Nghiên cứu thu nhận chất kháng sinh vancomycin từ môi trường lên men chủng xạ khuẩn S. orientalis (LV thạc sĩ)

80 517 1
Nghiên cứu thu nhận chất kháng sinh vancomycin từ môi trường lên men chủng xạ khuẩn S. orientalis (LV thạc sĩ)

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

Nghiên cứu thu nhận chất kháng sinh vancomycin từ môi trƣờng lên men chủng xạ khuẩn S. orientalis (LV thạc sĩ)Nghiên cứu thu nhận chất kháng sinh vancomycin từ môi trƣờng lên men chủng xạ khuẩn S. orientalis (LV thạc sĩ)Nghiên cứu thu nhận chất kháng sinh vancomycin từ môi trƣờng lên men chủng xạ khuẩn S. orientalis (LV thạc sĩ)Nghiên cứu thu nhận chất kháng sinh vancomycin từ môi trƣờng lên men chủng xạ khuẩn S. orientalis (LV thạc sĩ)Nghiên cứu thu nhận chất kháng sinh vancomycin từ môi trƣờng lên men chủng xạ khuẩn S. orientalis (LV thạc sĩ)Nghiên cứu thu nhận chất kháng sinh vancomycin từ môi trƣờng lên men chủng xạ khuẩn S. orientalis (LV thạc sĩ)Nghiên cứu thu nhận chất kháng sinh vancomycin từ môi trƣờng lên men chủng xạ khuẩn S. orientalis (LV thạc sĩ)Nghiên cứu thu nhận chất kháng sinh vancomycin từ môi trƣờng lên men chủng xạ khuẩn S. orientalis (LV thạc sĩ)Nghiên cứu thu nhận chất kháng sinh vancomycin từ môi trƣờng lên men chủng xạ khuẩn S. orientalis (LV thạc sĩ)Nghiên cứu thu nhận chất kháng sinh vancomycin từ môi trƣờng lên men chủng xạ khuẩn S. orientalis (LV thạc sĩ)Nghiên cứu thu nhận chất kháng sinh vancomycin từ môi trƣờng lên men chủng xạ khuẩn S. orientalis (LV thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC - HOÀNG THỊ NƢƠNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN VANCOMYCIN TỪ MÔI TRƢỜNG LÊN MEN CHỦNG XẠ KHUẨN S orientalis LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC - HOÀNG THỊ NƢƠNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN VANCOMYCIN TỪ MÔI TRƢỜNG LÊN MEN CHỦNG XẠ KHUẨN S orientalis LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 60420201 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS Nguyễn Phƣơng Nhuệ THÁI NGUYÊN – 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu thực Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa có công bố công trình khác Thái Nguyên, ngày 20 tháng năm 2015 Tác giả Hoàng Thị Nƣơng Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Phương Nhuệ - phó trưởng phòng Công nghệ lên men - Viện công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn dìu dắt suốt trình thực hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn cán Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn tình cảm quý báu Tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô Khoa Khoa học Sự Sống, Trường Đại học Khoa học giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho trình học tập, nghiên cứu Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình bạn bè, người bên tôi, động viên, góp ý tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian học tập nghiên cứu Thái Nguyên, ngày 20 tháng năm 2015 Tác giả Hoàng Thị Nƣơng Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chất kháng sinh vancomycin 1.1.1 Lịch sử phát triển ứng dụng điều trị bệnh vancomycin 1.1.2 Cấu trúc phân tử đặc tính hóa lý vancomycin 1.1.3 Cơ chế kháng khuẩn vancomycin 1.1.4 Sinh tổng hợp