(Luận văn thạc sĩ) Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây đông hầu vàng (Turnera Ulmifolia)

Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây đông hầu vàng (Turnera Ulmifolia)Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây đông hầu vàng (Turnera Ulmifolia)Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây đông hầu vàng (Turnera Ulmifolia)Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây đông hầu vàng (Turnera Ulmifolia)Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây đông hầu vàng (Turnera Ulmifolia)Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây đông hầu vàng (Turnera Ulmifolia)Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây đông hầu vàng (Turnera Ulmifolia)Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây đông hầu vàng (Turnera Ulmifolia)Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây đông hầu vàng (Turnera Ulmifolia)Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây đông hầu vàng (Turnera Ulmifolia)Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây đông hầu vàng (Turnera Ulmifolia)Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây đông hầu vàng (Turnera Ulmifolia)Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây đông hầu vàng (Turnera Ulmifolia)Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây đông hầu vàng (Turnera Ulmifolia)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHAN THỊ THÚY XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY ĐÔNG HẦU VÀNG (TURNERA ULMIFOLIA) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN, NĂM 2018 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHAN THỊ THÚY XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY ĐƠNG HẦU VÀNG (TURNERA ULMIFOLIA) Ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Cán hướng dẫn khoa học: TS PHẠM THỊ THANH NHÀN THÁI NGUYÊN, NĂM 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn: “Xây dựng quy trình nhân giống in vitro Đơng hầu vàng (Turnera ulmifolia)” cơng trình nghiên cứu riêng Mọi kết thu trung thực, không chép từ kết nghiên cứu khác Tất tham khảo kế thừa trích dẫn đầy đủ Thái Nguyên, tháng 11 năm 2018 Tác giả luận văn Phan Thị Thúy iii LỜI CẢM ƠN Trong trình thực luận văn, nhận quan tâm giúp đỡ tận tình nhiều cá nhân, quan đơn vị Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Thị Thanh Nhàn, người tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện, giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tôi xin cảm ơn thầy giáo, cô giáo thuộc khoa Sinh học, phận Sau đại học Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên nhiệt tình giảng dạy tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa học Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Trần Thị Hồng, cán phòng thí nghiệm Cơng nghệ tế bào, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên giúp đỡ tạo điều kiện cho tiến hành luận văn Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới người thân gia đình, đồng nghiệp bạn bè tạo điều kiện, giúp đỡ động viên suốt thời gian học tập Thái Nguyên, tháng 11 năm 2018 Tác giả luận văn Phan Thị Thúy iv MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN .iii LỜI CẢM ƠN iv MỤC LỤC v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung Đông hầu vàng 1.1.1 Đặc điểm phân loại đặc điểm sinh học 1.1.2 Giá trị Đông hầu vàng 1.1.3 Tình hình nghiên cứu Đông hầu vàng giới Việt Nam 1.2 Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật ứng dụng 1.2.1 Cơ sở lý luận phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro 1.2.3 Các phương pháp nhân giống vơ tính in