307

Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com MỞ ĐẦU Ở thể sinh vật, vật chất sống cấu tạo từ đại phân tử sinh học, quan trọng nucleic acid protein Các nucleic acid đóng vai trị quan trọng lưu trữ truyền đạt thông tin di truyền cho hệ sau Hơn nữa, thông tin biểu thể thông qua tạo thành phân tử protein Trong trình chép tổng hợp protein xuất nhiều biến đổi, nguồn gốc tiến hóa tính đa dạng sinh giới Vì việc tìm hiểu, phân tích phân tử DNA, RNA cần thiết Khi hiểu rõ cấu trúc, đặc điểm đại phân tử này, kết hợp với phát triển kỹ thuật, công nghệ tiến hành lai tạo, chọn giống mới, sản xuất hợp chất thứ cấp dùng y học, sản xuất chất kháng sinh… Có nhiều kỹ thuật ứng dụng công nghệ sinh học để nghiên cứu vật chất sống, điện di kỹ thuật hữu ích sử dụng nhằm phân tích, xác định tinh đoạn DNA cách dựa vào dịch chuyển chúng môi trường điện trường Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com NỘI DUNG I NGUYÊN TẮC CHUNG Điện di tượng dịch chuyển phân tử tích điện tác động điện trường, hay nói cách khác kỹ thuật phân chia phân tử DNA, RNA, protein dựa đặc điểm vật lý khối lượng hay điện tích thực chúng Khi phân tử tích điện đặt điện trường, chúng dịch chuyển cực (+) (-) tùy theo điện tích chúng Protein có điện tích thực dương âm, cịn nucleic acid có điện tích âm khơng đổi nhờ khung phosphate dịch chuyển hướng đến cực dương Các phân tử protein nucleic acid chạy điện di khuôn đỡ (support matrix) giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose polyacrylamide gel Tuy nhiên, kỹ thuật điện di giá rắn (agarose polyacrylamide) sử dụng phổ biến Kỹ thuật sử dụng dung dịch đệm để dẫn điện tạo điện trường đều, gel để phân tách phân tử chất nhuộm khác để phát vị trí phân tử gel sau điện di Trong đó, polyacrylamide gel dùng để phân tách phân tử protein phân tử DNA có chiều dài 100 oC sau làm lạnh; dạng gel xuất khoảng 40-45 oC Bản chất q trình đơng lại agarose phản ứng trùng hợp gắn nhiều gốc monomer tạo thành polymer nhờ nhiệt độ Các Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com chuỗi polymer liên kết chéo với tạo thành hệ thống mạng lưới với kích thước mắt lưới tùy thuộc vào nồng độ agarose phản ứng polymer hố Hình Cấu trúc hố học agarose cấu trúc agarose gel Nguyên tắc Các phân t nucleic acid có khố i lươ ̣ng và điê ̣n tić h khác đươ ̣c tách di chuyể n từ cực âm sang cực dươn g của ̣ điê ̣n di mô ̣t điê ̣n trường có điê ̣n thế và cường đô ̣ thích hơ ̣p Tốc độ dịch chuyển phân tử gel phụ thuộc vào kích thước, cấu hình phân tử, nồng độ gel, lực điện trường Điện di agarose gel xem phương pháp tối ưu dùng để phân tích, xác định tinh đoạn DNA Vị trí DNA gel xác định trực tiếp : băng DNA gel đươ ̣c nhuô ̣m ở nồ ng đô ̣ thấ p của thuố c nhuô ̣m huỳnh quang ethidium bromide (EtBr) có thể phát ánh sáng tử ngoại Các yếu tố ảnh hưởng 2.1 