Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng và định danh loài ở tập đoàn cây dó bầu (Aquilaria sp.) tại Hà Tĩnh (luận văn thạc sĩ)

Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng và định danh loài ở tập đoàn cây dó bầu (Aquilaria sp.) tại Hà Tĩnh (luận văn thạc sĩ)Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng và định danh loài ở tập đoàn cây dó bầu (Aquilaria sp.) tại Hà Tĩnh (luận văn thạc sĩ)Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng và định danh loài ở tập đoàn cây dó bầu (Aquilaria sp.) tại Hà Tĩnh (luận văn thạc sĩ)Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng và định danh loài ở tập đoàn cây dó bầu (Aquilaria sp.) tại Hà Tĩnh (luận văn thạc sĩ)Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng và định danh loài ở tập đoàn cây dó bầu (Aquilaria sp.) tại Hà Tĩnh (luận văn thạc sĩ)Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng và định danh loài ở tập đoàn cây dó bầu (Aquilaria sp.) tại Hà Tĩnh (luận văn thạc sĩ)Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng và định danh loài ở tập đoàn cây dó bầu (Aquilaria sp.) tại Hà Tĩnh (luận văn thạc sĩ)Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng và định danh loài ở tập đoàn cây dó bầu (Aquilaria sp.) tại Hà Tĩnh (luận văn thạc sĩ)Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng và định danh loài ở tập đoàn cây dó bầu (Aquilaria sp.) tại Hà Tĩnh (luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - - HOÀNG ĐĂNG HIẾU SỬ DỤNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG PHÂN TÍCH ĐA DẠNG VÀ ĐỊNH DANH LỒI Ở TẬP ĐỒN CÂY DĨ BẦU (AQUILARIA SP.) TẠI HÀ TĨNH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2012 MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU .4 Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan dó bầu .5 1.1.1 Đặc điểm phân loại vị trí phân bố dó bầu .5 1.1.2 Đặc điểm sinh trƣởng phát triển dó bầu 1.1.3 Giá trị kinh tế sinh thái dó bầu 1.1.4 Thực trạng trồng khai thác dó bầu nƣớc giới 10 1.1.5 Các nhân tố ảnh hƣởng tới khả tạo trầm nhân tạo 12 1.2 Một số phƣơng pháp sử dụng việc định danh loài xác định quan hệ di truyền 13 1.3 DNA barcode - quan điểm phân loại 15 1.3.1 Giới thiệu DNA barcode 15 1.3.2 Các đặc điểm trình tự barcode 16 1.4 Một số locus đƣợc sử dụng phƣơng pháp DNA barcode thực vật 17 1.4.1 Trình tự gen nhân 17 1.4.2 Vùng gen mã hóa ribosome 18 1.4.3 Trình tự gen luc lạp 18 1.4.4 Trình tự gen rbcL 20 1.4.5 Trình tự gen matK 20 1.4.6 Trình tự gen rpoB rpoC1 20 1.4.7 Trình tự gen ycf5 .21 1.4.8 Trình tự hai gen trnH - psbA 21 1.4.9 Trình tự hai gen trnL(UAA) - trnF(GAA) 22 1.5 Tình hình nghiên cứu DNA barcode thực vật 22 1.6 Một số kết nghiên cứu dó bầu Việt Nam giới 24 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 25 2.1.Vật liệu 25 2.1.1 Thực vật 25 2.1.2 Chủng vi khuẩn .26 2.1.3 Hóa chất 26 2.1.4 Máy móc thiết bị .26 2.1.5 Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu 27 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.2.1 