vancomycin xạ khuẩn 1.2 Nguồn nguyên liệu có Việt Nam dùng cho lên men sinh vancomycin 12 1.2.1 Nguồn bột đao 12 1.2.2 Nguồn cao nấm men 12 1.3 Tối ƣu hóa môi trƣờng 13 1.3.1 Khái niệm tối ưu môi trường 13 1.3.2 Phương pháp bề mặt đáp ứng 14 1.4 Phƣơng pháp tách chiết vancomycin 15 1.4.1 Tách chiết dung môi hữu 15 1.4.2 Tách chiết hấp phụ 16 1.4.3 Tách chiết trao đổi ion 18 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Vật liệu 22 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 2.1.1 Đối tượng 22 2.1.2 Hóa chất 22 2.1.3 Dụng cụ 22 2.2 Môi trƣờng nghiên cứu 22 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 24 2.3.1 Phương pháp bảo quản giống 24 2.3.2 Nhận biết đặc điểm sinh học chủng S orientalis 4912 24 2.3.3 Phương pháp lên men 25 2.3.4 Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh 27 2.3.5 Phương pháp tách chiết vancomycin 28 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Nhận biết đặc điểm sinh học chủng Streptomyces orientalis 4912 32 3.1.1 Đặc điểm hình thái 32 3.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 33 3.2 Lựa chọn môi trƣờng lên men 35 3.3 Ảnh hƣởng thành phần môi trƣờng lên men 36 3.3.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả sinh tổng hợp vancomycin chủng S orientalis 4912 36 3.3.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh tổng hợp vancomycin chủng S orientalis 4912 38 3.4 Tối ƣu hoá thành phần môi trƣờng lên men sinh tổng hợp vancomycin từ chủng S orientalis 4912 theo phƣơng pháp bề mặt đáp ứng 40 3.5 Động thái trình lên men sinh tổng hợp vancomycin chủng S orientalis 4912 môi trƣờng tối ƣu 44 3.6 Nghiên cứu chế độ lên men vancomycin 46 3.6.1 Chế độ lên men vancomycin theo mẻ 46 3.6.2 Chế độ lên men bán liên tục 48 3.7 Tách chiết vancomycin từ dịch lên men dung môi 49 3.7.1 Khả tách chiết vancomycin loại dung môi khác 49 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 3.7.2 Tỉ lệ phối trộn dung môi dịch lên men phù hợp cho tách chiết vancomycin 52 3.7.3 Xác định thời gian tách chiết 54 3.8 Tách chiết vancomycin từ dịch lên men phƣơng pháp hấp phụ 55 3.8.1 Khả hấp phụ vancomycin số chất hấp phụ 55 3.8.2 Nồng độ than hoạt tính dung môi sử dụng để nhả hấp phụ 55 3.8.3 Xác định pH thời gian nhả hấp phụ 57 3.8.4 Xác định tỷ lệ hỗn hợp dung môi 58 3.9 Tách chiết vancomycin từ dịch lên men phƣơng pháp trao đổi ion 60 3.9.1 Tách chiết vancomycin với số chất trao đổi ion 60 3.9.2 Kiểm tra vancomycin tách chiết từ dịch lên men 63 Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 PHỤ LỤC 69 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT PG B subtilis ATCC 6633 Peptidoglycan Bacillus subtilis ATCC6633 E coli Escherichia coli MRSA Methicillin resistant Staphylococcus aureus S orientalis 4912 Streptomyces orientalis 4912 DLM Dịch lên men KSC Kháng sinh chuẩn HPLC Sắc kí lỏng cao áp CKS Chất kháng sinh RSM Reponse Surface methodology HTKS Hoạt tính kháng sinh ĐKVVK Đƣờng kính vòng vô khuẩn VVK Vòng vô khuẩn SKU Sinh khối ƣớt Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Số Tên bảng Trang hiệu 1.1 Phổ kháng khuẩn vancomycin Ảnh hƣởng nhiệt độ đến sinh trƣởng chủng S.orientalis 3.1 4912 32 3.2 Ảnh hƣởng pH đến sinh trƣởng chủng S.orientalis 4912 32 3.3 Khả đồng