Kích thước của phân tử Các phân tử DNA có kích thước lớn (khối lượng phân tử lớn) tốc độ dịch chuyển chậm Các phân tử DNA mạch thẳng sợi đôi qua gel tố c đô ̣ tỷ lệ nghịch với hàm log10 khối lượng phân tử của chúng Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com đệm: 0,5 x TBE – 0,5 μg/mL EtBr điện di: V/cm 16 Log10 cặp nucleotide 0,5% 0,7% 0,9% 1,2% 1,4% Hình Mớ i quan ̣ giữa kích thước DNA và độ linh đô ̣ng điêṇ di của nó 2.2 Nồ ng độ agarose Đoa ̣n DNA mang kić h thước khác dich ̣ chuyể n ở các tố c đô ̣ khác qua các bản gel chứa các nồ ng đô ̣ agarose khác Bảng Các thông số điện di DNA bằng agarose gel Hàm lượng agarose (%) gel Kích thước DNA mạch thẳ ng (kb) sử du ̣ng có hiêụ quả 0,3 60-5 0,6 20-1 0,7 10-0,8 0,9 7-0,5 1,2 6-0,4 1,5 4-0,2 2,0 3-0,1 Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com A B C 2 Hình Điện di mẫu DNA giống nồng độ agarose khác A: 1%, B: 1,5% C: 2% Theo hình trên, dịch chuyển tập hợp đoạn DNA hai mẫu ba nồng độ khác agarose, tất chúng khay gel điện di điện áp thời gian xác định Kết cho thấy, đoạn lớn phân tách tốt gel 1%, đoạn nhỏ thích hợp với gel 2% 2.3 Cấ u hình của DNA Các DNA dạng vòng đóng, vòng đứt mạch thẳng có kh ối lượng phân tử sẽ dich ̣ chuyể n agarose gel ở các tố c đô ̣ khác DNA plasmid mạch vòng dịch chuyển nhanh DNA plasmid loại có dạng mạch thẳng Dạng vịng đứt Dạng vịng đóng DNA mạch vịng DNA mạch thẳng Hình Kết điện di với plasmid mạch vòng bên trái plasmid loại mạch thẳng bên phải Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com 2.4 Thành phần base và nhiệt độ Điê ̣n di của DNA agarose gel không bi ̣ảnh hưởng rõ bởi thành phầ n base của DNA hoă ̣c nhiê ̣t đô ̣ Trong agarose gel , tính linh động điện di tương đối đoạn DNA có kích thước khác không thay đổi kho ảng từ oC đến 30 oC Nói chung, agarose gel thường đươ ̣c cha ̣y ở nhiê ̣t đô ̣ phòng Phương pháp điện di 3.1 Thiết bị điện di Hình Cấu trúc thiết bị điện di agarose gel Thiết bị điện di agarose gel gồm phận bản: nắp, khay vận hành buồng điện di + Nắp: nắp có đầu dây cáp điện nối điện cực buồng điện di với nguồn điện + Khay vận hành bao gồm: khay đổ gel, khuôn đổ gel, lược Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com + Buồng điện di: nơi đặt gel trình điện di Buồng có rãnh để cài lược, hai điện cực tạo điện trường dung dịch 3.2 Đê ̣m pH Một số đệm điện di DNA thích hợp Tris-acetate-EDTA (TAE), Trisborate-EDTA (TBE) Tris-phosphate-EDTA (TPE) nồng độ khoảng 50 mM và pH 7,5-7,8 Trong đó, TAE sử du ̣ng nhiề u nhấ t , khả đê ̣m la ̣i thấ p Đê ̣m TBE TPE đề u có khả hòa tan tố t các đoa ̣n DNA và khả đê ̣m cao Các đoạn DNA dịch chuyển với tốc độ khác ba loại đệm Đệm giúp thiết lập giá trị pH, cung cấp ion để hỗ trợ cho độ dẫn Bảng Các loại đệm sử dụng phổ biến điện di Đệm Nồng độ dung dịch sử dụng Tris-acetateEDTA(TAE) 