Chuyên đề

Chuyên đề: ỨNG DỤNG KĨ THUẬT DI TRUYỀN Chủ đề CÁC PHƯƠNG PHÁP, KĨ THUẬT PHÂN TỬ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ QUAN HỆ TIẾN HÓA Ở SINH VẬT Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Xuân Viết Học viên : Nguyễn Thị Hải Yến Mã HV : k24 0393 MỞ ĐẦU Sinh vật trái đất biểu đa dạng, phong phú kiểu gen kiểu hình Nguồn gốc tính đa dạng phong phú vốn gen quần thể Đa dạng di truyền sinh vật đặc tính sinh vật Sự đa dạng kiểu hình tính đa hình kiểu gen quy định có tương tác kiểu gen với mơi trường Tính đa dạng di truyền sinh vật biểu nhiều hình thức khác như: - Đa dạng kiểu hình: tính trạng hình thái: hình dạng, màu sắc đa dạng tính trạng số lượng, - Đa dạng phân đoạn DNA - Đa dạng trình tự nucleotide gen - Đa dạng thành phần protein - Đa dạng trình tự amino acid… Người ta sử dụng nhiều phương pháp khác để đánh giá tính đa dạng di truyền sinh vật phân tích mối quan hệ tiến hóa lồi Có thể sử dụng phương pháp phân tích tính đa dạng kiểu hình như: Phương pháp phân tích đa dạng tính trạng hình thái, Phương pháp phân tích đa dạng tính trạng số lượng NTSYS… Tuy nhiên để có kết với độ tin cậy xác người ta thường sử dụng phương pháp ứng dụng kĩ thuật di truyền phân tử để phân tích đa dạng di truyền quan hệ tiến hóa sinh vật Điển hình phương pháp phân tích đa dạng phân đoạn ( sử dụng RFLP, RAPD, SSR) phương pháp phân tích đa dạng cấu trúc gen (sử dụng giải trình tự) NỘI DUNG PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG DỰA TRÊN CÁC PHÂN ĐOẠN DNA (RFLP, RAPD, SSR) * Cơ sở phương pháp là: - Phân tích đa dạng sinh vật mức DNA dựa sở xuất phân đoạn DNA từ RFLP, RAPD, SSR - Các cá thể khác nhau, cấu trúc DNA khác biểu trình tự nucleotide đoạn DNA khác Chính vậy, dựa vào khác phân đoạn DNA mà đánh giá mức độ đa dạng sinh vật *sự xuất phân đoạn DNA từ RFLP, RAPD, SSR thống kê theo hệ nhị phân (1, 0) * cuối liệu xử lý theo quy trình ( VD: quy trình xử lý liệu NTSYS) Phân tích số liệu RAPD, SSR, RFLP thực máy vi tính theo chương trình NTSYSpc Version 2.0 (Applied Biostatistisc Inc., USA., 1998) Với mục tiêu xác định giống khác cấu trúc DNA phạm vi phân tích đoạn; xác định đa hình phân đoạn DNA; tìm quan hệ di truyền đối tượng nghiên cứu Nguyên tắc xử lý số liệu gồm bước sau đây: Bước 1: So sánh cặp đối tượng nghiên cứu cách tính tốn khoảng cách quan hệ chúng Bước 2: Lập ma trận gồm tất giá trị tính tốn trước Bước 3: Giải ma trận biễu diễn thành biểu đồ đặc trưng Các bước phân tích thực sau: Nhập số liệu bảng thống kê band điện di sản phẩm RAPD vào bảng tính NTEDIT - Xử lý kết NTSYS Kết xử lý số liệu thể bảng hệ số tương đồng di truyền sơ đồ hình PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DNA BẰNG RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism-RFLP)- Kỹ thuật đa hình độ dài đoạn cắt hạn chế (RFLP) a Giới thiệu chung RFLP - Kỹ thuật RFLP kĩ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài phân đoạn DNA dựa điểm cắt enzim Trong kỹ thuật đa hình độ dài đoạn cắt hạn chế (Restriction Fragment Length Polymorphism-RFLP), đa hình DNA xác