Các bƣớc nghiên cứu .27 2.2.2 Các phƣơng pháp nghiên cứu 27 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Kết tách chiết tinh DNA tổng số 36 3.2 Tìm nhiệt độ gắn mồi đăc hiệu phản ứng PCR 37 3.3 Kết nhân gen với cặp mồi nghiên cứu 39 3.3.1 Kết nhân gen rbcL .39 3.3.2 Kết nhân gen rpoB .39 3.3.3 Kết nhân gen psbA-trnH .40 3.3.4 Kết nhân gen ITS .41 3.4 Kết tách dòng gen 41 3.4.1 Kết tinh sản phẩm PCR (thôi gel) .41 3.4.2 Kết chuyển gen vào vector tách dòng 42 3.4.3 Kết biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E.coli 42 3.4.4 Kết chọn lọc dòng tế bào mang gen tái tổ hợp 43 3.4.5 Kết tách chiết plasmid tái tổ hợp 44 3.4.6 Kết cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp 45 3.5 Xác định phân tích trình tự nucleotide đoạn DNA thị 46 3.5.1 Kết xác định phân tích trình tự gen trn-psbA 47 3.5.2 Kết xác định phân tích trình tự gen rpoB 49 3.5.3 Kết xác định phân tích trình tự vùng gen lục lạp rbcL 51 3.5.4 Kết xác định phân tích trình tự gen ITS .55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 MỞ ĐẦU Cây dó bầu (Aquilaria sp) loài thực vật đặc hữu nƣớc ta, phân bố rải rác từ Bắc tới Nam, tập trung nhiều tỉnh miền Trung đặc biệt Hà Tĩnh Quảng Nam Cây dó bầu mang lại giá trị kinh tế lớn với mục đích chủ yếu khai thác trầm hƣơng, mặt hàng có giá trị kinh tế cao sử dụng công nghiệp mỹ phẩm, dƣợc liệu, tôn giáo, chế tác đồ thủ công mỹ nghệ Ở nƣớc ta phát lồi dó bầu phân bố rải rác rừng rậm nhiệt đới thƣờng xanh, ẩm ngun sinh: A crassna (Dó bầu, Dó tía, Dó trắng), A baillonii (Dó Gạch), A rugosa (Dó Quả Nhăn), A malaccensis (Dó Mã Lai), A sinensis (Dó Trung Quốc), A banaensis (Dó Bà Nà) Trong A crassna lồi đƣợc trồng phổ biến có khả tạo loại trầm Kỳ tốt giới Tuy nhiên, lồi dó bầu Việt Nam bị lai tạp nhiều, công tác lựa chọn giống đƣa vào trồng dựa chủ yếu vào quan sát hình thái, theo kinh nghiệm cá nhân, dẫn đến suất chất lƣợng trầm thu đƣợc không ổn định Do vậy, việc chọn lọc giống ban đầu để đƣa vào triển khai quan trọng nhiệm vụ cấp thiết công tác bảo tồn, khai thác phát triển nguồn gen quý Hiện phƣơng pháp DNA barcode cơng cụ phục vụ định danh lồi xác, nhanh chóng, tự động hóa cách sử dụng vùng DNA chuẩn hay gọi thị DNA hay mã vạch DNA (DNA barcode) Việc xác định loài DNA thị có hiệu cao việc phân biệt lồi thực vật [16] có dó bầu Việt Nam [18] quan sát hình thái, sinh trƣởng phát triển chƣa đủ sở để định danh phân biệt loài Xuất phát từ yêu cầu đặt nhƣ định thực đề tài “Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử phân tích đa dạng định danh lồi tập đồn dó bầu (Aquilaria sp.) Hà Tĩnh.” Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan dó bầu 1.1.1 Đặc điểm phân loại vị trí phân bố dó bầu Cây dó bầu (Aquilaria sp.) lồi thực vật có giá trị kinh tế cao Ở Việt Nam, dó bầu phân bố rải rác từ Bắc tới Nam, có nhiều tỉnh miền Trung Cây dó bầu có nhiều tên gọi tùy theo địa phƣơng nhƣ: Trầm Hƣơng, Dó Trầm, Dó Bầu Hƣơng, Tóc [43] Cây dó bầu thuộc chi trầm Aquilaria, họ Thymeleaceae, Thymelaeales, lớp gỗ lớn Magnoliopsida, ngành Mộc Lan Magnoliophyta [41], [42] Hình 1.1 Lá dó bầu Chi Trầm Aquilaria gồm 24 lồi khác nhau, nhiên có 15 lồi có khả cho trầm hƣơng gồm: Aquilaria crassna; A baillonii; A sinensis A chinesis; A borneensis; A Malaccensi; A gollocha; A hirta; A rostrata; A beccariana; A cummingiana; A filaria; A khasiana; A microcarpa; A grandiflora; A bancana; A Rugosa Trong lồi A rugosa đƣợc TS Lê Công Kiệt TS Paul Kessler ngƣời Hà Lan phát năm 2005 [18] Trên giới, chi trầm phân bố chủ yếu khu vực nhiệt đới từ Ấn Độ đến Đông Nam Á miền Nam Trung Quốc Ở nƣớc ta, dó bầu phân bố rải rác rừng rậm nhiệt đới thƣờng xanh, rừng ẩm nguyên sinh thuộc tỉnh Tuyên Quang, Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, đặc biệt từ Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Quãng Ngãi, Bình Định, Ninh Thuận, Bình Thuận đến Tây Nguyên, An Giang, Kiên Giang đảo Phú Quốc [42] Trong số lồi có khả tạo trầm Aquilaria crassna lồi tiếng có khả tạo loại trầm kỳ tốt giới [5] 1.1.2 Đặc điểm sinh trưởng dó bầu Dó bầu loại gỗ thƣờng xanh, cao 20 - 30 m, đƣờng kính thân đạt 60 - 80 cm, thân thƣờng thẳng, đơi có rãnh dạng lịng máng, vỏ ngồi nhẵn, màu nâu xám, thịt vỏ màu trắng có nhiều chất xơ (cellulose), nứt dọc lăn tăn, dễ bóc tƣớc ngƣợc từ gốc lên, cành mảnh, cong queo, màu nâu nhạt, có lơng nhẵn, tán thƣa Lá đơn, mọc cách (so le), cuống dài - mm, phiến hình trứng, bầu dục thn đến mác thn, kích thƣớc - 15 x 2,5 - cm, mặt màu lục bóng, mặt dƣới nhạt có lơng mịn, gốc thon nhọn dần hay tù; chóp nhọn, thn nhọn, tận có mũi, gân bên 15 - 18 đôi, thay đổi thất thƣờng, rõ mặt dƣới Cụm hoa hình tán chùm tán, mọc nách đầu cành, cuống cụm hoa mảnh, dài - cm Hoa nhỏ, mẫu 5, đài hợp phần dƣới, hình chng, màu vàng lục, trắng nhạt vàng xám, phía ngồi có lơng thƣa; mặt gần nhƣ nhẵn, có 10 đƣờng gân rõ, tồn quả, thùy dài hình trứng thn, dài 12 - 15 mm Phần phụ dạng cánh hoa, gốc bầu có tuyến mật Quả nang gần hình trứng ngƣợc hình lê, dài cm, đƣờng kính 2,5 - cm, có lơng mềm, ngắn, có mang dài tồn tại, khơ nứt làm mảnh, thƣờng có hạt Mùa hoa vào tháng 8, chín vào tháng - 10 [3], [43] Dó bầu sinh trƣởng rải rác rừng thƣờng xanh ẩm nhiệt đới, nguyên sinh thứ sinh, sƣờn núi đất độ cao 50 - 1.000 m có lên tới 1.200 m so với mặt biển Ở nƣớc ta, dó bầu thƣờng phân bố rải rác sƣờn núi có độ dốc nhỏ, nƣớc Trong quần xã dó bầu thƣờng gặp gỗ lớn: Táu, Huỳnh , Gụ mật … Đơi gặp dó bầu mọc rừng thứ sinh loài Thánh thất, Mị lƣng bạc, Bƣởi bung, Mít nài Ràng ràng Dó bầu (A crassna) ƣa đất feralit điển hình, feralit núi phong hóa từ đá kết, đá phiến hay đá granit Lớp đất mặt trung bình hay mỏng, ẩm, chua gần trung tính (pH vào khoảng từ - 6) Tại Malaysia vùng Đông Bắc Ấn Độ, dó bầu (A malaccensis) phân bố rải rác, độ gặp khoảng 2,5 cá thể hecta Ở Đơng Bắc Ấn Độ, lồi dó bầu thƣờng mọc rải rác độ cao từ 200 - 700 m, đơi lên tới 1.000 m Dó bầu sinh trƣởng khu vực có lƣợng mƣa hàng năm thay