hoá đƣờng chủng S orientalis 4912 34 Khả sinh tổng hợp vancomycin chủng S orientalis 3.4 4912 số môi trƣờng 35 Ảnh hƣởng nguồn cacbon đến khả sinh tổng hợp 3.5 vancomycin chủng S orientalis 4912 36 Ảnh hƣởng nguồn nitơ đến khả sinh tổng hợp 3.6 vancomycin chủng S orientailis 4912 39 Các yếu tố biến đổi thành phần môi trƣờng lên men Bố trí thí nghiệm kết tối ƣu hóa môi trƣờng sinh tổng hợp vancomycin từ chủng S orientalis 4912 theo RSM-CCD 41 Bảng phân tích hồi quy mô hình tối ƣu Kết kiểm chứng tƣơng thích mô hình với thực 3.10 nghiệm 3.11 HTKS chủng S orientalis 4912 lên men theo mẻ 42 3.12 Hiện tƣợng trộn dịch lên men với dung môi Hoạt tính kháng khuẩn dung môi khác sau 3.13 trình tách chiết từ dịch lên men Hoạt tính kháng khuẩn dung môi n – Butanol tách chiết tỉ lệ 3.14 2/1 khoảng thời gian khác 50 3.15 Khả hấp phụ chất kháng sinh số chất hấp phụ Ảnh hƣởng nồng độ than hoạt tính tới khả hấp phụ 3.16 chất kháng sinh 55 3.17 Ảnh hƣởng dung môi tới khả nhả hấp phụ vancomycin Ảnh hƣởng pH thời gian đến trình nhả hấp phụ 3.18 vancomycin Ảnh hƣởng tỷ lệ hỗn hợp dung môi tới trình nhả hấp 3.19 phụ vancomycin 56 3.20 Khả tách chiết vancomycin với số chất trao đổi ion 60 3.7 3.8 3.9 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 41 44 47 52 54 56 58 59 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Số hiệu Tên hình đồ thị Trang 1.1 Cấu trúc hóa học cấu trúc không gian vancomycin 3.1 Khuẩn lạc chủng S orientalis 4912 MT thạch 48 Hình dạng khuẩn ty chuỗi bào tử chủng S orientalis 4912 Hoạt tính vancomycin chủng S orientalis 4912 môi trƣờng lên men khác Ảnh hƣởng nguồn cacbon đến khả sinh tổng hợp vancomycin chủng S orientalis 4912 Ảnh hƣởng nồng độ bột đao đến khả sinh tổng hợp vancomycin chủng S orientalis 4912 Ảnh hƣởng nồng độ cao nấm men đến khả sinh tổng hợp vancomycin chủng S orientalis 4912 33 43 3.8 Vùng tối ƣu cặp yếu tố ảnh hƣởng bột đao – cao nấm men Động thái trình lên men sinh tổng hợp vancomycin chủng S orientalis 4912 môi trƣờng tối ƣu 3.9 Hoạt tính kháng sinh chủng S orientalis lên men theo mẻ 48 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 34 36 37 38 40 46 3.10 HTKS chủng S orientalis lên men bán liên tục 48 3.11 Kết tách chiết vancomycin dung môi khác Hoạt tính kháng khuẩn dung môi - Butanol sau chiết 3.12 vancomycin từ dịch lên men Hoạt tính kháng khuẩn dung môi n - Butanol sau chiết 3.13 vancomycin từ dịch lên men Hoạt tính kháng MRSA dung môi n – Butanol tách chiết tỉ 3.14 lệ 2:1 khoảng thời gian khác Nhả hấp phụ vancomycin từ than hoạt tính với dung môi 3.15 khác 3.16 Kết sắc ký giấy chất kháng sinh vancomycin 51 3.17 Sơ đồ tách chiết vancomycin cột trao đổi ion 3.18 Sơ đồ quy trình tách chiết vancomycin nhựa trao đổi ion Sắc kí đồ HPLC vancomycin sau làm tinh khiết từ 3.19 dịch lên men chủng S orientalis 4912 61 62 3.20 Sắc đồ HPLC vancomycin chuẩn (Merck) 63 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 53 53 54 57 59 63 Bảng 3.16 Ảnh hƣởng nồng độ than hoạt tính tới khả hấp phụ chất kháng sinh Nồng độ than hoạt tính (g) Hoạt tính kháng sinh (ĐKVVK, mm) 0.2 4.0 0.5 3.0 1.0 0.0 2.0 0.0 3.0 0.0 4.0 0.0 Để xác định chất nhả hấp phụ vancomycin từ than hoạt tính, sử dụng 100ml dung môi khác pha với nƣớc tỉ lệ 