PCRqPCR slide KỸ THUẬT PCR

PCR real-time PCR vấn đề Phạm Hùng Vân Ngun tắc PCR DNA đích Biến tính (94oC ) 2 Bắt cặp (55-65o C) 5’ 3’ 3’ 5’ Kéo dài (72o C) n 2n Tại cần phải có primers? 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ Mồi Taq polymerase dNTP PCR buffer + MgCl2 DNA đích (Template) PCR MIX 30X-40X 94oC/15s-1min 55-65oC/15s-1min 72oC/30s-3min 30X-40X 94oC/15s-1min 55-65oC/15s-1min 72oC/30s-3min Phát trình tự đặc hiệu kỹ thuật lai Các chìa khố kỹ thuật giúp hồn thiện PCR (1) Phát polymerase chịu nhiệt 72oC từ vi khuẩn Thermus aquaticus (Taq polymerase) Hiện men polymerase chịu nhiệt trích từ vi khuẩn E coli tái tổ hợp (2) Sự phát triển hồn thiện loại máy ln nhiệt t T Máy ln nhiệt dùng bloc Peltier effect HOT COLD t T MJ research Reverse Peltier SYBR I Ngun tắc họat động SYBR GREEN I Taqman probe Beacon probe Hybridization probe PCR real-time PCR phát tác nhân VSV PCR lànuôi cấy phân tửkhuếch đại đoạn gen Nuôi cấy PCR Phò n g thí nghiệ m PCR phá t hiệ n tá c nhâ n VSV gâ y bệ n h làphò ng thí nghiệ m vi sinh vớ i vai trònuô i cấ y phâ n tửtương tự phò n g thí nghiệ m vi sinh vớ i vai trònuô i cấ y bộgene Do vậ y phá t triể n PCR phá t hiệ n tá c nhâ n vi sinh vậ t gâ y bệ n h phả i phá t triể n phò ng thí nghiệ m vi sinh Đònh danh dựa vào kiểu hình sinh vật hóa học biểu từ kiểu gen Xác đònh dựa vào kích thước đoạn gen hay trình tự đặc hiệu đoạn gen Thử nghiệm PCR dễ chuẩn hoá Bệnh phẩm Rất dễ dàng chuẩn hoá bước thử nghiệm PCR Dễ dàng nhiều so với phòng thí nghiệm vi sinh Ly trích nucleic acid Thực PCR Phát sản phẩm PCR Real-time PCR d chu∃n hố h&n Bệnh phẩm Thử nghiệm real-time PCR lại dễ thực chuẩn hố khơng cần khâu đọc kết sau hồn tất PCR Ly trích nucleic acid Thực PCR Phân tích kết Phát hay định lượng tác nhân vi sinh vật gây nhiễm trùng người động vật q q q Tác nhân virus cần phải phát để sớm có biện pháp theo dõi (chẩn đốn sớm SXH), điều trị (viêm gan B, viêm gan C, HSV), theo dõi hiệu điều trị (viêm gan B, viêm gan C, HIV/AIDS), hay phòng ngừa (H5N1, SARS) Tác nhân vi khuẩn phương pháp truyền thống khơng nhạy, khơng kịp thời (Lao, Chlamydia, Lậu kinh niên) Các tác nhân gây dịch khơng an tồn làm xét nghiệm với phương pháp vi sinh truyền thống phòng xét nghiệm lâm sàng chưa có an tồn cấp độ (H5N1, SARS, tác nhân khủng bố sinh học) ... (Idaho) (3) Kỹ thuật chống ngoại nhiễm sản phẩm khuếch ñại (PCR carry-over) Các loại PCR q Monoplex PCR q Nested PCR q Multiplex PCR q Nonstop-nested PCR q Touch down PCR q Touch up PCR q RT -PCR step... PCR q RT -PCR step q RT -PCR step Monoplex PCR PCR 40X 94oC for 30” 55oC for 30” 72oC for 01’ Multiplex PCR PCR 40X 94oC for 30” 55oC for 30” 72oC for 01’ Touch-down PCR 05X PCR 05X 40X 94oC for... (Template) PCR MIX 30X-40X 94oC/15s-1min 55-65oC/15s-1min 72oC/30s-3min 30X-40X 94oC/15s-1min 55-65oC/15s-1min 72oC/30s-3min Phát trình tự ñặc hiệu kỹ thuật lai Các chìa khoá kỹ thuật giúp hoàn thiện PCR