40 mM Tris 20 mM acetic acid mM EDTA Tris-borateEDTA (TBE) 89 mM Tris 89 mM boric acid mM EDTA Tris-phosphateEDTA (TPE) Dung dịch stock (1 lít) (50) 242 g Tris base 57,1 mL glacial acetic acid 100 mL EDTA 0,5 M (pH 8,0) (10) 108 g Tris base 55 g boric acid 40 mL EDTA 0,5 M (pH 8,0) 80 mM Tris- phosphate mM EDTA (10) 108 g Tris base 15,5 mL H3PO4 85% 40 mL EDTA 3.3 Quy trình điê ̣n di 3.3.1 Chuẩn bị agarose gel Có nhiều loại agarose khác thích hợp để chạy điện di , loại agarose dùng tố t nhấ t thí nghiê ̣m là type -II-agarose có nô ̣i thẩ m thấ u thấ p (low-endo- osmotic) Nó dễ dàng chảy và ta ̣o thành mô ̣t dung dich ̣ suố t , kế t quả là gel đàn hồ i thâ ̣m chí ở các nồ ng đô ̣ thấ p Tuy nhiên , type-II-agarose dễ bi ̣bẩ n b ởi sulphate polysaccharides (SP), nữa SP còn ức chế các enzyme ligase polymerase và RE Vì thế, đoạn DNA dung ly từ gel phải làm cẩn thận trước chúng dùng khuôn mẫu chất cho các enzyme này , Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com Cách tiến hành: Cho 1% type-II-agarose vào 100 mL đê ̣m 0,5 TAE Đun nồi khử trùng hoă ̣c lò vi sóng cho đế n agarose tan hoàn toàn Nế u quá trình đun nước nhiều phải thêm nước cho đủ 100 mL Để nguô ̣i khoảng 60oC và đổ vào bu ồng điê ̣n di có cài s ẵn lươ ̣c Chiề u dày gel khoảng mm là thích hơ ̣p Sau 30-40 phút, gel đã đông cứng, gỡ lươ ̣c 3.3.2 Đặt mẫu DNA vào giếng Tùy thuộc vào mục đích điện di khác sử dụng nồng độ DNA cao hoă ̣c thấ p Chẳ ng ̣n theo tỷ lê ̣ sau: DNA (1 g/1 µL ) : L Đê ̣m màu bromophenol (10 loading dye):1 L Nước cấ t lầ n: L Tổng số : 11 L Dùng micropipette hút 11 L dung dich ̣ cho vào giế ng Thường đă ̣t mẫu sau đã đổ dich ̣ đê ̣m 0,5 TAE vào buồng điê ̣n di cho ngâ ̣p gel, đă ̣t mẫu trước đổ đệm sau Thường dùng micropipette loại 20-200 L đặt bu ồng điê ̣n di bàn có nề n đen Khi tăng điện trình điện di, đoạn DNA lớn thường dịch chuyển nhanh so với đoạn nhỏ DNA dịch chuyể n từ cực âm đế n cực dương Quan sát sự d ịch chuyể n bằ ng màu bromophenol để biết lúc cầ n ngừng điê ̣n di 3.3.3 Nhuộm DNA bằ ng EtBr Phương pháp quan sát DNA agarose gel thuâ ̣n lơ ̣i nhấ t là dùng thuố c nhuô ̣m huỳnh quang EtBr Sau cha ̣y điê ̣n di xong lấ y nhe ̣ bản gel khỏi khuôn ngâm vào dung dịch EtBr nồ ng đô ̣ 0,5 g/mL, thời gian 30-45 phút, tố t nhấ t máy lắ c nhe ̣ (đơ ̣ 10 vịng/phút ) Đổ dịch nhuộm EtBr vào bin ̀ h riêng để xử lý và rửa gel cách ngâm nước cất hai lần, mỗi lầ n 15-20 phút EtBr thường pha sẵn ở da ̣ng đâ ̣m đă ̣c mg/mL và giữ 4oC tố i EtBr đươ ̣c dùng để phát hi ện DNA sơ ̣i đôi và RNA sơ ̣i đơn Tuy nhiên, lực (affinity) thuố c nhuô ̣m đố i với nucleic acid sơ ̣i đơn là tương đố i thấ p và có hiê ̣u Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com suấ t huỳnh quang không cao Sau nhuộm, EtBr xen vào base nucleic acid cho phép phát dễ dàng chúng gel Thường EtBr (0,5 g/mL) đươ ̣c đưa vào agarose gel đ ể phản ứng nhuộm xảy suốt trình điện di Mă ̣c dù tính linh đô ̣ng điê ̣n di của DNA sơ ̣i đơi mạch thẳng giảm có mặt thuốc nhuộm (khoảng 15%), khả xác đinh ̣ gel trực tiế p dưới ánh sáng UV suố t quá trin ̀ h ện di hoă ̣c ở giai đoa ̣n cuố i có ưu thế rõ rê ̣t Tuy nhiên , nế u cầ n có thể ch ạy điện di gel không có EtBr và chỉ nhuô ̣m DNA ho ặc RNA sau điê ̣n di xong Gel đươ ̣c ngâm đê ̣m điê ̣n di hoă ̣c H2O chứa EtBr (0,5 g/mL)/45 phút nhiệt độ phịng Vị trí gắn lược Dung dịch agarose gel Lược Giếng Băng dính b Gắn lược đổ agarose gel vào khuôn a Khuôn đổ gel c Lấy lược khỏi khuôn gel Nguồn điện di Micropipette Cable Đệm điện di Nắp Buồng điện di e Chạy điện di d Nạp mẫu DNA vào giếng Hình Sơ đồ minh họa bước trình điện di agarose gel 3.3.4 Quan sát và chụp ảnh Bản gel sau nhuộm EtBr quan sát ánh sáng tử ngoại nm) Dùng thiế t bi ̣chuyên du ̣ng đ ( = 302 ể phân tích lưu trữ hình ảnh DNA (Gel Documentation System) Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com (a) (b) Hình 7: Quan sát DNA dưới ánh sáng tử ngoại (a) hình ảnh điện di DNA agarose gel (b) 3.4 Một số phương pháp thu hồ i DNA từ agarose gel a) Dùng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp Mẫu agarose gel có nhiệt độ nóng chảy thấp chứa đoạn DNA quan tâm cắt khỏi gel cho vào đệm với tỷ lệ 1:1, bổ sung muối đến nồng độ 0,5 M, sau nóng chảy 70oC để hịa tan hồn tồn đệm Dung dịch gel có DNA chiết phenol/chloroform kết tủa Lưu ý DNA tách chiết phương pháp khơng thích hợp cho phương thức thao tác tiếp theo, diện nhân tố ức chế agarose Cho vào đệm với tỷ lệ 1:1 Agarose gel có nhiệt độ nóng chảy thấp Cắt Bổ sung muối đến nồng độ 0,5M Đoạn DNA quan tâm 70oC Dung dịch gel có DNA Chiết phenol/chloroform kết tủa Hình Sơ đồ tóm tắt trình thu hồi DNA quan tâm bằng cách dùng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp 10 Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com b) Ly tâm Mẫu agarose gel có chứa băng DNA quan tâm cắt cho vào đệm chiết, làm nóng để hịa tan hồn tồn, sau cho dung dịch gel lên lớp bơng thủy tinh silicon hóa đặt cột lọc nhỏ loại 0,5 ml Cột cho vào tube vi ly tâm loại 1,5 mL ly tâm tốc độ cao 10.000-15.000 rpm 10-15 phút DNA liên kết với màng dung dịch đệm qua lớp thủy tinh vào tube vi ly tâm Cho đệm rửa vào cột rửa cột vài lần cách ly tâm nhanh Thay tube vi ly tâm mới, cho đệm hòa tan DNA vào cột ly tâm để dung ly (elution) DNA khỏi màng vào tube Dung dịch DNA thu được tinh thêm cần Cũng đông lạnh mẫu gel trước dùng phương pháp ly tâm để cải thiện hiệu suất thu hồi DNA cho vào tube ly tâm agarose gel chứa băng DNA Cắt ly tâm 10.00015.000 rpm 10-15 phút Đoạn DNA quan tâm DNA liên kết với màng cho vào đệm chiết, làm nóng hịa tan hồn tồn rửa cột vài lần thủy tinh đặt cột lọc dung ly DNA khỏi màng Hình Sơ đồ tóm tắt trình thu hồi DNA quan tâm bằng cách dùng ly tâm c) Điện di vào bẫy * Cách 1: Một rãnh nhỏ cắt agarose gel phía trước băng DNA quan tâm Rãnh làm đầy glycerol gel điện di nhanh trở lại để chuyển DNA từ gel vào dung dịch glycerol (quá trình điện di 11 Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com kiểm sốt UV) Dung dịch glycerol-DNA sau chiết pipette * Cách 2: sau điện di, khe nhỏ cắt gel phía trước băng DNA quan tâm đặt khe mẫu giấy loại NA-45 Gel sau điện di trở lại băng DNA quan tâm dịch chuyển vào mẫu giấy Mẫu giấy sau rửa DNA dung ly đệm cách đun nóng mẫu giấy tới 70oC DNA sau tách chiết phenol kết tủa Cắt rãnh nhỏ trước băng DNA quan tâm Cắt rãnh nhỏ phía trước băng DNA quan tâm Đặt khe mẫu giấy loại NA-45 Làm đầy glycerol Điện di nhanh trở lại để chuyển DNA từ gel vào mẫu giấy Điện di nhanh trở lại để chuyển DNA từ gel vào dung dịch glycerol Rửa mẫu giấy dung ly DNA đệm Chiết dung dịch glycerol-DNA pipette Tách chiết DNA phenol kết tủa (b) (a) Hình 10 Sơ đồ tóm tắt q trình thu hồi DNA quan tâm bằng cách dùng điện di vào bẫy (a): cách 1, (b): cách d) Dùng hạt thủy tinh Mẫu gel quan tâm hòa tan dung dịch muối NaI nồng độ khoảng M Sau đó, hạt thủy tinh bổ sung vào dung dịch để liên kết hiệu với đoạn DNA phóng thích nồng độ cho NaI RNA, protein tạp chất khác không liên kết với hạt thủy tinh Tiếp theo, tiến hành rửa kết tủa tiểu thể, DNA tinh dung ly khỏi hạt thủy tinh đệm muối thấp Tuy nhiên, phương pháp nhanh hiệu lại có phạm vi tối ưu hẹp Thu hồi đoạn DNA nhỏ (500-800 bp) không hiệu đoạn lớn 12 Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com (>15 kb) liên kết với hạt thủy tinh khác sợi DNA bị phá vỡ suốt chu kỳ rửa Hòa tan gel dung dịch muối NaI (4 M) Rửa kết tủa tiểu thể Dung ly DNA khỏi hạt thủy tinh đệm muối thấp Bổ sung hạt thủy tinh vào dung dịch Tách chiết DNA phenol kết tủa DNA liên kết với hạt thủy tinh Hình 11: Sơ đồ tóm tắt q trình thu hồi DNA quan tâm bằng cách dùng hạt thủy tinh Ứng dụng điện di agarose gel Ước lượng kích thước phân tử DNA sau thực phản ứng cắt hạn chế (ví dụ: lập đồ hạn chế DNA tạo dịng…) Phân tích sản phẩm PCR (ví dụ: chẩn đốn di truyền phân tử in dấu di truyền…) Phân tách DNA hệ gen cắt hạn chế trước thẩm tích Southern, RNA trước thẩm tích Northern Ưu điểm nhược điểm * Ưu điểm phương pháp gel rót dễ dàng, khơng gây biến tính mẫu bền vững vật lý polyacrylamide Mẫu dễ thu hồi * Nhược điểm agarose gel bị nóng chảy q trình điện di, đệm bị tiêu hao, dạng khác nucleic acid chạy khơng ổn định II ĐIỆN DI POLYACRYLAMIDE GEL Acrylamide monomer có cấu trúc sau: CH2 = CH C NH2 O Khi có mặt gốc tự do, cung cấp ammonium persulphate ổn định TEMED (N, N, N', N'-tetramethylathylene-diamine), phản ứng chuỗi 13 Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com bắt đầu acrylamide monomer polymer hoá