3:2, pH = để nhả hấp phụ 1g than hoạt tính hấp phụ vancomycin Kết thể bảng 3.17 hình 3.15 cho thấy dung môi acetone isopropanol có khả hấp phụ tốt nhất, lƣợng vancomycin thu đƣợc tƣơng đƣơng Tuy nhiên, acetone đƣợc lựa chọn có khả bay nhanh nên thuận lợi cho trình tinh chế Bảng 3.17 Ảnh hƣởng dung môi tới khả nhả hấp phụ vancomycin Các dung môi HTKS (ĐKVVK, mm) n – Butanol 0.0 Acetone 16.5 Methanol 0.0 Ethanol 0.0 Chloroform 0.0 Isopropanol 16 56 Hình 3.15 Nhả hấp phụ vancomycin từ than hoạt tính với dung môi khác Chú thích: Mẫu đối chứng giấy tẩm dung môi Các dung môi nhả hấp phụ A: Ethanol, B: Methanol, C: n – Butanol, D: Chloroform, , E: Acetone, F: isopropanol 1, 2, số lần lặp lại 3.8.3 Xác định pH thời gian nhả hấp phụ Để xác định pH thời gian nhả hấp phụ thích hợp, hỗn hợp dung môi acetone/nƣớc đƣợc điều chỉnh pH thay đổi từ – 10 dung dịch HCl1N NaOH 1N tiến hành nhả hấp phụ khoảng thời gian 30 – 120 phút Kết bảng 3.18 cho thấy khả nhả hấp phụ vancomycin nhờ hệ dung môi acetone/nƣớc tốt pH = thời gian nhả hấp phụ thích hợp 30 phút, kéo dài khả nhả hấp phụ không tăng thêm 57 Bảng 3.18 Ảnh hƣởng pH thời gian đến trình nhả hấp phụ vancomycin HTKS (ĐKVVK, mm) Thời gian (phút) 30 45 60 90 120 16,7 14,3 13,0 13,0 11,5 17,3 15,6 15,0 14,5 13,5 18,3 15,6 15,0 14,5 13,5 21,0 18,9 16,5 16,4 15,5 24,0 19,8 18,3 17,3 17,1 20,0 19,5 16,5 16,2 15,5 10 15,5 15,5 14,5 13,9 13,2 pH 3.8.4 Xác định tỷ lệ hỗn hợp dung môi Khi nhả hấp phụ chất kháng sinh than hoạt tính hỗn hợp dung môi acetone nƣớc đem lại hiệu Thay đổi tỷ lệ acetone: nƣớc (v:v) cho tổng thể tích hỗn hợp không đổi Kết trình bày bảng 3.19 cho thấy với tỷ lệ hỗn hợp dung môi acetone: nƣớc 3: (v:v) pH 8, đảm bảo nhả hấp phụ chất kháng sinh tốt thuận lợi cho trình cô đặc chân không sau Kết xác định tỷ lệ aceton/nƣớc, đảm bảo lƣợng nƣớc mà tách đƣợc triệt để chất kháng sinh từ chất hấp phụ cho thấy, với tỷ lệ hỗn hợp dung môi 4/1, 3/2, 2/1, 1/3 1/4, sau nhả hấp phụ xác định hoạt tính kháng sinh phƣơng pháp khoanh giấy lọc cho đƣờng kính vòng kháng khuẩn lần lƣợt 18, 25, 21 18,5 mm Nhƣ tỷ lệ hỗn hợp dung môi aceton/nƣớc : 2, đảm bảo nhả hấp phụ CKS cao thuận lợi cho trình cô đặc chân không sau 58 Bảng 3.19 Ảnh hƣởng tỷ lệ hỗn hợp dung môi tới trình nhả hấp phụ vancomycin Tỷ lệ aceton: nƣớc (v:v) ĐKVVK (mm) 4:1 18,0 3:2 24,0 2:1 21,0 1:3 18,5 1:4 17,0 Dịch nhả hấp phụ từ than hoạt tính đƣợc cô chân không nhiệt độ < 50C để loại bỏ acetone Sử dụng phƣơng pháp sắc ký giấy để xác định Rf so sánh với vancomycin chuẩn Kết hình 3.16 cho thấy Rf chất kháng sinh thô nhận đƣợc từ dịch lên men chủng S orientalis 4912 tƣơng đƣơng với vancomycin chuẩn Rf = 0,95 Hình 3.16 Kết sắc ký giấy chất kháng sinh vancomycin (1:Vancomycin chuẩn, Merck; 2: Dịch lên men 3: Vancomycin sau tinh sạch) 59 Tuy nhiên, tách chiết vancomycin hấp phụ qua than hoạt tính cho kết khả quan nhƣng kháng sinh thô thu đƣợc lẫn màu, nên cần tiếp tục nghiên cứu phƣơng pháp để thu nhận đƣợc vancomycin tinh 3.9 Tách chiết vancomycin từ dịch lên men phƣơng pháp trao đổi ion 3.9.1 Tách chiết vancomycin với số chất trao đổi ion Bảng 3.20 Khả tách chiết vancomyxin với số chất trao đổi ion Hoạt tính kháng sinh (ĐKVVK, mm) pH Cation Wofatit KPS Anion Dowex 