vitro 12 1.3 Thành tựu nhân giống in vitro 15 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Vật liệu, hóa chất, thiết bị địa điểm nghiên cứu 17 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 17 2.1.2 Hóa chất nghiên cứu 17 2.1.3 Thiết bị nghiên cứu 17 2.1.4 Địa điểm nghiên cứu 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1 Phương pháp pha môi trường 17 v 2.2.2 Phương pháp nuôi cấy in vitro 17 2.2.3 Phương pháp thu thập xử lý số liệu 22 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 3.1 Nghiên cứu công thức vô trùng mẫu 23 3.2 Nghiên cứu mơi trường kích thích hạt Đơng hầu vàng nảy mầm 24 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng chất phụ gia đến sinh trưởng Đông hầu vàng 25 3.4 Nghiên cứu tạo đa chồi Đông hầu vàng 28 3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến khả phát sinh chồi Đông hầu vàng 28 3.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng kinetin đến khả phát sinh chồi Đông hầu vàng 30 3.4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp BAP NAA đến khả phát sinh chồi Đông hầu vàng 32 3.4.4 Nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp BAP IBA đến khả phát sinh chồi Đông hầu vàng 34 3.4.5 Nghiên cứu ảnh hưởng 2,4- D đến khả phát sinh chồi Đông hầu vàng 36 3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng nhóm auxin đến khả tạo rễ Đông hầu vàng 39 3.5.1 Nghiên cứu ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ Đông hầu vàng 39 3.5.2 Nghiên cứu ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ Đông hầu vàng 40 3.6 Nghiên cứu giá thể thích hợp đưa Đơng hầu vàng tự nhiên 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt MS Murashige and Skoog Môi trường MS KT Khử trùng CT Công thức BAP 6- Benzylamino purine Kinetin 6- Fururolamino purine GA3 Gibberellic acid NAA α- Naphthaleneacetic acid IBA 3- Indolebutyric acid 2,4- D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid NXB Nhà xuất cs Cộng iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Công thức khử trùng hạt Đông hầu vàng 18 Bảng 2.2 Công thức giá thể Đông hầu vàng 22 Bảng 3.1 Kết khử trùng hạt Đông hầu vàng 23 Bảng 3.2 Tỷ lệ nảy mầm hạt Đông hầu vàng môi trường 25 Bảng 3.3 Ảnh hưởng chất phụ gia đến sinh trưởng Đông hầu vàng 26 Bảng 3.4 Ảnh hưởng BAP đến khả phát sinh chồi Đông hầu vàng 29 Bảng 3.5 Ảnh hưởng kinetin đến khả tạo đa chồi Đông hầu vàng 31 Bảng 3.6 Ảnh hưởng tổ hợp BAP NAA đến khả phát sinh chồi Đông hầu vàng 33 Bảng 3.7 Ảnh hưởng tổ hợp BAP IBA đến khả phát sinh chồi Đông hầu vàng 35 Bảng 3.8 Ảnh hưởng 2,4- D đến khả tạo mô sẹo Đông hầu vàng 37 Bảng 3.9 Ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi từ mô sẹo Đông hầu vàng 38 Bảng 3.10 Ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ Đông hầu vàng 40 Bảng 3.11 Ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ Đông hầu vàng 41 Bảng 3.12 Ảnh hưởng giá thể đến trồng bầu sau tuần 43 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cây Đơng hầu vàng Hình 1.2 Hoa hạt Đơng hầu vàng Hình 3.1 Hạt Đông hầu vàng sau khử trùng 24 Hình 3.2 Ảnh hưởng nước dừa 100 ml/l than hoạt tính 1,5 g/l đến sinh trưởng Đông hầu vàng 27 Hình 3.3 Hình ảnh Đông hầu vàng môi trường CT2 sau tuần 30 Hình 3.4 Hình ảnh Đơng hầu vàng mơi trường CT3 30 Hình 3.5 Hình ảnh Đơng hầu vàng mơi trường CT2 34 Hình 3.6 Hình ảnh mơ sẹo chồi tái sinh từ mô sẹo sau tuần 38 Hình 3.7 Kết tạo rễ Đông hầu vàng môi trường CT3 42 Hình 3.8 Cây Đơng hầu vàng sau lấy khỏi bình 43 Hình 3.9 Cây Đông hầu vàng in vitro vườn ươm 43 Hình 3.10 Sơ đồ quy trình ni cấy in vitro Đơng hầu vàng 44 vi MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Dược liệu có vai trò quan trọng đời sống người Từ xưa, ông cha ta biết sử dụng, chế biến dược liệu để chăm sóc bảo vệ sức khỏe Ngày nay, nhu cầu sử dụng dược liệu người dân ngày gia tăng tác dụng phụ phù hợp với quy luật sinh lý thể Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), khoảng 80% dân số giới dựa vào thuốc có nguồn gốc tự nhiên chăm sóc sức khỏe cộng đồng [43] Theo số liệu thống kê ngành Y tế, năm Việt Nam tiêu thụ từ 30-50 loại dược liệu khác để sử dụng y học cổ truyền làm nguyên liệu cho công nghiệp Dược xuất Trong đó, 2/3 khối lượng khai thác từ nguồn thuốc mọc tự nhiên trồng trọt nước Riêng từ nguồn thuốc tự nhiên cung cấp tới 20.000 năm [1] Do khơng có sách quản lí chặt chẽ nên nhiều loài dược liệu tự nhiên bị khai thác ạt, không ý tới bảo vệ, tái sinh làm cho nguồn tài nguyên dược liệu giảm sút nghiêm trọng, nhiều loài đứng trước nguy tuyệt chủng Yêu cầu đặt cần phải bảo tồn nguồn gen, nhân nhanh loài dược liệu quý tìm lồi dược liệu thay Hiện nay, nhu cầu làm đẹp phái nữ ngày gia tăng mạnh mẽ Tuy nhiên, mỹ phẩm tổng hợp pha chế bán thị trường thường gây hại cho da sau thời gian sử dụng Vì vậy, cơng ty dược- mỹ phẩm phải tìm đến hợp chất chiết xuất từ cỏ tự nhiên Ở Việt Nam có nhiều thuốc quý sử dụng để cải thiện sắc đẹp như: trinh nữ hoàng cung, ngưu tất, hà thủ ô, rau sam, diệp hạ châu, bỏng, dâu tằm, trầu không,…[47] Cây Đông hầu vàng (Turnera ulmifolia) lồi có nhiều cơng dụng thể, đặc biệt có tác dụng làm đẹp cho phụ nữ làm trắng da, kéo dài tuổi xuân Tuy nhiên, nước ta nay, chọn đem cắt thành mảnh nhỏ cấy chuyển sang môi trường để tiếp tục nghiên cứu tái sinh chồi 3.4.5.2 Nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi từ mô sẹo Đông hầu vàng Mô sẹo tạo từ môi trường bổ sung 2,4- D 2,0 mg/l chọn tái sinh môi trường bổ sung BAP với nồng độ khác (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 2,5 mg/l) Sau tuần nuôi cấy kết thu thể qua bảng 3.9 hình 3.6 Bảng 3.9 Ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi từ mô sẹo Đông hầu vàng Nồng độ BAP (mg/l) 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 Số chồi/ mẫu 0,65 ± 0,10 1,32 ± 0,11 1,81 ± 0,10 3,03 ± 0,22 1,97 ± 0,19 Chất lượng chồi Chồi yếu Chồi nhỏ, xoăn, mọng nước Chồi nhỏ, xanh nhạt Chồi to, khỏe, xanh đậm Chồi to, khỏe, xanh đậm Kết cho thấy mơi trường có bổ sung BAP 0,5 mg/l 1,0 mg/l có khả tái sinh chồi thấp (0,65 1,32 chồi/mẫu), chất lượng chồi không đáp ứng, chồi yếu Ở nồng độ cao BAP cao hơn, khả tái sinh cao hơn, phát triển mạnh, xuất rễ bất định (đặc biệt nồng độ BAP 2,0 mg/l cho 3,03 chồi/mẫu) Do đó, môi trường MS bổ sung sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l BAP 2,0 mg/l môi trường thích hợp cho việc tái sinh chồi từ mơ sẹo Đơng hầu vàng Hình 3.6 Hình ảnh mô sẹo chồi tái sinh từ mô sẹo sau tuần 38 3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng nhóm auxin đến khả tạo rễ Đông hầu vàng Ra rễ khâu cuối giai đoạn nghiên cứu in vitro Chất kích thích sinh trưởng dùng chủ yếu giai đoạn thuộc nhóm auxin IBA NAA chất kích thích chủ yếu tác động lên trình phân chia tế bào hình thành rễ NAA chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin, có tác dụng làm tăng hơ hấp tế bào mơ ni cấy, tăng hoạt tính enzyme ảnh hưởng mạnh đến trao đổi nitơ, tăng khả tiếp nhận sử dụng đường môi trường ni cấy NAA có tác dụng tạo rễ mạnh auxin khác 3.5.1 Nghiên cứu ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ Đông hầu vàng Các chồi đỉnh Đông hầu vàng nuôi cấy mơi trường có chứa NAA nồng độ khác để nghiên cứu ảnh