thành chuỗi dài CONH2 S2O42- CONH2 SO4- + nCH2 = CH nCH2 CH CONH2 CH2 CH TEMED Khi bisacrylamide (N, N'-methylenebisacrylamide) bổ sung phản ứng polymer hoá, chuỗi liên kết chéo để tạo thành dạng gel Độ xốp gel xác định chiều dài chuỗi mức độ liên kết chéo Mức độ liên kết chéo xác định kích thước lỗ, từ phân tách phân tử protein với kích thước khác Kích thước trung bình lỗ gel điều chỉnh cách thay đổi tỷ lệ acrylamide bisacrylamide Hình 12 Hình thành liên kết chéo Hình 13 Hình thành polyacrylamide gel 14 Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com Nguyên tắc điện di polyacrylamide gel Dùng để phân tách phân t protein, đoa ̣n DNA , kể RNA DNA/RNA Gel phải đươ ̣c rót vào giữa hai tấ m kính đươ ̣c ngăn cách bởi các miế ng đệm (gel spacers) để ngăn không cho polyacrylamide tiế p xúc vớ i không khí Gel có thể dài từ 10-100cm tùy thuô ̣c vào yêu cầ u phân tích và chúng thường đươ ̣c cha ̣y phương thẳ ng đứng Có thể đúc gel nồng độ khác polyacrylamide từ 3,5%- 20% tùy thuộc vào kích thước phân tử protein đoa ̣n DNA quan tâm Nồng độ thấp tạo lỗ có kích thước lớn phân tách phân tử lớn Liên kết chéo monomer tác nhân liên kết điều chỉnh để kiểm sốt mức độ xốp khuôn gel Điều cho phép tối ưu hóa khn gel để phân tách phạm vi kích thước đặc biệt phân tử protein Hình 14 Polyacrylamide gel Điện di acid nucleic Điện di polyacrylamide gel đươ ̣c dùng để phân tić h và thu h ồi các đoa ̣n DNA có chiều dài từ 5-2.000 bp Nồng độ polyacrylamide gel sử dụng khoảng từ 3,5-20% tùy thuộc vào kích thước đoạn DNA quan tâm Hai loa ̣i polyacrylamide gel thường đươ ̣c sử du ̣ng là: - Polyacrylamide gel không biế n tin ́ h dùng đ ể phân tách tinh đoa ̣n DNA sơ ̣i đôi - Polyacrylamide gel biế n tính b ằng urea formamide dùng để phân tách và tinh sa ̣ch các đoa ̣n DNA sơ ̣i đơn 15 Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com Trong đó, polyacrylamide gel khơng biến tính loại gel hay sử dụng Hiê ̣u phân tách DNA lo ại gel phu ̣ thuô ̣c vào nồ ng đô ̣ của acrylamide, kích thước điện tích DNA Bảng Hiêụ quả của sự phân tách DNA polyacrylamide gel không biế n tính Acrylamide (% w/v) Hiêụ quả phân tích (nucleotide) 3,5 1.000-2.000 5,0 80-500 8,0 60-400 12,0 40-200 15,0 25-150 20,0 6-100 Hình 15 Cấu trúc thiết bị điện di polyacrylamide gel 16 Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com 2.1 Phương pháp điện di polyacrylamide gel khơng biến tính 2.1.1 Chuẩn bị polyacrylamide gel khơng biến tính Kích thước phổ biến kính đổ gel thường 20 cm40 cm Miế ng đệm dày khoảng 0,5 mm-2,0 mm Các gel dày thường nóng lên q trình điện di nên làm nhịe băng DNA , ng ười ta thường sử dụng gel mỏng Tuy nhiên , khi cha ̣y mô ̣t lươ ̣ng lớn DNA (>1 g/băng) cần chuẩ n bi ̣gel dày 2.1.2 Các bước tiến hành: a) Chuẩn bị dung dịch: 30% acrylamide (gồ m bis-acrylamide), 1 TBE, 