định cách lai đoạn dò DNA (DNA probe) đánh dấu với DNA sau cắt hạn chế enzyme cắt hạn chế thấm truyền lên màng lai phương pháp Southern Kết tạo hình ảnh phân đoạn DNA khác Các hình ảnh phân đoạn DNA khác I được tạo nên thay thế, thêm vào hay bớt nucleotide đa hình nucleotide đơn Kỹ thuật RFLP tiến hành theo bước: cắt DNA vài enzyme cắt hạn chế; phân đoạn DNA sau phân tách gel agarose thấm truyền lên màng lai Việc xác định phân đoạn DNA tiến hành lai phân đoạn DNA với đoạn dị đánh dấu huỳnh quang phóng xạ để phát phản ứng huỳnh quang phim chụp phóng xạ (hình 1).  PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH DNA BẰNG RAPD (Random Amlified Polymorphic DNA=RAPD) a Giới thiệu chung RAPD - Năm 1990, Wiliam cs phát triển kỹ thuật RAPD dựa sở kỹ thuật PCR Phản ứng RAPD dựa nguyên tắc PCR, phản ứng nhân đoạn DNA cách ngẫu nhiên vị trí DNA nhờ mồi (primers) ngẫu nhiên có kích thước 10bp - Thành phần phản ứng RAPD gồm có DNA mẫu, mồi (dài 10 base), Taq polymerase (enzyme chịu nhiệt tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus), bốn loại deoxirinucleotide triphotphate (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), ion Mg2+ dung dịch đệm - RAPD có từ 40-45 chu kỳ, chu kỳ gồm giai đoạn: (i) Giai đoạn tách chuỗi DNA: DNA bị biến tính từ dạng sợi kép thành dạng sợi đơn nhiệt độ 940-950C khoảng thời gian ngắn; (ii) Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ phản ứng hạ thấp xuống 320-400C cho phép mồi gắn vào DNA mẫu vị trí tương đồng theo nguyên tắc bổ sung (A - T, G - C ); (iii) Giai đoạn kéo dài: nhiệt độ 720C Taq polymerase hoạt động kéo dài đoạn DNA từ đoạn mồi hai đoạn DNA Kết tạo 240 -245 đoạn DNA nhân - RAPD khác PCR chỗ nồng độ Mg2+ thành phần phản ứng cao hơn, mồi đơn ngắn (10bp) tiếp hợp nhiều vị trí DNA kết nhân số đoạn DNA từ phân đoạn DNA trở lên Mỗi đoạn DNA nhân có kích thước từ 100 – 5000 bp - RAPD gọi kỹ thuật phân loại phân tử, sử dụng để phân tích xác định mối quan hệ thân thuộc giống trồng hay cá thể, phục vụ cho công tác lai tạo giống phân loại Ưu điểm kỹ thuật nhanh, rẻ, đơn giản giúp xác định tính đa dạng sinh học, nguồn gốc quan hệ di truyền giống động vật, thực vật, vi sinh vật Ưu điểm kỹ thuật RAPD không cần biết trình tự đoạn DNA cần nghiên cứu, quy trình tiến hành nhanh, cần lượng nhỏ DNA khn Tính đa dạng thu từ thị RAPD đánh giá cao so với kỹ thuật RFLP cho phép phát tính đa dạng đoạn chứa trật tự nucleotide lặp lại Nhược điểm thị là, RAPD có tính chất trội, gen điều khiển tính trạng có tính lặn khó tìm thấy đa hình gel điện di Các nghiên cứu cho thấy RAPD kỹ thuật có hiệu việc xác định kiểu gen, phân tích quần thể nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền loài lập đồ di truyền Kỹ thuật RAPD sử dụng để nhận biết phân loại giống khác nhau, đa dạng di truyền đối tượng - Dựa xuất hay không xuất phân đoạn DNA điện di sản phẩm RAPD đánh giá theo quy ước = xuất = không xuất Một bảng gồm giá trị thiết lập từ cá thể nghiên cứu cho phép tính hệ số tương đồng di truyền cặp đối tượng theo Nei Li Trong q trình thiết