đổi từ 1.500 6.500 mm, nhiệt độ trung bình tối đa năm 22 - 28oC Những kết quan sát vùng Đơng Bắc Ấn Độ cịn cho biết, loài phân bố chủ yếu rừng ẩm thƣờng xanh rừng thƣờng xanh, gặp rừng nửa rụng Tuy nhiên, thực tế, dó bầu trƣớc sau tái tạo trầm sinh trƣởng tốt nơi có độ cao dƣới 40 m so với mực nƣớc biển A malaccensis thích ứng với loại đất phong hóa nham thạch, loại đá biến tính, nhƣng sinh trƣởng tốt đất phong hóa từ sa thạch [42] Tại Malaysia, từ lâu đƣa dó bầu vào trồng trọt, quần thể rừng trầm A malaccensis 67 năm tuổi có chiều cao trung bình 27 m, đƣờng kính thân trung bình 38 cm Những dó bầu có độ trƣởng thành 80 năm tuổi miền Đơng Bắc Ấn Độ, có chiều cao 25 - 30 m, thân to có đƣờng kính 55 - 70 cm Ở miền Tây Bắc Ấn Độ (Arunachal Pradesh), quần thể trầm năm tuổi có chiều cao gần m, đƣờng kính thân gần 30 cm Cũng Tây Bắc Ấn Độ, chúng thƣờng bắt đầu hoa, kết thời kỳ đạt - năm tuổi Những cá thể có kích thƣớc trung bình cho suất hạt tốt, 1,5 kg hạt [42] Các khối trầm thƣờng đƣợc tạo thành thân cành lớn, chúng kết trình chuyển hố hoạt động bệnh lý nơi bị bệnh, bị thƣơng… Nấm thành phần có tác dụng hoạt động đó, ngồi trùng đục thân có mối liên hệ Có giả thuyết cho rằng, trƣớc tiên bị nấm gây bệnh chỗ bị thƣơng làm cho bị suy yếu, tiếp nấm thâm nhập vào tạo thành khối trầm Nhựa trầm sản phẩm từ hay nấm tạo ra? Lý giải diễn biến trình chuyển hóa để tạo thành hợp chất hóa học nhựa trầm vấn đề nan giải chƣa hiểu biết tƣờng tận [1] Đến xác định đƣợc nấm Cytosphaera mangiferae có trầm lồi A Malaccensis nấm Melanotus flavolives chứa khối trầm từ loài A sinensis [42] Hình 1.2 Hoa dó bầu 1.1.3 Giá trị kinh tế sinh thái dó bầu Giá trị kinh tế quan trọng dó bầu để khai thác trầm hƣơng Từ thời xa xƣa trầm hƣơng đƣợc coi sản vật quí hiếm, ngày trầm hƣơng lâm sản ngồi gỗ có giá trị thƣơng mại quốc tế lớn Trên giới trầm hƣơng đƣợc sử dụng để chƣng cất tinh dầu trầm, chất định hƣớng quan trọng ngành công nghiệp để sản xuất loại mỹ phẩm cao cấp Tinh dầu trầm có giá trị đặc biệt, đƣợc dùng công nghệ chế biến loại chất thơm, loại nƣớc hoa cao cấp, giá trị Trầm hƣơng sản phẩm văn hóa vật chất tín ngƣỡng tâm linh dân tộc Việt Nam tồn từ xa xƣa đến thời [9] Theo CITES (Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora - Công ƣớc buôn bán quốc tế loài động thực vật hoang dã nguy cấp) khối lƣợng mua bán trầm hƣơng thị trƣờng giới thời kỳ 1995 - 1997 khoảng 1.350 Giá mua bán trầm hƣơng đƣợc tính theo kg tùy thuộc vào chất lƣợng Giá bán trầm thị trƣờng Dubai (Arabia Saudi) vào năm 1993 giao động từ 27 đô la Mỹ/kg (loại thấp nhất) đến 10.000 đô la Mỹ/kg (loại tốt nhất) [11] Theo ƣớc tính Liên hiệp Khoa học sản xuất tinh dầu - hƣơng liệu mỹ phẩm Việt Nam năm từ 1980 đến 1990, khối lƣợng trầm hƣơng loại bị khai thác xuất từ nƣớc ta khoảng 300 Trong có 2.000 kg trầm từ loại - trị giá khoảng 1,5 triệu USD 300.000 kg Trầm loại - trị giá khoảng 4,5 triệu USD; đặc biệt 200 g kỳ nam loại - trị giá 0,5 triệu USD tới 2.800 kg kỳ nam