Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 1022:1992

Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 1022:1992 qui định các biện pháp phòng ngừa, phát hiện, kiểm tra tính vô khuẩn áp dụng cho các chế phẩm vắcxin-huyết thanh, sinh vật phẩm được coi là vô khuẩn khi sinh vật đo không có lẫn bất cứ loại sinh vật nào khác

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 1022 : 1992 SINH VẬT PHẨM - PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA TÍNH VƠ KHUẨN General requirements for the strelity of biological substances Lời nói đầu TCVN 1022 : 1992 thay TCVN 1022 : 1970; TCVN 1022 : 1992 Trung tâm Quốc gia Kiểm định Sinh vật phẩm biên soạn, Vụ Vệ sinh Môi trường (Bộ Y tế) đề nghị, Vụ Khoa học Đào tạo (Bộ Y tế) trình duyệt, Bộ Y tế ban hành; Tiêu chuẩn chuyển đổi năm 2008 từ Tiêu chuẩn Việt Nam số hiệu thành Tiêu chuẩn Quốc gia theo qui định khoản Điều 69 Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật điểm a khoản Điều Nghị định số 127/2007/NĐ-CP ngày 1/8/2007 Chính phủ quy định chi tiết thi hành số điều Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật SINH VẬT PHẨM - PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA TÍNH VƠ KHUẨN General requirements for the strelity of biological substances Tiêu chuẩn qui định biện pháp phòng ngừa, phát hiện, kiểm tra tính vơ khuẩn áp dụng cho chế phẩm vắcxin-huyết thanh, sinh vật phẩm coi vô khuẩn sinh vật đo khơng có lẫn loại sinh vật khác Tiêu chuẩn không đề cập đến vấn đề phát virut, mycoplasma sinh vật đơn bào nhiễm vào sinh vật phẩm Qui định chung 1.1 Để đề phòng lây nhiễm q trình sản xuất kiểm định, phải tuân thủ qui chế vô khuẩn 1.2 Kiểm tra vô khuẩn phải tiến hành phòng thiết kế đặc biệt phải có phòng trung gian 1.3 Người kiểm tra vô khuẩn phải cán đào tạo đặc biệt cho công việc này, có kiến thức đầy đủ lý thuyết thực hành 1.4 Kiểm tra vô khuẩn phép dùng nguyên liệu chai, bình… xử lý vơ khuẩn 1.5 Để kiểm tra tính vơ khuẩn sinh vật phẩm, môi trường dùng môi trường thioglycolat dạng nước, thành phần yêu cầu chất lượng ghi Phụ lục tiêu chuẩn Cách lấy mẫu số lượng lấy mẫu Theo TCVN 5666 : 1992 Tiến hành kiểm tra tính vơ khuẩn 3.1 Khi làm việc buồng vơ khuẩn phải đảm bảo vô khuẩn trang bị người, hạn chế đến mức tối thiểu chuyển động nói chuyện Trước đem ampun lọ vào buồng vô khuẩn phải kiểm tra độ chân không, độ kín Sau ampun, lọ phải khử khuẩn dung dịch ôxi già từ 2% đến 3% cồn 70 o Lấy mẫu ống hút vô khuẩn bóp Mỗi mẫu kiếm tra phải dùng riêng ống hút cấy sâu vào môi trường không bơm khí vào Những ống hút, ampun, lọ sau dùng phải ngâm vào dung dịch nước khử khuẩn, sau xử lý tiếp Trước cấy tiêu thể lỏng phải lắc kỹ, vi khuẩn lây nhiễm lắng xuống đáy Sinh phẩm khơ phải hòa tan nước hồi