lập mối quan hệ lồi hay nhóm lồi, Apostol cs (1993) xây dựng kỹ thuật phân nhóm thơng qua biểu đồ RAPD (RAPDLOT) - Thực chất kỹ thuật gồm bước: (1) So sánh cặp đối tượng nghiên cứu cách tính tốn khoảng cách quan hệ chúng; (2) Lập ma trận gồm tất giá trị tính tốn trước đó; (3) Giải ma trận biểu diễn thành biểu đồ đặc trưng - Ngày nay, nhà nghiên cứu thiết lập phần mềm máy tính để tự động vẽ nên biểu đồ mối quan hệ hay độ tương đồng di truyền đối tượng nghiên cứu sở phản ứng RAPD Sau nhập liệu phân đoạn DNA nhân cá thể, chương trình máy tính tự động thiết lập hệ số đồng dạng di truyền lập biểu đồ hình Biểu đồ hình thể mức độ gần cấu trúc DNA cá thể, cho phép đánh giá mối quan hệ di truyền cá thể nghiên cứu Chương trình cho phép giảm bớt thời gian nghiên cứu có độ xác cao nên phần mềm có hiệu việc phân tích kỹ thuật RAPD - RAPD sử dụng để phân tích đa dạng cấu trúc DNA, xác định thị phân tử RAPD sở cho việc thực phân loại phân tử RAPD b Phân tích sản phẩm RAPD - Sản phẩm RAPD điện di gel agarose 1,5% đến 4% với thang DNA chuẩn chụp ảnh ánh sáng đề cực tím Căn vào thang DNA chuẩn kết nhân đoạn DNA, thống kê đoạn DNA theo kích thước phân tử xử lý RAPD phần mềm chuyện dụng - Phân tích RAPD cung cấp thơng tin tính đa dạng di truyền mức DNA mối quan hệ di truyền đối tượng nghiên cứu làm sở cho chọn giống c Phân tích đa dạng di truyền mức DNA kỹ thuật RAPD - Mục tiêu kỹ thuật RAPD xác định giống khác cấu trúc DNA phạm vi sử dụng mồi Xác định đa hình phân đoạn DNA tìm mối quan hệ di truyền đối tượng nghiên cứu lập đồ thị RAPD - Sử dụng kỹ thuật RAPD để phân tích tính đa dạng di truyền thiết lập quan hệ di truyền đối tượng nghiên cứu, người ta tiến hành theo bước sau đây: - (1) Chiết rút DNA xác định hàm lượng độ tinh DNA (2) Tập hợp mồi ngẫu nhiên (10bp) (3) Thăm dò điều kiện phản ứng chu trình nhiệt, nồng độ dung tích thành phần phản ứng (4) Sàng lọc mồi ngẫu nhiên để tạo danh sách mồi cho kết đa hình (5) Thực phản ứng RAPD với tất mồi sàng lọc (6) Điện di kiểm tra sản phẩm RAPD (7) Thống kê band điện di (xuất hiện: số 1, không xuất hiện: số 0) (8) Lập bảng xác định phân đoạn RAPD đặc trưng cho đối tượng nghiên cứu (9) Xác định giá trị PIC, số phân đoạn đơn hình, phân đoạn đa hình tỷ lệ % phân đoạn đa hình (10) Xác định hệ số đồng dạng di truyền giá trị tương quan kiểu hình (r) (11) Thiết lập sơ đồ hình (Dendrogram) xác định quan hệ họ hàng đối tượng nghiên cứu d Ví dụ: Sử dụng kỹ thuật RAPD để phân tích hệ gen 12 giống đậu tương địa phương, sàng lọc với 20 mồi ngẫu nhiên xác định hệ số giống sơ đồ hình mơ tả mối quan hệ di truyền giống đậu tương Hình Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M6 12 giống đậu tương địa phương miền núi (1- SL1; 2-SL2; 3-SL3; 4-SL4; 5-VMK; 6-QH; 7-CB4; 8-VCB; 9-LS; 10-HL; 11-CV; 12-TL) Từ hình ảnh điện di 12 giống đậu tương với 20 mồi, thống kê phân đoạn DNA nhân không nhân Sử dụng chương trình NTSYS pc xác định hệ số giống cặp giống đậu tương sơ đồ hình mối quan hệ giống đậu tương nghiên cứu Hình Sơ đồ hình mô tả mối quan hệ di truyền giống đậu