loại - trị giá 2,52 triệu USD Với giá trị kinh tế cao, trầm hƣơng đem đến hứa hẹn triển vọng cho ngành sản xuất lâm nghiệp trồng dó bầu, tạo trầm hƣơng làm giá trị 1,5 - 1,8 tỷ đồng/ 10 năm, bình quân giá trị tạo 150 - 180 triệu/ ha/năm, lợi nhuận từ 50 - 60 % [11] Ngồi y học, trầm hƣơng đƣợc sử dụng để chữa số bệnh hiểm nghèo Theo Đông y, trầm hƣơng vị thuốc quý hiếm, có vị cay, tính ơn, vào kinh: tì, vị, thận; có tác dụng dáng khí, nạp thận, bình can, tráng ngun dƣơng, chữa bệnh đau bụng, đau ngực, nôn mửa, hen suyễn, lợi tiểu, giảm đau, trấn tĩnh, hạ sốt, cấm khẩu, thổ huyết, khó thở, kích dục… Theo tây y, trầm hƣơng có tác dụng kháng khuẩn, đặc biệt với loại khuẩn Mycobacterium tuberculosis Shigella flexneri, có tính khánh sinh, tạo kháng thể mạnh (diệt khuẩn, làm lành vết thƣơng), có tác dụng chữa số bệnh nhƣ bệnh tim mạch (suy tim, đau ngực), bệnh hô hấp (hen suyễn), bệnh thần kinh (an thần, ngủ, giảm đau, trấn tĩnh….), bệnh tiêu hố (đau bụng, buồn nơn, tiêu chảy), bệnh tiết niệu (bí tiểu tiện) Đặc biệt, dùng trầm hƣơng để chữa ung thƣ tuyến giáp [42] Cũng giống nhƣ số lâm nghiệp khác, dó bầu lâm nghiệp cung cấp nguyên liệu làm giấy có chất lƣợng cao Theo kết nghiên cứu thực nghiệm nhiều năm Trung tâm nghiên cứu lâm đặc sản thuộc Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam, dó bầu lồi thích nghi tốt với khí hậu nhiệt đới nóng ẩm mƣa nhiều cho suất khai thác cao, đƣợc ngành công nghiệp giấy xác định nguồn nguyên liệu dự án đầu tƣ phát triển sản xuất ngành từ đến năm 2010 [6] Bên cạnh mơi trƣờng sinh thái phát triển bền vững việc đƣa dó bầu vào cấu rừng với mục tiêu triệu hecta rừng tỉnh Hà Tĩnh nói riêng nƣớc nói chung góp phần thúc đẩy tăng độ che phủ rừng, chống xói mịn đất bảo vệ mơi trƣờng Đồng thời góp phần bảo tồn phát triển lồi đặc hữu, qúy hiếm, có giá trị khoa học kinh tế nƣớc ta Đây giải pháp phù hợp với quy luật sản xuất đôi với bảo vệ môi trƣờng, kết hợp lợi ích trƣớc mắt với lợi ích lâu dài, làm giàu sở khai thác tái tạo lợi đặc hữu, ƣu việt tài nguyên quốc gia Hơn nữa, dó bầu cịn có ý nghĩa tạo công ăn việc làm cho ngƣời lao động, mở hƣớng phát triển kinh tế bền vững cho nông thôn, vùng sâu vùng xa [5] 1.1.4 Thực trạng trồng khai thác dó bầu nước giới Với giá trị kinh tế cao nhu cầu ngày tăng nên giới nói chung Việt Nam nói riêng, trầm hƣơng tự nhiên bị khai thác đến cạn kiệt [13] Năm 1994, dó bầu đƣợc ghi cơng ƣớc quốc tế CITES quy định việc bn bán sinh vật có nguy tuyệt chủng [31] - Trong nước Theo thống kê ngành thƣơng mại, nƣớc ta từ năm 1986 - 1990 khai thác xuất khoảng 1.163,9 trầm hƣơng Nhƣng giống nhƣ nƣớc giới, số lƣợng ngày giảm sút, năm 1985 khai thác xuất 216,1 đến năm 1990 cịn 73,4 Do có giá trị kinh tế cao thành công ban đầu nghiên cứu tạo trầm dó bầu mà nay, dự án trồng dó bầu thu hút quan tâm địa phƣơng nƣớc Việc nhân giống dó bầu sản xuất trầm bền vững vấn đề cần thiết mặt kinh tế xã hội nhằm đem lại nguồn lợi lớn từ trầm hƣơng đồng thời góp phần bảo vệ mơi