hưởng NAA đến hình thành rễ Trong thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng NAA đến hình thành rễ Đông hầu vàng công thức môi trường với nồng độ NAA tương ứng 0,2; 0,4; 0,6 0,8 mg/l Cây môi trường tạo đa chồi sử dụng để cắt lấy chồi, chồi cao khoảng 2-3cm, cắt bỏ bớt lá, cấy vào môi trường tạo rễ Mỗi công thức môi trường cấy 30 chồi Theo dõi hình thành rễ chồi sau tuần Kết theo dõi thể bảng 3.10 Kết bảng 3.10 cho thấy, chồi Đơng hầu vàng tạo rễ tất môi trường Tuy nhiên môi trường, tỷ lệ chồi rễ, số rễ/mẫu chất lượng rễ chồi khác Trong mơi trường đối chứng khơng có chất kích thích sinh trưởng, tỷ lệ chồi rễ thấp, rễ mảnh ngắn Trong mơi trường có chất kích thích sinh trưởng, tỷ lệ chồi rễ nhiều rễ dài môi trường đối chứng Sau tuần, môi trường CT1, CT2 CT4, tỷ lệ chồi rễ thấp, tương ứng 28,89; 33,33 35,00% Mơi trường CT3 mơi trường có tỷ lệ chồi rễ cao (42,86%), số lượng rễ nhiều, rễ dài Sau tuần, môi trường CT3 môi trường cho tỷ lệ chồi rễ cao 39 (75,00%), rễ dài nhiều, phát triển tốt, thân mập, xanh to Môi trường CT4 (NAA 1,0 mg/l) cho tỷ lệ rễ thấp nồng độ chất kích thích sinh trưởng cao gây ức chế trình phát sinh rễ Vì thí nghiệm này, nồng độ NAA 0,6 mg/l thích hợp để tạo rễ Tuy nhiên, khả kích thích rễ chồi Đông hầu vàng NAA chưa cao Bảng 3.10 Ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ Đông hầu vàng Công Nồng độ NAA Tỷ lệ chồi thức (mg/l) rễ (%) Số rễ/mẫu Chất lượng rễ Sau tuần ĐC 28,89 0,10 ± 0,04 + CT1 0,2 33,33 1,21 ± 0,29 ++ CT2 0,4 32,14 1,46 ± 0,33 ++ CT3 0,6 42,86 1,36 ± 0,31 +++ CT4 0,8 35,00 1,11 ± 0,31 ++ Sau tuần ĐC 44,45 0,32 ± 0,12 + CT1 0,2 50,00 1,36 ± 0,32 ++ CT2 0,4 64,23 1,64 ± 0,41 +++ CT3 0,6 75,00 1,39 ± 0,24 +++ CT4 0,8 50,00 1,79 ± 0,35 +++ (Ghi chú: +: Rễ mảnh, ngắn; ++: Rễ mảnh, dài; +++: Rễ mảnh, dài, nhiều) 3.5.2 Nghiên cứu ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ Đông hầu vàng Cũng thí nghiệm trên, thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng IBA đến khả hình thành rễ Đông hầu vàng tiến hành với nồng độ khác nhau, kết thu sau nuôi cấy tuần thể bảng 3.11, hình 3.7 40 Bảng 3.11 Ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ Đông hầu vàng Công thức Nồng độ Tỷ lệ chồi IBA (mg/l) rễ (%) Số rễ/ mẫu Chất lượng rễ Sau tuần ĐC 28,89 0,10 ± 0,04 + CT1 0,2 45,50 0,43 ± 0,15 + CT2 0,4 50,50 0,82 ± 0,30 + CT3 0,6 60,71 0,86 ± 0,26 + CT4 0,8 46,43 0,64 ± 0,26 + Sau tuần ĐC 44,45 0,32 ± 0,12 + CT1 0,2 50,00 1,11 ± 0,25 + CT2 0,4 53,57 1,62 ± 0,38 +++ CT3 0,6 75,00 1,89 ± 0,34 +++ CT4 0,8 67,86 1,29 ± 0,32 +++ (Ghi chú: +: Rễ mảnh, ngắn; ++: Rễ mảnh, dài; +++: Rễ mảnh, dài nhiều) Từ kết trình bày bảng 3.11 cho thấy, tất mơi trường hình thành rễ, nhiên khả hình thành rễ chồi Đơng hầu vàng khác môi trường khác Các mơi trường có chất kích thích sinh trưởng IBA cho tỷ lệ chồi rễ cao nhiều so với mơi trường đối chứng (mơi trường khơng có chất kích thích sinh trưởng IBA) Trong cơng thức mơi trường có chất kích thích sinh trưởng mơi trường CT3 (mơi trường có IBA 0,6 mg/l) mơi trường cho tỷ lệ chồi rễ cao (sau tuần đạt 75,00%) Mơi trường CT4 có nồng độ IBA 1,0 mg/l cao mơi trường CT3 có nồng độ IBA 0,6 mg/l tỷ lệ chồi rễ thấp Kết cho thấy, nồng độ IBA cao gây ức chế khả hình thành rễ Đơng hầu vàng Vì vậy, thí nghiệm này, cơng thức mơi trường CT3 mơi trường chứa IBA thích hợp cho tạo rễ Đơng hầu vàng 41 Hình 3.7 Kết tạo rễ Đông hầu vàng môi trường CT3 Từ kết nghiên cứu ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin (NAA, IBA) cho thấy, mơi trường có NAA 0,6 mg/l mơi trường có IBA 0,6 mg/l cho tỷ lệ chồi rễ cao 75,00%, môi