10% ammonium persulphate b) Lau sa ̣ch hai tấ m kính dùng làm khuôn gel và miế ng đê ̣m bằ ng KOH/methanol hoă ̣c ethanol Xử lý bề mă ̣t của hai tấ m kin ̣ silicon ́ h bằ ng dung dich để ngăn gel dính chặt vào hai kính gây rách gel lúc lấy khỏi khn sau điê ̣n di xong c) Tính tốn thể tích dung dịch dùng đ ể tạo polyacrylamide gel sở kích thước tấ m kính, đô ̣ dày của miếng đệm Bảng Dung tích của các chấ t dùng cho polyacrylamide gel Số mL của các nồ ng đô ̣ (%) khác Dung dich ̣ để chuẩn bị gel 3,5% 5,0% 8,0% 12,0% 20,0% 11,6 16,6 26,6 40,0 66,6 Nước 67,6 62,7 52,7 39,3 12,7 5 TBE 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 0,7 0,7 0,7 0,7 30% acrylamide (bao gồ m bis-acrylamide) 10% ammonium persulphate 0,7 d) Bổ sung 35 L TEMED vào mỗi 100 mL dung dich ̣ ta ̣o polyacrylamide gel, trô ̣n hỗn hơ ̣p bằ ng cách vortex Rót dung dịch tạo gel vào hai kính 17 Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com Gắ n nhanh lươ ̣c vào , tránh bọt khí lược (giế ng) Đỉnh của lươ ̣c phả i cao mép gel Nế u cầ n, bổ sung mô ̣t it́ dung dich ̣ ta ̣o gel để làm đầ y mép gel e) Cho phép acrylamide polymer hóa khoảng 60 phút nhiệt độ phịng, bở sung thêm dung dich ̣ ta ̣o gel nế u thấ y gel co vào nhiề u f) Sau polymer hóa hoàn toàn , rút lược cẩ n thâ ̣n , tháo băng dính khỏi đáy khn gel Gắ n khuôn gel vào bu ồng điê ̣n di và làm đầ y bu ồng điê ̣n di bằ ng đệm 1 TBE, dùng Pasteur pipette để phá bọt khí khỏi đáy gel giếng bằ ng đê ̣m 1 TBE g) Trô ̣n các mẫu DNA với m ột lươ ̣ng thić h hơ ̣p của đê ̣m 6 gel-loading dye Đặt mẫu vào giếng micropipette Hamilton syringe h) Nố i buồ ng điê ̣n di với bô ̣ nguồ n Polyacrylamide gel không biế n tính thường chạy điện di khoảng V/cm đế n V/cm Chạy gel thuốc nhuô ̣m chỉ thi ̣dich ̣ chuyể n đế n vi ̣trí mong muố n Tắ t nguồ n, lấ y khuôn gel và đă ̣t lên bàn Tháo kính nhỏ mặt trước , tấ m kính lớn ở phí a sau dùng làm giá đỡ chuẩn bị nhuộm gel Hình 16 Các bước chuẩn bị điện di 18 Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com 2.2 Phát hiện DNA polyacrylamide gel 2.2.1 Nhuộm bằ ng ethidium bromide Ngâm nhe ̣ gel dung dich ̣ nhuô ̣m (0,5 g/mL EtBr 1 TBE) Sau 30-45 phút, lấ y gel kính đỡ ra, cẩ n thâ ̣n thấ m khô bề mă ̣t gel b ằng giấ y thấ m Kimwipe Phủ lên bề mặt gel gi nylon (Saran wrap ), tránh tạo bọt khí hoă ̣c nế p gấ p của Saran wrap Quan sát chụp ảnh máy soi tử ngoa ̣i Polyacrylamide có thể là m mấ t huỳnh quang của EtBr , đó không thể phát hiê ̣n các băng DNA bằ ng phương pháp này nế u hàm lươ ̣ng của nó thấ p 10 ng 2.2.2 Nhuộm thuốc nhuộm bạc: Thuốc nhuộm bạc sử dụng hiệu để phát cho phép phát lượng protein dạng vết polyacrylamide gel lượng nhỏ nucleic acid (pg), nhạy gấp 1.000-10.000 lần phương pháp nhuộm EtBr Hai phương pháp nhuộm bạc thường sử dụng là: 1) Dùng dung dịch diamine silver hay ammoniacal