Định lượng đồng thời acetaminophen, codein photphat trong thuốc actadol codein bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử (UV VIS)

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi với hướng dẫn khoa học PGS.TS Mai Xuân Trường Các số liệu, kết nghiên cứu nêu luận văn hồn tồn trung thực Nếu sai tơi chịu hồn tồn trách nhiệm Thái Nguyên, tháng năm 2015 Tác giả Trần Quốc Chính XÁC NHẬN CỦA KHOA HĨA HỌC XÁC NHẬN CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS.TS NGUYỄN THỊ HIỀN LAN PGS.TS MAI XUÂN TRƯỜNG i LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập thực luận văn tác giả nhận nhiều quan tâm, động viên giúp đỡ thầy giáo, cô giáo, bạn bè gia đình Tác giả bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: Đào tạo - - Nguyên, thầy cô giáo tham gia giảng dạy cung cấp kiến thức giúp tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Đặc biệt tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS Mai Xuân Trường người tận tình hướng dẫn bảo giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu, thực hoàn thành luận văn Cuối tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè người ln bên tơi, động viên khuyến khích tơi q trình thực đề tài nghiên cứu , chắn luận văn khơng thể tránh khỏi thiếu sót Tác giả mong nhận ý kiến đóng góp chân thành từ thầy giáo, cô giáo bạn đọc Xin chân thành cảm ơn ! Thái Nguyên, tháng năm 2015 Tác giả Trần Quốc Chính ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục .iii Danh mục từ viết tắt luận văn iv Danh mục bảng luận văn v Danh mục hình luận văn vi MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan acetaminophen, codein phot phat 1.1.1 Acetaminophen 1.1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.1.2 Tính chất 1.1.1.3 Dược lý chế tác dụng 1.1.1.4 Dạng thuốc 1.1.2 Codein photphat 1.1.2.1 Giới thiệu chung 1.1.2.2 Tính chất 1.1.2.3 Tổng hợp 1.1.2.4 Dược lý chế tác dụng 1.1.2.5 Dạng thuốc 1.2 Các định luật sở hấp thụ ánh sáng 1.2.1 Định luật Bughe - Lămbe – Bia 1.2.2 Định luật cộng tính 1.2.3 Những nguyên nhân làm cho hấp thụ ánh sáng dung dịch không tuân theo định luật Bughe – Lămbe – Bia 1.3 Một số phương pháp xác định đồng thời cấu tử 10 1.3.1 Phương pháp Vierordt 10 iii 1.3.2 Phương pháp phổ đạo hàm 12 1.3.3 Phương pháp lọc Kalman 14 1.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 15 1.4.1 Nguyên tắc phương pháp HPLC 15 1.4.1.1 Pha tĩnh 16 1.4.1.2 Pha động 17 1.4.2 Các đại lượng đặc trưng q trình sắc kí 18 1.4.2.1 Thời gian lưu thể tích lưu 18 1.4.2.2 Hệ số phân bố 19 1.4.2.3 Hệ số chọn lọc 19 1.4.2.4 Số đĩa lý thuyết chiều cao đĩa lý thuyết 19 1.4.2.5 Độ phân giải ( R S ) 20 1.4.3 Hệ thống máy HPLC 21 1.4.4 Kết xác định số chất theo phương pháp HPLC 21 Chương 2: THỰC NGHIỆM 23 2.1 Nội dung nghiên cứu 23 2.1.1 Phương pháp HPLC 23 2.1.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu 24 24 24 2.2.2.1 Phương pháp HPLC 24 2.2.2.