trường có IBA 0,6 mg/l cho số lượng rễ/mẫu trung bình (1,89 rễ/mẫu sau tuần) cao mơi trường có NAA 0,6 mg/l (1,39 rễ/mẫu sau tuần) Do vậy, mơi trường thích hợp cho tạo rễ Đông hầu vàng MS bổ sung sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l + IBA 0,6 mg/l Các tạo thành sau cấy môi trường tạo rễ chọn lọc để đưa ngồi mơi trường Chọn có đủ rễ (≥ rễ), đủ (≥ lá), đủ chiều cao (≥ 7cm), mập khỏe để đưa môi trường bên ngồi 3.6 Nghiên cứu giá thể thích hợp đưa Đơng hầu vàng ngồi tự nhiên Lựa chọn giá thể thích hợp để đưa ngồi vườn ươm khâu quan trọng trình nhân giống vơ tính Cây in vitro ni điều kiện ổn định nguồn dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ Khi chuyển ngồi mơi trường tự nhiên hoàn toàn khác nên dễ bị chết nước, nhiệt độ cao Vì phải thích nghi dần với điều kiện ngồi tự nhiên Trước đem trồng vườn ươm, đưa khỏi phòng cây, đặt điều kiện nhiệt độ phòng bình thường, bỏ nắp giấy nút bơng, để khoảng 24h Sau lấy khỏi bình, đem trồng giá thể nghiên cứu Trong thời gian thích nghi với điều kiện môi trường (tối thiểu khoảng 2-3 tuần), cần chăm sóc bảo vệ cẩn thận Cây sau đưa khỏi bình (Hình 3.8) trồng vào loại giá thể Các bầu cho vào khay, đặt nơi ánh sáng khuếch tán, 42 thoáng mát, tưới đủ ẩm ngày để dần thích nghi với điều kiện bên Tỷ lệ sống sau tuần loại giá thể khác thu bảng 3.12 hình 3.9 Bảng 3.12 Ảnh hưởng giá thể đến trồng bầu sau tuần Công thức ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 Số trồng 30 30 30 30 30 Số sống 24 17 25 15 27 Tỷ lệ sống (%) 80,00 56,67 83,33 50,00 90,00 Chiều cao (cm) 6,06 ± 0,60 4,01 ± 0,66 6,25 ± 0,53 6,10 ± 1,15 9,19 ± 0,65 Kết bảng 3.12 cho thấy, giá thể đất thịt trung bình: phân vi sinh có tỷ lệ sống thấp (50,00%), non yếu mà lại trồng giá thể có lượng phân vi sinh lớn nên khơng thích nghi Kết có 15 sống tổng số 30 trồng Hình 3.8 Cây Đơng hầu vàng sau lấy khỏi bình ĐC CT2 CT5 Hình 3.9 Cây Đông hầu vàng in vitro vườn ươm 43 Đối với giá thể cát, tỷ lệ sống thấp (56,67%) non trồng giá thể không tơi xốp, tưới nước, cát nén chặt xuống làm phát triển khơng thích nghi với loại giá thể Đối với giá thể đất thịt trung bình đất thịt trung bình: cát, tỷ lệ sống đạt 80,00; 83,33% Tỷ lệ tương đối cao khơng phải giá thể thích hợp để trồng số khơng thích nghi bị chết phát triển chậm Trên giá thể đất thịt trung bình: cát: phân vi sinh, tỷ lệ sống cao (đạt 90,00%), mập, khỏe, to, xanh thẫm, dày bản, chiều cao trung bình đạt 9,19cm Như vậy, phạm vi thí nghiệm này, giá thể phù hợp giai đoạn luyện vườn ươm giá thể gồm đất thịt trung bình: cát: phân vi sinh theo tỷ lệ 2:1:1 Như vậy, dựa kết nghiên cứu ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng chất phụ gia đến sinh trưởng, phát triển in vitro, quy trình ni cấy in vitro Đông hầu vàng phù hợp là: Khử trùng hạt Đơng hầu vàng khí Clo Gieo hạt Đông hầu vàng môi trường MS + sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l + BAP 0,5 mg/l để hạt nảy mầm Tạo đa chồi Đông hầu vàng môi trường MS + sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l + BAP 1,0 mg/l + IBA 0,3 mg/l Tạo rễ Đông hầu vàng môi trường MS + sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l + IBA 0,6 g/l Đưa vườn ươm giá thể có thành phần: Đất thịt trung bình: Cát: Phân vi sinh theo tỷ lệ 2:1:1 Hình 3.10 Sơ đồ quy trình ni cấy in vitro Đông hầu vàng 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Quy trình ni cấy in vitro Đông hầu vàng nghiệm thu là: 1.1 Cơng thức khử trùng hạt Đơng hầu vàng thích hợp khử trùng khí Clo Tỷ lệ hạt không nhiễm 100% 1.2 Công thức mơi trường kích thích hạt Đơng hầu