50 Dowex 80 Wofatit N H+ Cl- Dịch lên men (Đối chứng) 28,0 28,0 28,0 28,0 0 27,7 26,5 25,9 26,8 10 27,4 26,8 25,7 26,4 Số liệu bảng 3.20 cho thấy, dịch lên men sau bổ sung chất trao đổi ion thử hoạt tính kháng khuẩn với mẫu phƣơng pháp đục lỗ thạch cho thấy: giá trị pH khả giữ kháng sinh vancomycin chất trao đổi ion tốt với hoạt tính kháng khuẩn thấp so với mẫu lại giá trị pH 10 Điều có nghĩa vancomycin dịch lên men đƣợc giữ lại chất trao đổi ion bảng 3.20 giá trị pH tốt Qua kết thu đƣợc cho thấy chất kháng sinh hấp phụ tốt với loại chất trao đổi cation tốt so với anion đặc điểm chất kháng sinh có chứa nhiều gốc anion Dịch chảy qua cột đƣợc kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn cho thấy vancomycin đƣợc hấp phụ gần nhƣ hoàn toàn cột Tuy nhiên với chất trao đổi ion Dowex 50 H+ Dowex 80 Cl- chất đắt nên sử dụng chất có giá trị hấp phụ tƣơng đối tốt mà giá 60 thành lại rẻ Wofatit KPS Wofatit N Hai chất đƣợc chọn làm chất sử dụng trình tách chiết tinh chế vancomycin thí nghiệm Dịch chiết Cột trao đổi ion cation Wofatit KPS 200, anion Wofatit N, + Dowex 80 H Dowex 80 Cl Dịch chảy qua cột - Xác định khả kháng khuẩn Dịch rửa cột Các phân đoạn Dịch chứa vancomycin Các bƣớc Hình 3.17 Sơ đồ tách chiết vancomycin cột trao đổi ion Dựa vào đặc tính chất trao đổi ion mà tiến hành thí nghiệm cho phù hợp với chất tách chiết Chất nhồi cột cation Wofatit KPS có giá thể polystyrol, -SO3H+ loại acid mạnh có tác dụng giữ vancomycin lại cột Chiều cao cột 40 cm, đƣờng kính 1cm tốc độ chảy dịch 0,1 ml/phút Dịch lên men sau đƣợc ly tâm cho chảy qua cột cation, dịch chảy đƣợc thử hoạt tính kiểm tra thấy hầu nhƣ không hoạt tính kháng sinh Vancomycin đƣợc cố định cột sau đƣợc nhả hấp phụ dung dịch NH4OH 0,2 N pH 9-11 Dịch chiết thu đƣợc có chứa 61 vancomycin tiếp đƣợc điều chỉnh pH giá trị HCl Tiếp theo, dịch vancomycin đƣợc cho vào cột anion Wofatit N cột có tính chất có chứa nhóm amin thơm bazơ yếu nên có khả giữ lại vancomycin Dịch chảy bị loại bỏ Tiếp dùng nƣớc cất để rửa cột thu kháng sinh, dịch vancomycin thu hồi đƣợc điều chỉnh đến giá trị pH HCl Sơ đồ mô tả quy trình tách chiết vancomycin chất trao đổi ion cụ thể hình 3.18 Dịch lên men Lọc Sinh khối Dịch lọc Cột trao đổi cationWofatit KPS Nhả hấp phụ Các phân đoạn có Vancomycin NH4OH 0,2 N pH 9-11 Chỉnh pH HCl Chiết vancomycin Dịch chiết Than Vancomyxin Cột có nhựa trao đổi ion Wofatit N Chiết nước cất Chỉnh pH HCl Dịch vancomycin tinh Hình 3.18 Sơ đồ quy trình tách chiết vancomycin nhựa trao đổi ion 62 3.9.2 Kiểm tra vancomycin tách chiết từ dịch lên men DAD-CH1 215 - 350 nm vancomycin-chiet Name Retention Time ESTD concentration Units 1400 1400 1200 95.400 CAL % 1200 1000 4.400 1000 800 600 mAU mAU Vancomycin 800 600 400 400 200 200 0 10 Minutes Hình 3.19 Sắc đồ HPLC vancomycin sau làm tinh khiết từ dịch lên men chủng S orientalis 4912 DAD-CH1 215 - 350 nm chuan vancomycin Name Retention Time ESTD concentration Units 1400 1400 1200 95.700 CAL % 1200 1000 4.400 1000 800 600 mAU mAU Vancomycin 800 600 400 400 200 200 0 10 Minutes Hình 3.20 Sắc đồ HPLC vancomycin chuẩn (Merck) Sắc ký lỏng cao áp vancomycin chuẩn vancomycin chiết xuất đƣợc đo máy: HPLC-SPA-10 Shimadzu, Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lƣờng