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử 24 24 2.3 Đánh giá độ tin cậy quy trình phân tích 25 2.3.1 Giới hạn phát (LOD) 25 2.3.2 Giới hạn định lượng (LOQ) 25 2.3.3 Đánh giá độ tin cậy phương pháp 25 iv 2.3.4 Đánh giá kết phép phân tích theo thống kê 26 2.4 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 27 2.4.1 Thiết bị 27 2.4.2 Dụng cụ 27 2.4.3 Hóa chất 27 2.4.4 Chế phẩm actadol codeine 28 28 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Phương pháp HPLC 30 3.1.1 Xây dựng điều kiện để xác định đồng thời chất ACT CĐI 30 3.1.1.1 Khảo sát lựa chọn pha động 30 3.1.1.2 Lựa chọn bước sóng 30 3.1.1.3 Lựa chọn tốc độ dòng 31 3.1.2 Đánh giá phương pháp định lượng 33 3.1.2.1 Chuẩn bị dung dịch hỗn hợp chuẩn 33 3.1.2.2 Kiểm tra tính thích hợp hệ thống 33 3.1.2.3 Khảo sát độ tuyến tính phương pháp 34 3.1.2.4 Khảo sát độ lặp lại phương pháp sắc ký 36 3.1.3 Xác định ACT CĐI thuốc Actadol codein 37 3.1.4 Khảo sát độ phép xác định ACT CĐI theo phương pháp thêm chuẩn 38 3.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử 39 3.2.1 Khảo sát phổ hấp thụ phân tử ACT CĐI 39 3.2.2 Kiểm tra phụ thuộc độ hấp thụ quang ACT CĐI vào pH 40 3.2.3 Kiểm tra phụ thuộc độ hấp thụ quang ACT CĐI theo thời gian 40 3.2.4 Kiểm tra phụ thuộc độ hấp thụ quang ACT CĐI theo nhiệt độ 41 3.2.5 Khảo sát khoảng tuyến tính tuân theo định luật Bughe – Lambe – Bia v ACT CĐI Xác định số LOD LOQ 42 42 43 3.2.5.3 Khảo sát khoảng tuyến tính CĐI 44 45 3.2.6 Khảo sát đánh giá độ tin cậy phương pháp nghiên cứu mẫu tự pha 46 46 3.2.7 Xác định hàm lượng ACT CĐI thuốc Actadol codein 48 3.2.8 Đ 49 KẾT LUẬN 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CỦA LUẬN VĂN Tiếng việt Tiếng Anh Viết tắt Acetaminophen Acetaminophen ACT Côđêin phốt phát Codein phosphat CĐI Giới hạn phát Limit Of Detection LOD Giới hạn định lượng Limit Of Quantity LOQ Sai số tương đối Relative Error Độ lệch chuẩn Standard Deviation Phương pháp sắc ký lỏng hiệu High cao Chromatography iv Performance RE S hay SD Liquid HPLC DANH MỤC CÁC BẢNG CỦA LUẬN VĂN Bảng 3.1 Giá trị đại lượng đặc trưng 33 Bảng 3.2 Kết khảo sát thời gian lưu 34 Bảng 3.3 Kết khảo sát diện tích pic 34 Bảng 3.4 Mối tương quan nồng độ diện tích pic ACT CĐI 35 Bảng 3.5 Kết khảo sát độ lặp lại 36 Bảng 3.6 Kết phân tích thuốc Actadol codein 37 Bảng 3.7 Kết khảo sát độ 38 40 41 theo nhiệt độ 41 Bảng 43 44 45 Bảng 3.14 Kết tính LOD LOQ CĐI 46 46 47 Bảng 3.17 Kết tính nồng độ, sai số ACT CĐI mẫu thuốc Actadol codein 48 Bảng 3.18 Hàm lượng chất chuẩn ACT CĐI thêm vào mẫu thuốc Actadol codein 49 Bảng 3.19 Kết xác định độ thu hồi ACT CĐI mẫu thuốc Actadol codein 50 Bảng 3.11 ACT CACT ( g/mL) A( 243nm) CACT ( g/mL) A( 243nm) 0,2 0,6 1,0 2,0 5,0 0,017 0,057 0,071 0,119 0,297 8,0 10,0 20,0 30,0 40,0 0,496 0,623 1,268 1,857 2,454 ACT thu hình 3.8 3.8 ACT Nhận xét 3.11, hình 3.7 3.8 cho thấy: Khi nồng độ ACT khoảng từ 0,2÷ 30 ( g/mL ACT lớn 30 g/mL ACT