vàng nảy mầm ống nghiệm thích hợp mơi trường MS + sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l + BAP 0,5 mg/l Tỷ lệ hạt nảy mầm 75,56% 1.3 Công thức môi trường tạo đa chồi Đông hầu vàng thích hợp mơi trường MS + sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l + BAP 1,0 mg/l + IBA 0,3 mg/l Sau tuần, số chồi/mẫu 2,43, chất lượng chồi tốt (chồi mập, khỏe) 1.4 Công thức môi trường tạo rễ Đơng hầu vàng hồn chỉnh mơi trường MS + sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l + IBA 0,6 g/l Sau tuần, số rễ/mẫu 1,89, chất lượng rễ tốt (rễ dài, nhiều) 1.5 Công thức giá thể phù hợp để đưa Đông hầu vàng vườn ươm đất thịt trung bình: cát: phân vi sinh theo tỷ lệ 2:1:1 Tỷ lệ sống sót 90%, sau tuần thu cao 9,19 cm Kiến nghị Tiếp tục theo dõi sinh trưởng phát triển Đông hầu vàng đến giai đoạn hoa, thu So sánh phân tích hàm lượng dược chất tự nhiên in vitro 45 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Phan Thi Thuy, Pham Thi Thanh Nhan (2018), “Study on sterilizing plant materials and effects of cytokinin and 2,4- D on shoot formation of “Yellow alder” (Turnera ulmifolia)”, The 5th Academic Conference on Natural Science for Young Scientists, Master and PhD Students from Asean Countries, 177-183 Phan Thị Thúy, Phạm Thị Thanh Nhàn (2018), “Nghiên cứu ảnh hưởng chất phụ gia tổ hợp kích thích sinh trưởng đến sinh trưởng Đông hầu vàng (Turnera ulmifolia L.) in vitro”, Tạp chí Khoa học Công nghệ, 184(08): 65-70 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Y tế Bộ Khoa học & công nghệ (2009), Báo cáo Hội nghị tổng kết 20 năm thực nhiệm vụ “Bảo tồn nguồn gen giống thuốc (1998 2008)”, 189 trang Danh lục loài thực vật Việt Nam, tập II, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Nguyễn Thanh Danh, Lê Xuân Đắc, Lê Thị Xuân (2005), “Kết bước đầu nhân giống in vitro Vù hương (Cinamomum balansae Lecomte.) kỹ thuật ni cấy phơi hạt xanh góp phần bảo tồn đa dạng sinh học”, Những vấn đề nghiên cứu Khoa học Sự sống, báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc 2005, NXB Khoa học Kỹ thuật: 450-453 Lê Xuân Đắc, Hà Hồng Hải, Đào Thị Thu Hà, Nguyễn Thanh Danh, Lê Thị Xuân, Nơng Văn Hải, Lê Trần Bình (2004), “Nhân nhanh bảo tồn Màng tang (Litsea verticillata) tìm thấy vường quốc gia Cúc Phương kĩ thuật nuôi cấy mơ tế bào thực vật”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học – Journal of Biotechnology, 2(4): 479-486 Lê Văn Hồng (2007), Cơng nghệ ni cấy mơ tế bào thực vật, NXB Khoa học kĩ thuật Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Quyển I, NXB Trẻ, TP Hồ Chí Minh Nguyễn Như Khanh, Nguyễn Văn Đính (2011), Giáo trình chất điều hòa sinh trưởng thực vật, NXB Giáo dục Việt Nam Nguyễn Thị Nhật Linh, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Thị Kim Yến, Lê Kim Cương, Nguyễn Phúc Huy, Dương Tấn Nhựt (2012), “Ảnh hưởng than hoạt tính lên khả định hướng rễ Hồng môn Cúc nuôi cấy in vitro”, Tạp chí Sinh học, 34(3): 377-388 Chu Văn Mẫn (2000), Ứng dụng tin học sinh học, NXB Đại học quốc gia Hà Nội 47 10 Lê Ánh Nguyệt, Điêu Thị Mai Hoa, Trần Thị Thanh Huyền Lê Xuân Đắc (2010), “Ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân nhanh bảo tồn Mắt châu (Micromelum hisutum Oliv.) vườn quốc gia Cúc Phương”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 26(2): 180-186 11 Lưu Trường Sinh, Hoàng Văn Lương (2005), “Nghiên cứu hồn thiện qui trình nhân giống Trinh nữ hồng cung phương pháp in vitro”, Những vấn đề nghiên cứu Khoa học Sự sống, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc 2005, NXB Khoa học Kỹ thuật, 722-724 12 Nguyễn Thị