silver cho thấm vào gel pha loãng dung dịch acid formaldehyde 2) Thấm dung dịch silver nitrate vào gel môi trường acid yếu dùng formaldehyde khử có chọn lọc ion bạc thành bạc kim loại điều kiện kiềm Phương pháp diamine kiềm nhạy thích hợp gel dày, phương pháp acid nhanh bắt màu tốt gel mỏng Quá trình nhuộm bao gồm bước sau: - Cố định nucleic acid acetic acid 7,5% tối thiểu phút để ngăn cản khuếch tán phân tử nucleic acid phân tách gel, loại bỏ trung hịa hóa chất khơng mong muốn (urea đệm) - Rửa gel nước khử ion tối thiểu phút để loại bỏ acetic acid, chất bẩn dạng vết phần thừa thành phần gel hòa tan sau cố định - Nhuộm gel dung dịch bạc với có mặt formaldehyde để cải thiện độ nhạy độ tương phản Thời gian nhuộm tối ưu khoảng 20 phút Tuy nhiên, loại gel có đỡ polyester (8×10 cm) cần 10 phút để có chất lượng hình ảnh cao mà không làm giảm độ nhạy - Rửa gel sau nhuộm bạc để loại bỏ thuốc nhuộm thừa gây kết tủa màu nâu trình phát triển màu 19 Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com - Phát triển màu gel hỗn hợp dung dịch sodium carbonate (4g/L), sodium thiosulfate (4 µM) formaldehyde để giảm background không đặc hiệu cách hiệu Nhiệt độ rửa thích hợp từ 8-10 oC, thời gian rửa thay đổi tùy vào thành phần dung dịch phát triển màu khoảng từ vài giây đến vài phút - Dừng phản ứng phát triển màu thu hình ảnh tối ưu nhanh tốt cách dùng acetic acid lạnh 7,5% Hình 17 Phát hiện DNA bằng thuốc nhuộm bạc 2.2.3 Phóng xạ tự ghi: DNA phát đồng vị phóng xạ 32P Cố định nucleic acid acetic acid 7,5% Sau đó, tiến hành rửa gel nước khử ion Dùng giấy thấ m Kimwipe để thấ m khô bề mă ̣t gel Tiếp theo, đánh dấu phóng xạ sấy gel 80oC điều kiện chân khơng từ 1-2 Ủ phim phóng xạ khoảng 24 giờ Quan sát kết 20 Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com Hình 18 Hình ảnh điện di DNA có đánh dấu 32P polyacrylamide gel phim X-quang 2.3 Phân lập các đoa ̣n DNA từ polyacrylamide gel Phương pháp tố t nhấ t để phân lâ ̣p DNA từ polyacrylamide gel là kỹ thuâ ̣t của Maxam Gilbert (1977) Ưu điểm phương pháp: + DNA thu đươ ̣c có đô ̣ tinh sa ̣ch cao + Phân lâ ̣p cả hai loa ̣i DNA sơ ̣i đôi và sơ ̣i đơn từ các polyacrylamide gel khơng biến tiń h và biến tính Phương thức sau đươ ̣c cải tiến từ kỹ thuâ ̣t của Maxam và Gilbert (1977): - Chạy điện di polyacrylamide gel Xác định vị trí DNA quan tâm phóng xạ tự ghi EtBr quan sát ánh sáng UV - Dùng dao cắt mảnh gel chứa băng DNA quan tâm Không loa ̣i bỏ Saran wrap khỏi gel trước cắ t , cắ t cả gel l ẫn Saran wrap, sau bóc mảnh gel nhỏ có chứa DNA quan tâm khỏi Saran wrap - Chuyể n gel vào E -tube (eppendorf tube), dùng tip micropipette để ép mảnh gel theo thành tube - Tính tốn thể tích thích hợp mảnh gel bổ sung1-2 thể tić h của đê ̣m chiế t vào E-tube - Đóng tube và ủ ở 37oC kèm theo lắ c vòng nhe ̣ Đoa ̣n DNA nhỏ (