trƣờng ngăn ngừa tình trạng khai thác dó bầu tự nhiên Quyết định 16/2005/QĐ-BNN ngày 15/03/2005 Bộ NN-PTNT cho phép vùng sinh thái nƣớc đƣợc trồng rừng sản xuất dó bầu Kết vịng - năm gần diện tích dó bầu tăng nhanh góp phần đa dạng hóa loại trồng rừng đặc sản, hứa hẹn nhiều triển vọng lớn cho lâm nghiệp nói riêng kinh tế nói 10 lục lạp hệ gen có biến động cá thể thuộc loài gần 3.5.2 Kết xác định phân tích trình tự gen rpoB 49 Bảng 3.3 So sánh trình tự vùng gen lục lạp rpoB Trình tự đoạn gen phân tích đƣợc có kích thƣớc 510 bp có số vị trí sai khác 18 mẫu nghiên cứu, nhiên sai khác sai khác điểm nhỏ lẻ bắt nguồn từ sai khác trình PCR emzym Taq polymerase khơng có hoạt tính sửa chữa q trình PCR Phân tích trình tự đoạn gen rpoB cho thấy độ tƣơng đồng so sánh 18 mẫu dó bầu nghiên cứu 50 trình tự A.sinensis đƣợc đăng ngân hàng GenBank có độ tƣơng đồng cao (99,0 - 100%) Điều khẳng định tính bảo thủ hệ gen lục lạp thực vật 3.5.3 Kết xác định phân tích trình tự vùng gen lục lạp rbcL 51 52 Bảng 3.4 So sánh trình tự vùng gen lục lạp rbcL Đoạn gen phân tích đƣợc có kích thƣớc 734 bp phù hợp với kích thƣớc ban đầu, kết phân tích trình tự thấy xuất vị trí sai khác 18 mẫu dó bầu nghiên cứu đặc biệt vị trí 43 có thay đổi nucleotit A G với mẫu Dó bầu nghiên cứu AL2, AL6, AL8, M1, Qx, PQ64 so với 12 lồi dó bầu cịn lại Đây hai nhóm có xuất xứ cách xa mặt địa lý, mẫu AL2, AL6, AL8, M1, Qx, PQ64 có xuất xứ từ Lào Phú Quốc, mẫu lại có xuất xứ từ Hà Tĩnh Đây coi dấu hiệu để bƣớc đầu phân biệt 18 cá thể dó bầu mà nghiên cứu dù hệ số tƣơng đồng 18 mẫu cao ( 99,0 - 100% ) 53 Bảng 3.5 Vị trí sai khác dùng để phân loại đoạn gen vùng rbcL Vị trí sai khác STT Tên mẫu AL 02 G AL 06 G AL 08 G G1 A T1 A T2 A T3 A T4 A T6 A 10 T7 A 11 T8 A 12 T9 A 13 T 10 A 14 T 11 A 15 T 14 A 16 PQ64 G 17 Qx G 18 M1 G 43 54 3.5.4 Kết xác định phân tích trình tự gen ITS 55 56 Bảng 3.6 So sánh trình tự vùng gen ribosom ITS 57 Kết phân tích trình tự cho thấy gen ITS có kích thƣớc 655 bp, hệ số tƣơng đồng di truyền mẫu cao ( 91,1 - 100%) nhiên trình tự xác định đƣợc xuất nhiều sai khác có giá trị sử dụng để phân loại đặc biệt vị trí 196, 455, 536, 596 611, 612 Một số sai khác đƣợc liệt kê bảng 3.3 dƣới Bảng 3.7 Các vị trí sai khác dùng để phân loại đoạn gen vùng ITS STT Tên mẫu Vị trí dùng để phân loại 113 131 196 217 239 455 536 596 616 617 AL 02 C T T C C G A A G T AL 06 C T T C C G A A G T AL 08 C T T C C G A A G T G1 C T T C C G A A G T T1 T T C T T C G G A C T2 C T T C C G G G A C T3 T T C T T C G G A C T4 T C C T T C G G A C T6 C T T C C G A A G T 10 T7 C T T C C G A A G T 11 T8 C T T C C G A A G T 12 T9 C C T C C C A A G T 13 T 10 C T T C C G A A G T 14 T 11 C T T C C G A A G T 15 T 14 T C C T T C G G A C 16 PQ64 C T T C C G A A G T 17 Qx C T T C C G A A G T 18 M1 C T T C C G A A G T Với sai khác vị trí bổ xung thêm sở để xác định phân loại 18 mẫu dó bầu nghiên cứu 58 82 51 40 100 51 T7 QX A crassna AY920326 M1 Al8 A crassna AY920327 25 T11 T8 A sinensis