Tâm, Vũ Thị Thu Thủy (2016), Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng, NXB Đại học Thái Nguyên 13 Lê Thị Xn, Schemluck M, Mai Văn Trì (1996), “Cây Thơng đỏ Lâm Đồng (Taxus walli chiana) nguồn nguyên liệu quí để sản xuất thuốc chữa ung thư nhóm Taxoid”, Tạp chí hóa học, 34(1): 80-81 Tiếng Anh 14 Adhikarimayum H, Kshetrimayum G, Huidrom S, Maibam D (2011), “In vitro propagation of Citrus megaloxycarpa”, Environmental and Experimental Biology, (9): 129-132 15 Balaraju K, Agastian P, Preetamraj JP, Arokiyaraj S, “Ignacimuthu S (2008), “Micropropagation of Vitex agnus catus (Verbenaceae) A valuable medicinal phant”, In vitro Cellular and Developmental Biology Plant, 44(5): 436-441 16 Barrett SCH (1978), “Heterostyly in a tropical weed: the reproductive biology of the Turnera ulmifolia complex (Turneraceae)”, Canadian Journal of Botany, 56(15): 1713-1725 17 Bedir E, Lata H, “Schaneberg B, Khan IA, Morase RM (2003), “Micropropagation of Hydrastis canadensis: Goldenseal a North American endangered species”, Planta Med: 86-88 48 18 Benitez-Vieyra S, Ordano M, Fornoni J, Boege K, Domínguez CA (2010), “Selection on signal–reward correlation: limits and opportunities to the evolution of deceit in Turnera ulmifolia L.”, J Evol Biol, 23(12): 2760-7 19 Brito NJ, López JA, Nascimento MA, Macêdo JB, Silva GA, Oliveira CN, de Rezende AA, Brandão-Neto J, Schwarz A, Almeida Md (2012), “Antioxidant activity and protective effect of Turnera ulmifolia Linn var elegans against carbon tetrachloride-induced oxidative damage in rats”, Food Chem Toxicol, 50(12): 4340-7 20 Coutinho HD, Costa JG, Lima EO, Falcão-Silva VS, Siqueira JP Jr (2009), “Herbal therapy associated with antibiotic therapy: potentiation of the antibiotic activity against methicillin–resistant Staphylococcus aureus by Turnera ulmifolia L.”, BMC Complement Altern Med, 9: 13 21 Coutinho HD, Costa JG, Lima EO, Falcão-Silva VS, “Siqueira-Júnior JP (2010), Increasing of the aminoglicosyde antibiotic activity against a multidrugresistant E coli by Turnera ulmifolia L and chlorpromazine”, Biol Res Nurs, 11(4): 332-5 22 Daud N, Taha RM, Noor NN, Alimon H (2011), “Effects of different organic additives on in vitro shoot regeneration of Celosia sp”, Pak J Biol Sci, 14(9): 546-51 23 Galvez J, de Souza Gracioso J, Camuesco D, Galvez J, Vilegas W, Monteiro Souza Brito AR, Zarzuelo A (2006), “Intestinal antiinflammatory activity of a lyophilized infusion of Turnera ulmifolia in TNBS rat colitis”, Fitoterapia, 77(7-8): 515-20 24 Gracioso Jde S, Vilegas W, Hiruma-Lima CA, Souza Brito AR (2002), “Effects of tea from Turnera ulmifolia L on mouse gastric mucosa support the Turneraceae as a new source of antiulcerogenic drugs”, Biol Pharm Bull, 25(4): 487-91 49 25 Hoang VD, Tan GT, Zhang HJ, Tamex PA, Hung NV, Cuong NM, Soejarto Đ, Fong HH, Pezzuto JM (2002), “Natural anti – HIV agents part I: (+)- demethoxyepiexcelsin and verticillatol from Litsea verticillata”, Phytochemistry, 59(3): 325-329 26 Kalidass C, Mohan VR (2009), “In vitro Rapid clonal propagation of Phyllanthus urinaria Linn (Euphorbiaceae)”, A Medicinal Plant, 1(4): 56-59 27 K Kalimuthu R Prabakaran and V Preeetha (2014), “Antibacterial activity of diferent solvent extracts of Ceropegia pusillain in vitro tuber (wight and ARN.) an andemic, medicinal plant”, World Journal of pharmacy and pharmaceutical sciences, 3(8): 785-793 28 Liu X, Hou X (2018), “Antagonistic Regulation of ABA and GA in Metabolism and Signaling Pathways”, Front Plant Sci, 9:251 29 Mohammad HR (2013), “In vitro regeneration