạt gieo để làm thị sinh học gốc ghép lấy từ sở bệnh có uy tín, hạt đem gieo khay để nhiệt độ 20 - 25oC Cây thị chanh yên (Citrus medica L.) nhân giống từ cành nhiệt độ 30 - 35oC Cây trồng hỗn hợp chất độn (của Trường Đại học California) theo tỷ lệ thể tích phù hợp gồm: than bùn : cát bột đá phân vô tiệt trùng theo phương pháp Paster (ở 60oC 30 phút, trình lặp lại từ 2-3 lần xử lý tác dụng tia phóng xạ) thêm vào nhiều 10% vỏ trấu (tính theo thể tích) Trước sử dụng làm thị gốc ghép khơng bón thúc cho Sau chuyển chúng vào chậu túi nilon chứa 1,5-2,0 kg chất có chứa hỗn hợp theo công thức Trường Đại học California Nếu biểu triệu chứng thiếu dinh dưỡng bón bổ sung hỗn hợp chất độn với tỷ lệ máu khô bột xương: Dolomit Sau chanh yên số loại cam trồng điều kiện nhiệt độ 30 - 35oC 2.2 Nhân giống từ mắt ghép Hai nhân giống từ mắt ghép gốc chanh sần Ba đến bốn tuần sau ghép mắt, cắt chồi nách chanh sần để tập trung cho mắt ghép phát triển Chọn làm thị Nếu cần tiến hành ghép đỉnh sinh trưởng Cây nhân lên từ thị trả lại cho chủ hàng 2.3 Phòng trừ dịch hại Sử dụng thuốc hoá học, dầu thực vật thuốc sinh học để phòng trừ sinh vật hại nhà kính Các sinh vật hại thường có nhện hai chấm, nhện to bụng, rệp phấn, rệp sáp Chú ý rệp muội đen có múi phải sớm diệt trừ triệt để nhằm ngăn chặn việc truyền Virus Loại bỏ tác nhân gây bệnh nhân giống Ghép đỉnh sinh trưởng kỹ thuật nhân dòng giống có múi loại bỏ bệnh, với khả tạo dòng Virus tác nhân gây bệnh khác Tất có múi phải ghép đỉnh sinh trưởng lần trước xuất khỏi sở Kiểm dịch Sau nhập Điều có nghĩa đảm bảo Xanthomonas campestris pv citrumelo, phytoplasma, Viroid Virus Các bước kiểm tra làm nhiều lần đến cho kết kiểm tra khẳng định bệnh Những gốc ghép sản xuất từ tổ chức giới có chứng nhận đạt tiêu chuẩn khơng cần phải ghép lại Việt Nam 3.1 Mắt ghép dùng ghép đỉnh sinh trưởng Việc ghép đỉnh sinh trưởng thực có mắt ghép thích hợp đưa tới Nếu có chồi ghép nhập khơng thích hợp cho việc ghép ban đầu mắt ghép ghép vào thân mẹ sau chọn mắt ghép thời điểm thích hợp để tiến hành ghép 3.2 Xử lý mắt ghép để ghép đỉnh sinh trưởng Tiệt trùng bề mặt mắt ghép trước bắt đầu ghép Nhúng mắt ghép dung dịch Ethanol 70 % phút, sau nhúng dung dịch Clorin (Clo) 0,2% Sodium hypochrorite 10 phút Bảo quản mắt ghép nhiệt độ 26oC cát ẩm tiệt trùng với chu kỳ chiếu sáng 16 đến đem sử dụng 3.3 Sản xuất gốc ghép để ghép đỉnh sinh trưởng Sử dụng chanh ba lá, chanh sần bưởi Citrus grandis (chỉ dùng cho giống bưởi Pomelo) làm gốc ghép Lấy hạt từ tươi sau rửa thịt Tách bỏ lớp vỏ hạt bảo quản giấy lọc ẩm đến đem sử dụng Khử trùng bề mặt hạt dung dịch Clorin 0,5 % Sodium hypochlorite (có chứa 1% clo) 10 phút Sau rửa kỹ nước tiệt trùng tối thiểu lần Đưa hạt vô trùng vào môi trường Agar để buồng cấy, sau đưa vào tủ ấm 26 oC bóng tối Nếu hạt không dùng sau tách khỏi quả, ta phơi giá đỡ Hạt tiệt trùng bề mặt bảo quản cách nhúng dung dịch Clorin % Sodium hypochlorite Sau tiến hành làm hạt tươi Sau - ngày hạt mọc Chuẩn bị ống tuýp để