FJ980392 38 A sinensis EF645836 G1 PQ64 47 Al6 Al2 83 A sinensis GQ891956 94 A sinensis EF645834 A sinensis EF645833 T6 64 86 T10 T9 T2 A yunnanensis EF645835 A rugosa AY920328 99 99 A rugosa AY920330 T1 T4 T3 T14 0.005 Hình 3.12 Cây phân loại kết mồi ITS Nhìn phân loại ta nhận thấy 18 mẫu dó bầu nghiên cứu chia thành nhóm lớn, với số bootstrap 80,5 Nhóm thứ nhât bao gồm mẫu AL2, AL6, AL8, G1, Qx, PQ64, M1, T6, T7, T8, T9, T10, T11 với A.crassna A sinensis, nhóm thứ hai bao gồm mẫu lại Các mẫu T1, T2, T3, T4, T14 phân thành nhóm phân loại riêng với so với loài A.crassna, A.sinensis, A.rugosa, A.yunasensis với số bootstrap 99,9%, kết luận mẫu khơng thuộc lồi Ở Việt Nam ngồi lồi cịn có lồi Dó Bà Nà (A.banacensis) Dó Mã Lai (A malacensis), nhiên trình tự hai loại chƣa đƣợc nghiên cứu Nhiều khả mẫu hai lồi cần sử dụng thêm thị khác mồi barcode khác để có kết luận xác Trình tự đoạn ITS mẫu T6, T7, T8, T9, T10, T11, mẫu M1, QX, PQ64, G1 thu thập Phú Quốc mẫu thu thập Lào khơng có khác biệt tin cậy (25-47%) so với trình tự loài A crassna A sinensis Từ kết phân tích chúng tơi nhận thấy mối tƣơng quan di truyền 18 mẫu dó bầu đƣợc nghiên cứu tƣơng đối cao, Chỉ số tƣơng đồng di truyền 59 khoảng (91,1-100%) Các mẫu dó bầu có mức độ đa dạng di truyền thấp, tính bảo thủ cao điều đƣợc chứng minh rõ ràng tiến hành nghiên cứu số thị hệ gen lục lạp nhƣ 60 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Đã tách chiết tinh đƣợc DNA tổng số 18 mẫu dó bầu có lồi Lào, mẫu thu Phú Quốc 11 mẫu thu Hà Tĩnh - Đã nhân thành công đoạn gen trnH-psbA, rbcL, rpoB, ITS phƣơng pháp PCR từ DNA tổng số 18 mẫu dó bầu - Đã xác định đƣợc trình tự nucleotide đoạn gen trnH-psbA, rbcL, rpoB, trnL 18 mẫu dó bầu - Xuất đƣợc sai khác gen nhiên gen trnH-psbA rpoB khó sử dụng để phân loại sai khác trình nhân - Với rbcL gen ITS tìm đƣợc sai khác có tính hệ thống có giá trị việc sử dụng để phân loại Kiến nghị - Tiếp tục sử dụng phƣơng pháp DNA bacode phân loại xác định loài Việt Nam - Sử dụng gen rbcL ITS vào việc xác định lồi dó bầu Việt Nam đồng thời tiến hành nghiên cứu với mồi barcode khác để tìm dấu hiệu xác định lồi khác nhằm phân loại cách xác cụ thể 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt `1 Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn (2002), Báo cáo tổng kết đề tài: “Nghiên cứu xác định phƣơng pháp tạo trầm tác nhân vi sinh dó bầu Aquilaria crassna”, Nha Trang Hoàng Cảnh (2006), Trầm hương loại tạo trầm hương, lợi ích, thách thức triển vọng Hội trầm hƣơng Việt Nam Danh lục loài thực vật Việt Nam, tập II, Viện sinh thái tài nguyên sinh vật, Trung tâm nghiên cứu tài nguyên môi trƣờng, NXB Nông nghiệp Bùi Công Khánh (2007), Bước đầu tìm hiểu chất tạo trầm nhân tạo dó bầu Aquilaria crassnatại Việt Nam, Nha Trang Thái Thành Lƣợm (2000), “Bảo vệ nguồn gen khai thác kết qủa tạo trầm nhân tạo trầm hƣơng”, Tạp chí khoa học phổ thơng - Liên hiệp hội khoa học kỹ thuật TP HCM, số 518 Đào Sỹ Sành, Nguyễn Huy Sơn, Cao Văn, “Báo