chỉnh kèm theo, theo dẫn ghi nhãn sau cấy lên mơi trường ni cấy Tính vơ khuẩn nước hồi chỉnh kiểm tra cách lấy ml vào hai ống thioglycolat 20 ml, ủ nhiệt độ từ 30 oC đến 36oC từ 20oC đến 25oC vòng 14 ngày với mẫu kiểm tra Phải kiểm tra tính vơ khuẩn nước hồi chỉnh trước sau làm Nếu hòa tan tiêu khô, phải sử dụng vài chai nước chai phải kiểm tra tương tự Trước tiến hành kiểm tra tính vơ khuẩn sinh phẩm, phải xác định chế phẩm có chứa chất có khả diệt khuẩn ức chế phát triển vi khuẩn không, có chứa chất bảo quản có tính chất Trong trường hợp phải có biện pháp thích hợp để làm tác dụng dùng lượng lớn mơi trường để pha lỗng lọc qua màng lọc 3.2 Kỹ thuật kiểm tra vô khuẩn 3.2.1 Kiểm tra vô khuẩn bán thành phẩm cuối phải cấy thành mẫu, mẫu khơng ml vào ống môi trường ủ nhiệt độ từ 30 oC đến 37oC từ 20oC đến 25oC 3.2.2 Kiểm tra vô khuẩn lô thành phẩm cấy ống hút khơng ml vào ống môi trường thioglycolat Một ống ủ nhiệt độ từ 30 oC đến 36oC để phát vi khuẩn hiếu khí kị khí, ống ủ nhiệt độ từ 20oC đến 25oC để phát nấm Đối với chế phẩm không làm đục môi trường nuôi cấy (glôbulin miễn dịch, dị nguyên gây bệnh không gây bệnh, kháng huyết thanh, dung dịch hồi chỉnh…) theo dõi vòng 14 ngày nhiệt độ nêu Đối với chế phẩm làm đục mơi trường ni cấy (những chế phẩm có chất hấp thụ, sinh khối, tế bào não…) tiến hành trên, khoảng ngày đến ngày, phải cấy chuyển ml sang ống thioglycolat khác Cả ống môi trường cấy lần đầu ống môi trường cấy chuyển phải ủ nhiệt độ từ 30oC đến 36oC từ 20oC đến 25oC, tổng số thời gian theo dõi 14 ngày Những ống cấy lần đầu phải giữ hết thời gian theo dõi kiểm tra vô khuẩn 3.2.3 Kiểm tra vô khuẩn để phát mycoplasma Đối với vắcxin virut sản xuất cách nuôi cấy virut tế bào nuôi mô động vật, phải kiểm tra có mặt mycoplasma dịch nuôi cấy tế bào, việc kiểm tra môi trường đặc biệt dùng cho chế phẩm riêng biệt Cơ quan Kiểm định Quốc gia qui định 3.2.4 Kiểm tra vô khuẩn để phát virut Việc kiểm tra có mặt virut ngoại lai chế phẩm phải tiến hành theo phương pháp đặc biệt loại chế phẩm riêng biệt theo qui định riêng Cơ quan Kiểm định Quốc gia 3.2.5 Kiểm tra vi sinh vật đặc biệt Việc kiểm tra bất hoạt hoàn toàn vi sinh vật vắcxin bất hoạt thử nghiệm bổ sung để kiểm tra có mặt vi sinh vật ngoại lai loại chế phẩm phải thực cách đặc biệt theo tiêu chuẩn riêng cho loại sinh phẩm Đọc kết cuối cách quan sát đại thể, trường hợp có nhiễm khuẩn phải kiểm tra vi thể tồn ni cấy 14 ngày theo dõi Đánh giá Bán thành phẩm cuối coi vơ khuẩn khơng có ống môi trường bị nhiễm Trường hợp bị nhiễm dù ống, phải kiểm tra lại mẫu lưu, kiểm tra số mẫu qui trình nêu Trường hợp bị nhiễm phải làm đồ phiến nhuộm gram soi kính hiển vi Nhuộm gram để phát vi khuẩn gram (-) hay (+) Nếu không bị nhiễm lần kiểm