tương địa phương II PHÂN TÍCH ĐA DẠNG TRONG CẤU TRÚC GEN - Sự đa dạng cấu trúc gen thể khác kích thước số lượng, thành phần, trình tự nucleotit gen Sự đa dạng cấu trúc gen sở để đánh giá tính đa dạng di truyền mức phân tử - Sư đa dạng đối tượng nghiên cứu cịn thể trình tự nucleotide Bằng cách so sánh trình tự nucleotide gen xác định khoảng cách di truyền đối tượng nghiên cứu Thiết lập sơ đồ hình thể mối quan hệ đối tượng - Quy trình phân tích đa dạng cấu trúc gen: (1) Thu thập thông tin gen đích thiết kế cặp mồi PCR nhân gen; (2) Phân lập gen đích đối tượng nghiên cứu; (3) Tách dịng giải trình tự gen; (4) So sánh trình tự gen, lập bảng ma trận hệ số tương đồng hệ số khác Thiết lập sơ đồ hình đối tượng dựa liệu gen; (5) So sánh trình tự protein gen, lập bảng ma trận hệ số tương đồng hệ số khác Thiết lập sơ đồ hình đối tượng dựa liệu protein; PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ Khái niệm Phân tử DNA chuỗi xoắn kép mạch đơn cấu tạo từ loại nucleotide khác nhờ base chúng, là: A, C, G, T nucleotide nối kết liên tiếp với theo thứ tự xác định Giải trình tự gen tức phát thứ tự xếp loại nucleotide phân tử DNA Các phương pháp giải trình tự gen a Phương pháp hóa học giải trình tự DNA - - Vào năm 1977, Maxam Gilbert phát minh phương pháp hóa học để giải trình tự đoạn DNA Nguyên tắc phương pháp (1) Trước hết phải đánh dấu đầu đoạn DNA cần phải giải trình tự gốc phospho đồng vị phóng xạ (P32) (2) Xử lý đoạn DNA đánh dấu với chất hóa học làm biến đổi đặc hiệu hai loại base nucleotide đoạn DNA Ví dụ : dimethylsulphate để biến đổi G thêm gốc methyl vị trí thứ 7(N7) Hydrazine làm biến đổi T C Hydrazine NaCl để làm biến đổi C Axit để làm biến đổi G A NaOH để làm biến đổi A C ( ưu tiên A hơn) Như giai đoạn này, phải dùng ống nghiệm ống nghiệm, DNA xử lý với lượng giới hạn chất hóa học nêu để ống nghiệm có chứa đoạn DNA mà đoạn DNA có vị trí nucleotide đặc hiệu với chất hóa học bị biến đổi (3) Các nucleotide bị biến đổi bị lấy khỏi mạch khung đường – phosphate đoạn DNA nhờ tách đoạn mạch đơn có đầu đánh dấu P32 đầu bị phân tử base phân tử bị lấy khỏi mạch khung (4) Thực điện di mẫu DNA xử lý ống nghiệm hàng gel polyacrylamide biến tính để mạch đơn mẫu di chuyển gel khơng bị biến đổi q trình điện di Nhờ đó, sau hồn tất điện di, mạch đơn bị dừng vị trí khác nhau, tùy thược vào mạch đơn dài hay ngắn khác nhau, theo hàng dọc suốt chiều dài gel Áp gel điện di phim nhạy tia X, vị trí dừng lại mạch đơn gel điện di tạo thành vạch phim vị trí bị đánh dấu phóng xạ mạch đơn có đầu đánh dấu P32 từ vạch phim xạ ký tự ghi này, đọc trình tự nucleotide đoạn DNA Phương pháp hóa học xác định trình tự DNA Maxam Gilbert thực tế khơng phải dễ thực cần phải xác định nhiều thông số tối ưu cho thí nghiệm, khó phải xác đinh nồng độ giới hạn chất hóa học cho xử lý mẫu DNA - - - đoạn DNA có base bị biến đổi để ứng với vị trí base bị biến đổi có mạch đơn có đầu đánh dấu P32 tách Chính phức tạp này, phương pháp Mẫm Gilbert sử dụng, mà thay vào nhà khoa học dùng phương pháp enzyme với nhiều ưu điểm vượt trội b