trồng giữ môi trường đồng có chứa mơi trường hỗn hợp Murshige Skoog + đường + agar, tiệt trùng 121oC 15-20 phút Đặt hạt nảy mầm lên bề mặt agar ống tuýp nuôi cấy chồi bắt đầu mọc Khi chồi ghép đạt đến độ dài thích hợp - cm, sau 10 - 12 ngày đưa ống tuýp vào buồng tối - 7oC Chọn thẳng đưa vào buồng lạnh để ghép chồi đỉnh Thời gian lưu giữ năm 3.4 Ghép đỉnh sinh trưởng Ngâm dụng cụ cồn 70% khoảng trước dùng Chuẩn bị mẩu dao cạo tra vào cán Nhúng dao cắt vào chất tẩy sau làm cồn hơ khô lần cắt Không làm cháy lưỡi dao sau nhúng cồn Thay đổi lưỡi dao chúng bị cùn Tiệt trùng bề mặt cành ghép trực tiếp dung dịch Clorin 0,5 % Sodium hypochlorite 5-10 phút, tuỳ thuộc vào điều kiện cành ghép Nếu chúng tiệt trùng trồng cát, chúng sử dụng Nếu chúng bị nhiễm bẩn đặt chúng vải xử lý dung dịch Chlorin 0,01 % Sodium hypochlorite phút sau rửa cẩn thận lần nước lọc Cắt tỉa mầm chồi bên, mở vết ghép hình chữ T tiến hành ghép Loại bỏ hết cành ghép để lộ mô phân sinh Sử dụng lưỡi dao cho mô phân sinh Đặt mơ phân sinh lên vết ghép đóng nắp vết ghép lại Đặt giấy lọc trồng ống có hỗn hợp mơi trường Murshige Skoog + đường + muối sắt hoà tan + White's vitamin Xử lý môi trường nhiệt độ 121oC 10 phút Giữ nhiệt độ 28 oC với chu kỳ chiếu sáng 16 Chăm sóc tối thiểu - tuần dài Cây cần cắt tỉa mầm giai đoạn sinh trưởng ống chuyển vào mơi trường 3.5 Chuyển ghép đỉnh sinh trưởng khỏi ống tuýp Sau - tuần, mắt ghép mọc chồi cm với lá, đưa khỏi ống tuýp, tỉa bớt rễ trồng chậu có chứa hỗn hợp chất độn Giữ điều kiện ánh sáng yếu tuần Duy trì ẩm độ cao vài ngày đầu cách dùng nhựa che phủ Khi cứng cáp ta loại bỏ dần nhựa che phủ Có thể sử dụng biện pháp tương tự thấy mắt ghép xanh chưa phát triển Hàng ngày tưới 2g/l Ca(NO3)2 Kiểm tra dòng ghép để khẳng định loại bỏ hết bệnh 3.6 Mụi truờng nuụi cấy Các hợp chất Hàm lượng Môi trường Rắn Lỏng Murashige & Skoog KNO3 1,90 g/l 1,90 g/l dung dịch muối NH4NO3 1,65 g/l 1,65 g/l CaCl2.2H2O 440 mg/l 440 mg/l MgSO4.7H2O 370 mg/l 370 mg/l KH2PO4 170 mg/l 170 mg/l MnSO4.H2O 16,9 mg/l 16,9 mg/l ZnSO4.7H2O 8,6 mg/l 8,6 mg/l H3BO3 6,2 mg/l 6,2 mg/l Kl 0,82 mg/l 0,82 mg/l Na2MoO4.2H2O 0,25 mg/l 0,25 mg/l CuSO4.5H2O 0,025 mg/l 0,025 mg/l CoCl2.6H2O 0,025 mg/l 0,025 mg/l Na2-EDTA - 37,3 mg/l FeSO4.7H2O - 27,8 mg/l Myo-I-Inositol - 37,3 mg/l Axit Nicotinic - 27,8 mg/l Pyridoxine - 100,0 mg/l Thiamine HCl - 1,0 mg/l Đường Sucrose 30 g/l 1,00,2 mg/l Agar 10 g/l 75 g/l Muối sắt hoà tan Một số chất khác Agar ... Kiểm tra lơ giống nhập Việc kiểm tra lô giống nhập áp dụng theo TCVN 4731- 89 ;10 TCN 336 - 98; 10 TCN 337 98 ;10 TCN 338 - 98 3.2 Kiểm dịch Sau nhập 3.2.1 Kiểm tra sơ sinh vật hại lô giống nhập...TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 549 - 2002 QUI TRÌNH KIỂM DỊCH NHẬP KHẨU GIỐNG CÂY CÓ MÚI Import quarantine procedure... đến cho kết kiểm tra khẳng định bệnh Những gốc ghép sản xuất từ tổ chức giới có chứng nhận đạt tiêu chuẩn khơng cần phải ghép lại Việt Nam 3.1 Mắt ghép dùng ghép đỉnh sinh trưởng Việc ghép đỉnh