tra thứ hai chế phẩm coi vô khuẩn Khi bị nhiễm lần kiểm tra thứ hai dù ống nhiễm loại vi khuẩn lần thứ loạt sinh vật phẩm khơng đạt u cầu vơ khuẩn, phải hủy bỏ Nếu lần kiểm tra thứ thứ hai phát thấy loại vi khuẩn khác nhau, phải tiến hành lần kiểm tra thứ ba Ở lần kiểm tra thứ ba, không bị nhiễm, chế phẩm coi vô khuẩn Nếu trường hợp phát thấy bị nhiễm dù ống, không phụ thuộc vào loại vi khuẩn, chế phẩm coi không đạt yêu cầu vô khuẩn Lập hồ sơ lưu hồ sơ Phải ghi chép đầy đủ rõ ràng toàn bước tiến hành kiểm tra vô khuẩn bao gồm nhiệt độ thời gian ủ, tồn thơng số có liên quan đến mẫu kiểm tra lấy từ giai đoạn trình sản xuất loạt chế phẩm Mẫu ghi chép kiểm tra vơ khuẩn phải thống quan Kiểm định Quốc gia qui định Toàn ghi chép tay tiến hành kiểm tra phải lưu lại không loại trừ thông số Những số liệu phải lưu lại hết hạn sử dụng loạt chế phẩm phải sẵn sàng cung cấp đầy đủ cho quan Kiểm định Quốc gia cần tra Đối với thử nghiệm kiểm tra vơ khuẩn phải ghi lại tồn thơng số tên gọi, loạt số loại chế phẩm, số lượng mẫu lấy kiểm tra, số lượng môi trường, loại môi trường dùng để kiểm tra, nhiệt độ theo dõi, ngày thực hiện, ngày đọc kết quả, thời gian theo dõi kết luận, tên chức vụ người kiểm định Phụ lục Môi trường dùng để phát vi khuẩn hiếu khí, kị khí nấm Qui định chung 1.1 Môi trường nuôi cấy dùng để kiểm tra vô khuẩn phải quan Kiểm định Quốc gia qui định Môi trường phải đảm bảo phát triển tốt cho phần lớn loại vi sinh vật hiếu khí, kị khí thường có khơng khí sở sản xuất 1.2 Để kiểm tra tính vô khuẩn sinh phẩm phải dùng môi trường thioglycolat dạng nước Thành phần môi trường mô tả phần Mỗi loại môi trường thioglycolat điều chế phải kiểm tra tính vô khuẩn, khả làm cho vi sinh vật phẩm phát triển tính trung hòa 1.3 Để kiểm tra tính vơ khuẩn chế phẩm khơng có chất bảo quản merthiolat, dùng mơi trường thioglycolat pha vòng tuần kể từ ngày pha chế Môi trường sau sản xuất phải bảo quản nhiệt độ phòng (từ 20oC đến 30oC) tránh ánh sáng Để kiểm tra sinh phẩm có chứa merthiolat dùng môi trường thioglycolat pha từ ngày đến ngày, kể từ ngày sản xuất Thời hạn sử dụng cụ thể môi trường thioglycolat xác định cách kiểm tra tính trung hòa mơi trường sau ngày, ngày, ngày Thành phần cách pha chế môi trường thioglycolat lỏng a) L-cystin 0,50 g b) NaCl 2,50 g c) Đường glucoza (C6H12O6H20) 5,50 g d) Thạch (agar) 0,75 g e) Chiết suất men (tan nước) 5,00 g f) Casein thủy phân men tụy 15,00 g g) Nước cất 1000,00 ml h) Thioglycolat Na 0,50 g q) Resazurin Na (dung dịch 0,01% pha) 1,00 ml o r) pH cuối từ 7,0 đến 7,2 (sau sấy 121 C từ 18 đến 20 min) Cách pha chế Cho thành phần đầu vào cốc Khuấy l nước nóng, cho nốt phần nước lại, sau đun cách thủy cốc đựng mơi trường, ý L-cystin tan hoàn toàn Cho Thioglycolat