Phương pháp enzyme giải trình tự DNA Phương pháp enzyme Sanger cộng phát minh vào năm 1977, ngày hôm phương pháp ngày hoàn thiện thực dễ dàng phịng thí nghiệm Nguyên tắc chung phương pháp tóm tắt sau + Trước hết chèn đoạn DNA cần phải xác định trình tự vào vector phage hay plasmid vị trí mà trình tự chuỗi vị trí xác định rõ Chuyển thể tức đưa vector mang đoạn chèn DNA vào tế bào vi khuẩn để nhân vector thành nhiều sao, sau tách chiết tinh khiết vector từ khuaản để thành vector tự + Dùng đoạn mồi bổ sung cách đặc hiệu với trình tự vector vị trí chèn đoạn DNA Thêm vào ống phản ứng men DNA polymerase loại nucleotde tự (gọi dNTP) lượng giới hạn nucleotide tận(ddNTP: dideoxynucleotide triphosphate, tương tự dNTP có loại ddNTP tương ứng ddATP, dd TTP, dd CTP, dd GTP) +Phản ứng thực ống, ống cho loại dd NTP khác +Bắt đầu từ đoạn mồi, men DNA polymerase kéo dNTP vào để tổng hợp mạch đơn bổ sung với mạch DNA chèn vector, tổng hợp mạch đơn bị dừng lại vị trí mà ddNTP kép vào thay dNTP +Lý tổng hợp bị dừng lại ddNTP có cấu trúc hóa học bị gốc OH vị trí cacbon thứ đường deoxyribose, mà gốc OH vị trí nơi để dNTP gắn vào Nhờ ống phản ứng có mạch đơn DNA có chiều dài khác tương ứng với vị trí trình tự nucleotide đoạn DNA gốc Để giải trình tự, người ta dùng phương pháp điện di gel polyacrylamide biến tính Với phương pháp đánh dấu mồi hay dNTP đồng vị phóng xạ P32 hay S35 sau điện di, giống phương pháp Maxam Gilbert, người ta phát vạch điện di kỹ thuật xạ lý tự ghi, từ vạch giải trình tự đoạn DNA c Giải trình tự máy tự động Các phịng thí nghiệm dùng phản ứng giải trình tự phương pháo enzyme, làm giải trình tự thường dùng máy tự động khơng dùng kỹ thuật xạ lý tự ghi trước - Để thực giải trình tự máy tự động mạch DNA đơn sản sinh ống phản ứng giải trình tự phải đánh dấu huỳnh quang để vạch điện di mạch đơn phát sáng qua chum tia sáng laser - Cấu tạo máy tự động giải trình tự gồm hai phần yếu, + phần điện di với gel polyacrylamide: gel hay ống mao quản chứa gel + phần phát vạch điện di: mắt cảm quang chum tia laser qua trước - Nguyên tắc hoạt động máy suốt q trình ddienj di, có vạch điện di qua chum tia laser vạch điện di phát sáng lên phát sáng mắt cảm quang ghi nhận lưu lại thành đỉnh cường độ sáng biểu đồ từ biểu đồ đỉnh cường độ sáng này, máy so dòng đỉnh tương ứng với màu để cuối phân tích thành trình tự đoạn DNA Với máy hệ sau này, người dùng màu huỳnh quang khác để đánh dấu loại ddNTP, nhờ phản ứng giải trình tự thực ống nghiệm giải trình tự cần điện di hàng mà không cần phải hàng khác trước Ví dụ TÁCH DỊNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN CP CỦA CymMV VÀ ORSV GÂY BỆNH TRÊN PHONG LAN Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM Nguyễn Thị Minh Hằng, Bùi Văn Thắng, Phạm Bích Ngọc, Chu Hồng Hà Viện Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *chuhoangha@ibt.ac.vn - ... phẩm RAPD - Sản phẩm RAPD điện di gel agarose 1,5% đến 4% với thang DNA chuẩn chụp ảnh ánh sáng đề cực tím Căn vào thang DNA chuẩn kết nhân đoạn DNA, thống kê đoạn DNA theo kích thước phân tử