tuân theo định luật Bughe - Lămbe - Bia khoảng nồng độ 0,2 30 ( g/mL) ACT 3.8 ACT 0,2 40,0 µg/mL , tro =0,9999 (B = 0,0054) 0,2 µg/mL đ (A= 0,017 0,2 5µg/mL ACT 3.12 ACT B SD 0,0054 1,7.10 -4 : LOD LOQ 0,094 ( g/mL) 0,315 ( g/mL) ACT 0,1M 0,2 40 µg/mL, giá trị LOD 0,094 ( g/mL) LOQ 0,315 ( g/mL) 3.2.5.3 Khảo sát khoảng tuyến tính CĐI Pha dãy dung dịch CĐI có nồng độ tăng dần từ 0,2 40 g/mL Tiến hành đo độ hấp thụ quang củ 210-290 n hình 3.9 Hình 3.9 Phổ hấp thụ quang CĐI nồng độ 0,2 Bảng 3.13 dung dịch CĐI nồng độ 0,2 – 40 g/mL bước sóng cực đại 210 nm 3.13 40 g/mL CĐI theo nồng độ CCĐI( g/mL) 0,2 0,6 1,0 2,0 5,0 A(λ = 210 nm) CCĐI( g/mL) 0,014 8,0 0,039 10,0 0,062 20,0 0,126 30,0 0,284 40,0 A(λ = 210 nm) 0,445 0,559 1,152 1,678 2,231 CĐI 3.10 Hình 3.10 Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn phụ thuộc độ hấp thụ quang A vào nồng độ CĐI Nhận xét: 3.13, hình 3.10 cho th : Khi nồng độ CĐI khoảng từ 0,2÷ 30 ( g/mL) độ hấp thụ quan 30 o định luật Bughe - Lămbe - Bia khoảng nồng độ 0,2 30 ( g/mL) CĐI 3.10 0,2 40,0 g/mL CĐI (R = 0,9998); (B = 0,0072 CĐI 0,2 g/mL (A = 0,014 CĐI từ 0,2 5,0 g/mL 3.14 Bảng 3.14 Kết tính LOD LOQ CĐI B SD 0,0072 3,6.10 -4 LOD LOQ 0,15 ( g/mL) 0,5 ( g/mL) : Khoảng tuyến tính CĐI mơi trường HCl 0,1M 0,2 40,0 g/mL, giá trị LOD 0,15 ( g/mL) LOQ 0,5 ( g/mL) 3.2.6 Khảo sát đánh giá độ tin cậy phương pháp nghiên cứu mẫu tự pha ACT CĐI pha ACT CĐI /CACT CĐI 1/150, thể tích VACT VCĐI lấy bảng 3.15 định mức dung dịch HCl 0,1M bình định mức 25 mL 3.15 Pha ACT Mẫu CCĐI/CACT CCĐI CACT 1/1 1/5 1/10 1/15 1/20 1/40 1/60 1/100 1/150 8,0 2,0 0,8 0,4 0,4 0,2 0,1 0,1 0,1 8,0 10,0 8,0 6,0 8,0 8,0 6,0 10,0 15 CĐI VCĐI(1) VCĐI(2) VCĐI(3) VACT (mL) (mL) (mL) (mL) 5,0 2,5 2,5 2,5 8,0 4,0 4,0 - 8,0 2,0 - 8,0 10,0 8,0 6,0 8,0 8,0 6,0 10,0 15 : VCĐI(1), VCĐI(2), VCĐI(3), thể tích (mL) dung dịch CĐI tương ứng với nồng độ µg/mL, 2,5 µg/mL, 25 µg/mL VACT thể tích (mL) dung dịch ACT 25 µg/mL ỗn hợp khoảng bước sóng 210 290 nm; 0,5 nm lấy giá trị Từ số liệu đo quang tiến hành tính hàm lượng ACT, CĐI theo chương trình lọc Kalman [9] ACT CĐI trình bày bảng 3.16 3.16 ACT Mẫu CCĐI/CACT 1/1 1/5 1/10 1/15 1/20 1/40 1/60 1/100 1/150 C CĐI 8,0 2,0 0,8 0,4 0,4 0,2 0,1 0,1 0,1 C ACT 8,0 10,0 8,0 6,0 8,0 8,0 6,0 10,0 15 CĐI CCĐI CACT 7,98 1,99 0,78 0,39 0,38 0,17 0,08 0,07 0,06 8,03 10,02 7,95 5,99 7,98 7,99 5,97 9,98 14,96 RE% CCĐI -0,25 -0,5 -1,5 -2,5 -5,0 -15 -20 -30 -40 RE% CACT 0,4 0,2 -0,6 -0,2 -0,3 -0,1 -0,5 -0,2 -0,3 : C ACT C CĐI (μg/mL) hàm lượng ACT, CĐI CACT CCĐI (μg/mL) hàm lượng ACT, CĐI xác định theo phương pháp lọc kalman RE% CCĐI RE% CACT sai số phép xác định hàm lượng ACT CĐI Nhận xét: Kết thu bảng 3.16 cho thấy hàm lượng ACT lớn CĐI (nhỏ 1%) Vì khơng xác định hàm lượng CĐI hỗn hợp ACT CĐI hàm lượng ACT lớn hàm lượng CĐI 40 lần 3.2.7 Xác định hàm lượng ACT CĐI thuốc Actadol codein - ACT CĐI thuốc viên nén Actadol codein sản xuất