Na, tiếp cho dung dịch NaOH N tính để sau sấy pH phải 7,0 đến 7,2 Đun nóng lại, khơng đun sơi, cần, lọc qua giấy lọc ướt, sau cho thêm rezazurin Phân chia vào ống nghiệm thích hợp tùy theo yêu cầu Sấy ướt 121 oC thời gian từ 18 đến 20 Khi lấy từ lò sấy ướt ra, làm lạnh vòi nước 25 oC Bảo quản nhiệt độ từ 20oC đến 30oC, tránh ánh sáng Nếu 1/3 phần ống môi trường đổi thành màu hồng, không nên dùng muốn dùng phải hấp nước lại lần Môi trường bảo quản tuần không dùng Yêu cầu chất lượng môi trường nuôi cấy Môi trường thioglycolat sau điều chế phải đạt u cầu sau: 3.1 Tính vơ khuẩn: Phải vơ khuẩn 3.2 Tính chất phát triển: Phải đảm bảo cho chủng Alcaligenes feacalis 415 phát triển chậm sau 48 h khơng thấp độ pha lỗng 1/10000000 chủng Clostridium novyi oedematien 198 không thấp độ pha 1/100000 3.3 Tính chất trung hòa: Phải đảm bảo cho chủng Alcaligenes feacalis 415 phát triển chậm vào ngày thứ mơi trường có merthiolat nồng độ 1:10000 không thấp độ pha 1/1000000 (xem Phụ lục 2) Phụ lục Phương pháp kiểm tra chất lượng mơi trường thioglycolat Kiểm tra tính vơ khuẩn Để kiểm tra tính vơ khuẩn loạt mơi trường thioglycolat, sau hấp khử trùng lấy % số ống ủ tủ ấm 37oC Đọc kết sau 48 h cách xem tất ống môi trường Trong trường hợp bị nhiễm khuẩn (đục), tồn loạt mơi trường phải bỏ Những ống môi trường ủ nhiệt độ 37oC không dùng để kiểm tra vô khuẩn sinh vật phẩm Kiểm tra tính tăng sinh Để kiểm tra tính chất mơi trường người ta dùng chủng gốc sau: - Hiếu khí: Alcaligigenes feacalis 415 - Kị khí: Clostridium novyi oedematiens 198 2.1 Các chủng gốc Alcaligenes feacalis 415: Nhận từ Viện Lister (Luân Đôn) vào năm 1946 Trực khuẩn gram (-), di động Hiếu khí tuyệt đối khơng gây hại cho người động vật Clostridium novyi oedematiens 198: phân lập vào năm 1930 Trực khuẩn loại to, gram (+), tạo nha bào Nha bào có hình bầu dục Kị khí tuyệt đối Không gây bệnh cho chuột lang chuột nhắt trắng Chủng kiểm tra Viện Kiểm định Quốc gia cấp phát theo yêu cầu có hộ chiếu kèm theo Không phép thay đổi chủng qui định để kiểm tra chất lượng môi trường 2.2 Giữ chủng chuẩn bị chủng kiểm tra để cấy vào môi trường thioglycolat 2.2.1 Alcaligenes feacalis 415 Mở ống chủng đông khô Alcaligenes feacalis 415, dùng ống hút vô khuẩn cho thêm (khoảng 0,5 ml) canh thang hottzinger, hút trộn thật có hỗn dịch đồng chuyển sang ống canh thang hottozinger ống thạch nghiêng hottozinger ủ nuôi cấy thời gian từ 20 h đến 24 h 37oC Sau 48 h đọc kết 2.2.2 Clostridium novyi oedematiens 198 Mở ống chủng đông khô, dùng ống hút vô khuẩn cho thêm (khoảng ml) môi trường Taroshi (đã đun cách thủy lại trước dùng), trộn cẩn thận chuyển sang ống loại môi trường (chủng chuyển sáng phải cấy tận đáy ống môi trường) Nuôi cấy đem ủ nhiệt độ 37 oC, 48 h