chất lƣợng 1, Tổng cục Tiêu chuẩn đo lƣờng chất lƣợng, cho thấy thời gian lƣu vancomycin chiết xuất đƣợc giống với vancomycin chuẩn 4,4 phút Sắc đồ HPLC cho thấy pic tạp chứng tỏ vancomycin chế phẩm tinh sạch, độ tinh khiết vancomycin chế phẩm đạt 95,4% 63 Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Đã nhận biết đƣợc số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa chủng S orientalis 4912: khuẩn lạc tròn, bề mặt khô, xù xì có kích thƣớc 3-5 mm môi trƣờng MT48 Chủng sinh trƣởng tốt pH 6-8, nhiệt độ 28-300C, có khả sử dụng tốt hầu hết nguồn đƣờng thông thƣờng Bằng phƣơng pháp tối ƣu bề mặt đáp ứng xác định đƣợc thành phần môi trƣờng tối ƣu gồm: 24,95 (g/l); cao nấm men 5,694 (g/l); MgSO4 0,75 (g/l); NaCL (g/l); KCl 0,5 (g/l); dung dịch muối vi lƣợng 10 ml; pH Động thái trình lên men sinh tổng hợp vancomycin chủng S orientalis 4912 môi trƣờng tối ƣu cho thấy; sinh khối đạt cao sau 78 hoạt tính vancomycin cực đại sau 84 lên men, HTKS cao 4,16 U/ml Lựa chọn đƣợc chế độ lên men thích hợp cho chủng S orientalis 4912 sinh nhiều chất kháng sinh vancomycin chế độ lên men bán liên tục Đã lựa chọn đƣợc phƣơng pháp tách chiết thích hợp trao đổi ion sử dụng cation Wofatit KPS anion Wofatit N Sản phẩm vancomycin thu đƣợc tƣơng đƣơng vancomycin chuẩn (Mecrk) qua đánh giá HPLC, độ tinh đạt 95,4% ĐỀ NGHỊ 1.Tiếp tục nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện lên men nhằm nâng cao khả sinh tổng hợp kháng sinh vancomycin chủng S orientalis môi trƣờng tối ƣu Tiếp tục nghiên cứu tối ƣu trình tách chiết tinh vancomycin để thu đƣợc sản phẩm đạt tiêu chuẩn ứng dụng y tế 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Vũ Ngọc Bích (2012), Nghiên cứu biến tính tinh bột từ dong riềng, khoai lang ứng dụng sản xuất số thực phẩm, Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men chất kháng sinh, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đặng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phƣớc, Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học Tập 3, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Lê Gia Hy (1994), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn thối cổ rễ phân lập Việt Nam, Luận án Phó tiến sĩ sinh học PGS TS Phan Tuấn Nghĩa (2012), Giáo trình hóa sinh học thực nghiệm, Nhà xuất Giáo dục Nguyễn Phƣơng Nhuệ, Nguyễn Văn Hiếu, Lê Gia Hy (2009), Nghiên cứu tối ưu môi trường lên men chủng Streptomyces orientalis 4912 sinh vancomycin Tạp chí Khoa học công nghệ, tập 47, số 6, Tr: 25-34 Cao Xuân Thu (2000), Kháng sinh vitamin, Bộ môn Công nghiệp dƣợc Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội Bùi Xuân Vững (2009), Phương pháp phân tích sắc ký, Đại học Sƣ phạm Đà Nẵng Tiếng Anh Albert JRHeck, Thomas JD Jorgensen (2004), “Vancomycin in vacuole” International Journal of Mass Spectrometry 236: 11- 23 10 Arjun S, James DD, Trish MP (2002), Vancomycin resistance in Staphylococci Clinical Microbiol 15 (3): 430- 438 65 11 B M Willey, B N Kreiswirth, A E Simor et al (1992), “Detection of vancomycin resistance in Enterococcus species”, Journal of Clinical Microbiology, vol 30, no 7, pp 1621–1624 12 British Pharmacopoeia (2005), “The Stationary Office”, London, pp 2052053 13 Bates