công ty TNHH thành viên dược phẩm sinh học y tế Quận Tân Phú, TP Hồ Chí Minh - Việt Nam; Số lơ: III-18; Ngày sản xuất: 08/3/2014; Hạn sử dụng: 08/3/2017 Thành phần theo công bố 500 mg ACT mg CĐI viên - Xử lý mẫu thuốc: Cân 20 viên thuốc, tính khối lượng trung bình viên ( m = 0,5826g) Đem nghiền nhỏ thành bột mịn lấy xác lượng bột tương đương 1/10 viên (chứa 50 mg ACT 0,8 mg CĐI) cho vào bình định mức 100 mL, định mức dung dịch HCl 0,1M sau rung siêu âm khoảng 15 phút Đem lọc, bỏ khoảng 40 mL dung dịch đầu, lấy mL dung dịch lọc đem định mức thành 100 mL thu dung dịch chứa hàm lượng tương đương ACT 25 g/mL CĐI 0,4 g/mL gọi dung dịch gốc Sau tiếp tục lấy thể tích dung dịch gốc 10 mL, mL, mL, mL, mL pha loãng dung dịch HCl 0,1M định mức thành 25mL thu dung dịch thuốc có tỉ lệ nồng độ ACT: CĐI bảng 3.17 - thụ quang máy UV-VIS 1700 SHIMADZU khoảng bước sóng từ 210 - 290 nm, bảng 3.17 Bảng 3.17 Kết tính nồng độ, sai số ACT CĐI mẫu thuốc Actadol codein Mẫu m ACT 500 500 500 500 500 mACT mCĐI 8,00 8,00 8,00 8,00 8,00 505,2 500,5 499,9 501,1 498,8 7,5 7,11 7,19 6,93 5,67 m CĐI RE% CACT 1,04 0,10 -0,02 0,22 -0,24 RE% CCĐI -6,25 -11,13 -10,13 -13,38 -29,13 Trong đó: m ACT, m CĐI hàm lượng ACT(mg) CĐI (mg) viên thuốc actadol codein mACT, mCĐI hàm lượng ACT(mg) CĐI(mg) tính toán theo phương pháp lọc kalman; RE% sai số phép xác định hàm lượng ACT CĐI Nhận xét: Qua bảng 3.17 nhận thấy xác định ACT hỗn hợp tương đối xác ACT có hàm lượng lớn, sai số mắc phải phép xác định CĐI lớn Vì CĐI thuốc Actadol codein cần phải sử dụng phương pháp thêm chuẩn 3.2.8 Đ ACT CĐI Đo CĐI ACT Cân 20 viên thuốc, tính khối lượng trung bình viên ( m = 0,5826g) Đem nghiền nhỏ thành bột mịn Thêm vào mẫu thuốc lượng chất chuẩn ACT CĐI bảng 3.18, lấy xác lượng bột tương đương 50mg ACT 0,8mg CĐI , pha dung dịch muc 3.2.7 để dung dịch chứa hàm lượng tương đương ACT 10 g/mL CĐI 0,16 g/mL Bảng 3.18 Hàm lượng chất chuẩn ACT CĐI thêm vào mẫu thuốc Actadol codein Mẫu mACT(1) (mg) 500 500 500 mCĐI(1) (mg) 8 mACT(2) (mg) 20 40 60 mCĐI(2) (mg) 2,0 4,0 6,0 mACT(3) (mg) 520 540 560 mCĐI(3) (mg) 10 12 14 Trong đó: mACT(1), mCĐI(1) hàm lượng ACT CĐI mẫu thuốc trước thêm chuẩn mACT(2), mCĐI(2) hàm lượng ACT CĐI thêm vào mẫu thuốc mACT(3), mCĐI(3) hàm lượng ACT CĐI sau thêm chuẩn - Đo độ hấp thụ quang khoảng bước sóng từ 210 - 290 nm tính tốn, bảng 3.19 Bảng 3.19 Kết xác định độ thu hồi ACT CĐI mẫu thuốc Actadol codein Chất chuẩn ACT CĐI Mẫu CK (mg) C (mg/) CT (mg) Rev(% ) 500 20 520,2 101,0 500 40 539,8 99,50 60 2,0 559,6 9,980 99,30 500 8,00 8,00 4,0 11,94 98,50 8,00 6,0 14,02 100,3 99,00 Trong đó: CK(mg) hàm lượng ACT CĐI thuốc Actadol codein xác định trước thêm chuẩn C (mg) hàm lượng ACT CĐI thêm vào mẫu CT (mg) hàm lượng ACT CĐI xác định sau thêm chuẩn Rev(%) độ thu hồi ACT CĐI Nhận xét: Qua bảng 3.19 cho thấy độ thu hồi ACT từ 99,3% đến 101% CĐI từ 98,5% đến 100,3% Độ thu hồi ACT CĐI mắc sai số nhỏ (