Chủng nhận ống đem chuyển sang chai vơ khuẩn có dung tích từ 20 ml đến 30 ml (không hút miếng thịt băm) ly tâm 3000 r/min 20 Sau dùng pipet hút bỏ nước cho thêm vào sinh khối thu dung dịch nước pha lỗng trộn chuyển sang ống nghiệm để đo độ đục tương ứng với 10 đơn vị Sau đo độ đục, lấy từ 10 ống đến 15 ống môi trường dinh dưỡng đem đun sơi để đuổi khơng khí, cấy vào ống ml để có chủng dạng nha bào (Để kiểm tra độ chủng tất ống cấy chuyển nên cấy kiểm tra thạch nghiêng hottzinger) sau ủ ni cấy 48 h 37oC, dùng pipet trộn ống môi trường cấy chủng làm tiêu (nhuộm dung dịch 1% tím gentian 30 s), soi kính xác định số lượng nha bào (M) tính % theo cơng thức: M = (n / N) x 100% đó: n - số nha bào có đến kính trường; N - tổng số (khơng 100) tế bào (trực khuẩn nha bào) đến kính trường Đậy nút cao su lên ống mơi trường cấy chủng có % nha bào bảo quản nhiệt độ từ 4oC đến 8oC Trong trường hợp cần thiết (kiểm tra thường kỳ) cần phải có số lượng lớn ống chủng, phải giữ số lượng lớn ống chủng cấy chuyển dạng nha bào sang môi trường Taroshi (từ ống đến ống) ủ nhiệt độ 37oC 48 h sau tiến hành tạo nha bào phương pháp nêu Để có chủng làm việc Clostridium novyi 198, dùng pipet trộn đền chủng dạng nha bào giữ môi trường thạch mềm cấy vào ống đến ống 10 ml môi trường Taroshi, ống ml Mỗi chủng dạng nha bào Clostridium novyi 198 dùng cấy chuyển Nuôi cấy ủ từ 24 h đến 48 h 37oC có canh trùng rõ rệt dạng làm đục môi trường khuếch tán với vùng suốt riêng biệt Sau tiến hành cấy chuyển lần chủng kiểm tra sang ống đến ống loại môi trường, ủ từ 17 h đến 18 h 37 oC Đối với trường hợp kiểm tra gấp dùng chủng Clostridium novyi 198, từ 24 h đến 28 h, nhận sau cấy chuyển từ ống chủng đông khô ra, cấy chuyển sang đến ống môi trường Taroshi ủ từ 17 h đến 19 h 37oC chủng nhận dùng trực tiếp để kiểm tra môi trường thioglycolat Chủng làm việc cấy môi trường Taroshi (2 cấy chuyển) đem ly tâm đo độ đục Từ hỗn dịch thu hút ml vào ống ml dung dịch pha loãng (độ pha loãng 10-1) cho pipet sâu vào dung dịch Cứ pha loãng bậc 10 đến độ pha loãng thứ (1/1000000) Dùng ba độ pha cuối (1/10000; 1/100000; 1/1000000) để cấy lên môi trường thử nghiệm Từ độ pha trên, độ pha loãng cuối cấy vào ống 10 ml môi trường thioglycolat (cấy sâu pipet vào môi trường) ống 0,5 ml môi trường Ủ nhiệt độ 37 oC Sau 48 h đọc kết CHÚ THÍCH: Sau mở ống đơng khơ phải kiểm tra lại đặc tính chủng phủ hợp với hộ chiếu kèm theo Nếu trường hợp mơi trường thạch nghiêng khơng thấy mọc cấy từ canh thang hottzinger sang thạch nghiêng hottzinger khác 2.3 Kiểm tra tính chất trung hòa Để xác định tính chất mơi trường thioglycolat, người ta dùng chủng kiểm tra Alcaligenes Feacalis 415, đặc điểm, cách bảo quản chuẩn bị chủng để cấy vào môi trường thioglycolat mô