of sour orange (Citrus aurantium L.) via direct organogenesis”, Plant Knowledge Journal, Southern Cross Publishing Group, 2(4): 150-156 30 Nascimento MA, Silva AK, Franỗa LC, Quignard EL, Lúpez JA, Almeida MG (2006), “Turnera ulmifolia L (Turneraceae): Preliminary study of its antioxidant activity”, Bioresour Technol, 97(12): 1387-91 31 Oliveira AF, Costa Junior LM, Lima AS, Silva CR, RibeiroMN, Mesquista JW, Rocha CQ, Tangerina MM, Vilegas W (2017), “Anthelmintic activity of plant extracts from Brazilian savanna”, Veterinary Parasitology, 236: 121- 127 32 Park SU, Kim YK, Lee SY (2009), “Improved in vitro plant regeneration and micropropagation of Rehmannia glutinosa L.”, Journal of Medicinal Plants, 3(1): 031-034 33 Park AM, Amui SF, Bertoni BW, Moraes RM, Franca SC (2003), “Micropropagation of Anemopaegma arvense: Conservation of an endangered medicinal plant”, Planta Med, 69(6): 571-573 50 34 Pino JA (2010), “Essential oil of Turnera ulmifolia leaves from Cuba”, Nat Prod Commun, 5(11): 1829-30 35 Samuel K, Debashish D, Madhumita B, Padmaja G, Siva RP, Murthy BRV, Rao PS (2009), “In vitro germination and micropropagation of Givotia rottleriformis Griff”, In vitro Cellular & Developmental Biology 36 Santos KK, Matias EF, Souza CE, Tintino SR, Braga MF, Guedes GM, Nogueira LF, Morais EC, Costa JG, Menezes IR, Coutinho HD (2012), “Anti-Candida activity of Mentha arvensis and Turnera ulmifolia”, J Med Food, 15(3): 322-4 37 Savelieva EM, Oslovsky VE, Karlov DS, Kurochkin NN, Getman IA, Lomin SN, Sidorov GV, Mikhailov SN, Osolodkin DI, Romanov GA (2018), “Cytokinin activity of N6-benzyladenine derivatives assayed by interaction with the receptors in planta”, in vitro, and in silico, Phytochemistry, 149: 161-177 38 Szewczyk K, Zidorn C (2014), “Ethnobotany, phytochemistry, and bioactivity of the genus Turnera (Passifloraceae) with a focus on damianaTurneradiffusa”, J Ethnopharmacol, 152(3): 424-43 39 Zhang HJ, Tan GT, Santarsiero BD, Mesecar AD, Hung NV, Cuong NM, Soejarto Đ, Pezzuto JM, Fong HH (2003), “New Sesquiterpenes from Litsea verticillata”, J Nat Prod, 66(5): 609-615 Tài liệu Internet 40 http://www.banbuonduoclieu.com/blog/cao-kho-dong-hau-damiana-extract 41 http://www.bachkhoatrithuc.vn/encyclopedia/4667.02.633929315971288750 42 “Phân họ hoa thời chung”, http://vi.wikipedia.org 43 http://vienduoclieu.org.vn/tin-chi-tiet/-/chi-tiet/su-can-thiet-phat-trienduoc-lieu-354-677.html 44 “Chi Đông hầu”, https://vi.wikipedia.org 45 “Turnera ulmifolia (West Indian holly)”, https://www.cabi.org 46 “Cây Đông hầu”, http://yhocbandia.vn/cay-dong-hau.html 51 47 “Một số thuốc nam có tác dụng trị mụn làm đẹp da”, https://www.meo trimuntrungca.com/mot-so-cay-thuoc-nam-co-tac-dung-tri-mun-lam-depda.html 48 Trần Phạm (2016), “Đông hầu gì”, Hello Health Group, https://hellobac si.com/thao-duoc/dong-hau/, ngày 11/6/2016 49 http://skinmedicine.vn/cao-cang-da-dong-hau-my-pham-thien-nhien-lamcang-da-vinh-vien/ 52 ... HỌC SƯ PHẠM PHAN THỊ THÚY XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY ĐÔNG HẦU VÀNG (TURNERA ULMIFOLIA) Ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Cán hướng dẫn khoa... lĩnh vực, đặc biệt nhân nhanh bảo tồn loài quý Từ lý trên, lựa chọn đề tài: Xây dựng quy trình nhân giống in vitro Đông hầu vàng (Turnera ulmifolia) nhằm phát triển Đông hầu vàng làm thuốc Việt... cứu Xây dựng quy trình nhân giống in vitro Đông hầu vàng (Turnera ulmifolia) Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu công thức khử trùng hạt Đông hầu vàng - Nghiên cứu ảnh hưởng chất phụ gia đến sinh