cáo kết ánh giá sơ tiềm sản xuất bột giấy dó bầu”, Trung tâm nghiên cứu Lâm đặc sản, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, Viện Công nghiệp giấy Cenlulose Phạm Hồng Sơn (2006), Giáo trình kỹ thuật sinh học phân tử , Nhà xuất Đại học Huế, Huế Lê Duy Thành, Tạ Toàn, Đỗ Lê Thăng, Đinh Đoàn Long (2005), Di truyền học, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Tài liệu tiếng Anh Anton L (2007), Investigation of seed longevity and viability and cutting propagation for Aquilaria crassna, School of Marine and Tropical Biology James Cook University, Cairns 10 Aron J F., Kevin S B., Prasad R K., Sean W G., Steven G N., Brian C H., 62 Diana M P., Mehrdad Hajibabaei, Spencer C H B (2008), “Multiple multilocus DNA barcodes from the plastid genome discriminate plant species equally well” PLoS ONE, 3(7), pp 2802 11 Barden A., Awang A.N., Mulliken T., Song M (2000),“Heart of the matter: agarwood use and trade and CITES implementation for Aquilaria malaccensis” 12 Borsch T., Hilu K.W., Quandt D., Wilde V., Neinhuis C., Barthlott W (2003), “Noncoding plastid trnT-trnF sequences reveal a well resolved phylogeny of basal angiosperms”, J Evol Biol, (6), pp 558-576 13 Chakrabarty K., Kumar A., Menon V (1994) “Trade in Agarwood TRAFFICIndia Publications, New Delhi”, published by Avenash Dutta 14 Chase M W., Nicolas S., Mike W., James M D., Rao P K., Nadia H., and Vincent S (2005), “Land plants and DNA barcodes: short-term and longterm goals”, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 360 (1462), pp 1889-1895 15 CITES (2004), “Thirteenth Meeting of the Conference of the Parties Amendments to Appendices I and II of CITES” Bangkok, Thailand, 3-14 October 2004 unpublished 16 Gonzalez M A., Baraloto C., Engel J., Mori S A., Pe´tronelli P (2009), “Identification of Amazonian trees with DNA barcodes”, PLoS ONE 4(10), pp 7483 17 Harvey M., Botha F.C., (1996), “Use of PCR-based methodologies for the determination of DNA diversity between Saccharum varieties”, Euphytica, (89), pp 257-265 18 Kiet L., Kessler PJA and Eurlings M (2005), “A new species of Aquilaria (Thymelaceaceae) from Vietnam”, Blumea, (50), pp 135-141 19 Kress W J., Erickson D L (2008), “DNA barcodes: Genes, genomics, and bioinformatics”, Proc Natl Acad Sci U S A, 105(8), pp 2761-2762 63 ... phân tích đa dạng định danh lồi tập đồn dó bầu (Aquilaria sp.) Hà Tĩnh. ” Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan dó bầu 1.1.1 Đặc điểm phân loại vị trí phân bố dó bầu Cây dó bầu (Aquilaria sp.) lồi... có dó bầu Việt Nam [18] quan sát hình thái, sinh trƣởng phát triển chƣa đủ sở để định danh phân biệt loài Xuất phát từ yêu cầu đặt nhƣ định thực đề tài ? ?Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử phân tích. .. trợ xác sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử đại Các phƣơng pháp phân loại học phân tử xác định loài hƣớng nghiên cứu đƣợc phát triển mạnh giới nay, đƣợc xây dựng dựa việc nhận 13 biết thành phần