tả phần (phần 2.2) Dung dịch muối sinh lý vô trùng 0,85 % phân chia vào ống nghiệm, ống thứ ml nước muối sinh lý ml merthiolat, dung dịch merthiolat nồng độ 1/1000, ống khác ml nước muối sinh lý ml dung dịch merthiolat Trộn ống, sau hút bỏ ml từ ống ống lại ml Để tiến hành pha loãng kiểm tra Alcaligenes Feacalis 415 với nồng độ merthiolat cần thiết, dùng chủng pha lỗng 1/100000 có theo phương pháp mơ tả (xem phần xác định tính tăng sinh) Từ độ pha loãng (1/10000) lấy ml chủng cho vào ống thứ nhất, ống có merthiolat Trộn hỗn dịch ta có độ pha loãng chủng 1/100000 với nồng độ merthiolat 1/10000 Từ độ pha loãng này, hút ml sang ống thứ có nước muối sinh lý merthiolat, ta có độ pha loãng 1/10000000 với nồng độ merthiolat (1/10000) Tương tự, ta có độ pha loãng 1/100000000 (cũng với nồng độ merthiolat 1/10000) Để đánh giá khả trung hòa merthiolat mơi trường thioglycolat người ta dùng độ pha (10-6, 10-7, 10-8) có merthiolat Từ độ pha, độ pha cuối cấy vào ống môi trường thioglycolat 10 ml (cấy sâu pipet vào môi trường) ống 0,5 ml đem ủ nhiệt độ 37 oC Đọc kết sau từ ngày đến ngày 2.4 Cách đọc kết Khi thời gian ủ nuôi cấy kết thúc, tiến hành xem xét ống môi trường cấy chủng Kết kiểm tra ghi vào sổ theo dõi riêng trả lời kết chất lượng môi trường thioglycolat Môi trường coi tốt tính tăng sinh chậm 48 h ủ nuôi cấy chủng kiểm tra a Alcaligenes feacalis 415, phát triển độ pha 1/10000000 Nếu độ pha 1/10000000 khơng có chủng phát triển, độ pha 1/100000000 có chủng phát triển kết coi dương tính (vi khuẩn phát triển làm đục phần cột môi trường) b Clostridium novyi 198 độ pha 1/100000 Nếu độ pha 1/100000 khơng có chủng phát triển, độ pha 1/1000000 có vi khuẩn phát triển kết coi dương tính (vi khuẩn sau 24 h dạng khuẩn lạc hình cầu riêng biệt, sau 48 h làm đục mơi trường lan tỏa có vùng suốt rõ rệt phàn cột môi trường) Môi trường thioglycolat coi tốt tính chất trung hòa chậm ngày ủ ni cấy, phải nhìn thấy rõ chủng Alcaligenes feacalis 415 phát triển môi trường Những loại môi trường thioglycolat khơng đạt tính chất trung hòa đạt tính tăng sinh dùng để kiểm tra vô khuẩn sinh vật phẩm không chứa merthiolat  ... gồm nhiệt độ thời gian ủ, toàn thơng số có liên quan đến mẫu kiểm tra lấy từ giai đoạn trình sản xuất loạt chế phẩm Mẫu ghi chép kiểm tra vô khuẩn phải thống quan Kiểm định Quốc gia qui định Toàn... Chủng kiểm tra Viện Kiểm định Quốc gia cấp phát theo yêu cầu có hộ chiếu kèm theo Không phép thay đổi chủng qui định để kiểm tra chất lượng môi trường 2.2 Giữ chủng chuẩn bị chủng kiểm tra để cấy... hành theo phương pháp đặc biệt loại chế phẩm riêng biệt theo qui định riêng Cơ quan Kiểm định Quốc gia 3.2.5 Kiểm tra vi sinh vật đặc biệt Việc kiểm tra bất hoạt hoàn toàn vi sinh vật vắcxin bất