J (1997), Epidemiology of vancomycin- resistant Enterococci in the community and the relevance of farm animals to human infection Journal of Hospital Infection 37: 89-101 14 Dayang Fredalina Basri, Lee Wee Xian, Nur Indah Abdul Shukor, and Jalifah Latip (2014), “Bacteriostatic Antimicrobial combination: Antagonistic Interaction between Epsilon-Viniferin and Vancomycin against MethicillinResistant Staphylococcus aureus, Biomed Research International”, Article ID 461756, 8p 15 Demain A L (1981), “Industrial Microbiology”, Science 214, pp 987-995 16 European Pharmacopoeia (2004), “Council of Europe, Strasbourg”, 5th edition, pp 267-2673 17 Guoliang Yin, Weimin Wang, Sha Sha, Lei Liu and Xiaoping Yu (2010), “Inhibition and control effects of the ethyl acetate extract of Trichoderma arzianum fermented broth against Botrytis cinerea”, African Journal of Microbiology Research, Vol 4(15): 1647-1653 18 Hanan M Ibrahim, Elrashied E Elkhidir (2011), “Response Surface Method as an Efficient Tool for Medium Optimisation”, Trends in Applied Sciences Research 6: 121-129 19 Hyun HH, Jung HM, Kim SY, Lee JK, Yoo SR (2001), “Amycolatopsis orientalis mutant strain producing vancomycin and fermentation method of vancomycin using the same” Korean Patent 0421712.Jung HM, Kim SY, Moon 2019 HJ, Oh DK, Lee JK (2007), “Optimization of culture conditions and scale-up to pilot and plant scale for vancomycin production by Amycolatopsis orientalis” Applied Microbiology Biotechnology 77: 789-795 66 21 Jung HM, Kim SY, Hyun HH, Lee JK (2002), “Ca2+ and Cu2+ supplementation augments vancomycin production by Amycolatoppsis orientalis” Biotechnology Letters 24: 293 – 296 22 Kim S Y., Kim D S., Jung H M., Lee J K (2008), “Mutant strain of Amycolaptosis orientalis and process for preparing vancomycin hydrochloride”, European patent application EP 1959006A1 23 Lee J W, Jung Y T, Suh J W, Lee K S (2006), “Process of purifying vancomycin hydrochloride”, US Patent 7018814 24 Lessard I A D., Pratt S D., Mccafferty D G., B ussiere D E., Hutchins C., Wanner B L., Waslch L K (1998), “Homologs of vancomycin resistance DAla-D-Ala dipeptidase Van X in Streptomyces toyocaensis, Escherichia coli and Synechicystis: attributes of catalytic efficiency, stereoselectivity and regulation with implication for function”, Chemistry & Bioology 5(9), pp 489-504 25 Metzler K (2003), “Inhibition of bacterial cell wall synthesis” The University of Texas Medical Branch at Galveston: 45- 54 26 Nagarajan R (1991), “Antibacterial activities and modes of action of vancomycin and related glycopeptides”, Antimicrobiology Agents Chemotherapy 35, pp 605-609 27 Nagy M., Miklos J., Istvan F., Ilona V., Geza K., Viola M., Andrasi A., L aszlo K., Gabriella Z., Marta S.nee Z., Endre K., Agnes U., Mihaly G (1993), “Process for the preparation of vancomycin”, US patent 522341 28 Neda Z, Alireza A, Leonard L, Radu P (2002), “Application of response surface methodology in numerical geotechnical Analysis”, University of Newfoundland 29 Thomas Staroske, Dudley H William (1998), “Synthesis of Covalent head to tail dimers of vancomycin”, Tetrahedron letters 39: 4917- 4920 30 Sussmuth RD (2006), “The chemistry and biology of vancomycin and other glycopeptide antibiotic derivatives” Medicinal chemistry of bioactive natural products: 35-52 67 31 Vladimir B (1975), “Methods in Enzymology”, The University of Leningrad, Leningrad, VXLIII, pp 100-123 32 Wright G.(2005), Glycopeptide biosynthesis MAC Biochemistry 30: 1-3 33 Yong GE, Yongping L, Xue-ying P, Jin, Jian ZC, Jun RL (2003), “Vancomycin producing strain and optimization of the fermentation medium” Chinese Journal of Antibiotics 28(3): 134-143 Tài liệu internet 34 http://khoahoc.tv/congnghemoi/cong-nghe-moi/21911_cong-nghe-nano- trong-cuoc-chien-chong-sieu-vi-khuan.aspx 35 http://s4.zetaboards.com/BioFood_Tech/topic/8468077/1/ 36 http://www.cheap-vancomycin-vancocin.netfirms.com/ 37 http://www.cai.mcgill.ca/meded/drugdb/vancomycin/vancomycin_db.htm 38.http://s1.timtailieu.vn/2cc751c17fa866ad498152b45b1493f7/doc/2012/12/28/ chuong_3_cong_nghe_len_men_vi_sinh_vat_7pO8qlyyTQ_20121228023947_6 4820.pdf 68 PHỤ LỤC Các phƣơng án tối ƣu phần mền DX7 đề xuất STT Bột đao (g/l) CNM (g/l) HTKS theo lý thuyết (ĐKVVK, mm) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 25 30 20 30 20 23,619 20,565 26,998 25,957 28,613 22,192 24,562 24,215 29,75 20,101 22,471 24,887 21,296 24,95 27,038 28,277 27,635 20,916 28,765 24,947 27,982 28,244 25,205 21,387 27,373 22,017 20,059 21,924 23,889 27,221 7 5,3448 3,918 4,4052 4,9303 5,1748 3,394 3,1264 6,1616 3,1956 6,9192 4,1232 6,4336 5,694 6,6856 4,92 5,5064 4,7928 4,3524 5,2304 3,8328 3,8452 3,6236 4,1592 5,3868 6,8848 3,3228 5,9052 4,9864 4,5752 3,944415 3,614563 3,208647 3,730623 2,899507 3,966416 3,891844 3,665796 3,822762 3,905958 3,906953 3,388694 3,227302 3,845514 3,033053 3,815741 3,718781 3,883881 3,966565 3,842945 3,912472 3,970231 3,77632 3,78831 3,97358 3,629937 3,632406 3,519872 3,601702 3,972351 3,816751 3,106747 3,943726 3,925282 3,865112 69 Động thái trình lên men chủng xạ khuẩn S orientalis 4912 môi trƣờng tối ƣu STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Thời gian (giờ) 20 24 30 36 42 48 51 54 57 60 63 66 69 72 75 78 81 84 87 90 93 96 99 102 114 120 HTKS (mg/ml) 0 0 0,72 1,21 1,45 1,86 2,03 2,25 2,31 2,53 2,69 2,85 3,04 3,38 3,61 3,89 4,16 4,13 4,09 4,08 3,92 3,89 3,82 3,78 3,71 70 Sinh khối ƣớt (mg/ml) 1,38 2,69 4,46 5,98 7,74 12,73 14,92 16,2 17,49 18,95 20,47 21,2 22,52 23,75 24,84 25,64 25,49 25,45 25,32 25,3 25,28 25,3 25,31 25,27 25,26 25,24 pH 7,09 7,02 6,94 6,84 6,8 6,73 6,68 6,61 6,57 6,46 6,39 6,35 6,25 6,28 6,2 6,2 6,18 6,16 6,15 6,1 6,04 5,95 5,93 5,9 5,87 5,83 5,82 ... Nghiên cứu thu nhận chất kháng sinh vancomycin từ môi trƣờng lên men chủng xạ khuẩn S orientalis Mục tiêu nghiên cứu Thu nhận đƣợc chất kháng sinh vancomycin từ môi trƣờng lên men chủng xạ khuẩn. .. khuẩn S orientalis Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu tối ƣu môi trƣờng lên men vancomycin từ nguồn nguyên liệu nƣớc - Nghiên cứu chế độ lên men vancomycin theo mẻ lên men bán liên tục - Nghiên cứu. .. hưởng đến sinh tổng hợp kháng sinh xạ khuẩn Đa số chất kháng sinh đƣợc dùng xạ khuẩn sinh Sự sinh tổng hợp CKS xạ khuẩn phụ thu c vào nhiều yếu tố nhƣ thành phần môi trƣờng, điều kiện lên men *

Ngày đăng: 19/03/2017, 04:58

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan