Pseudomonas fluorescens và sắc màu gây độc

Pseudomonas fluorescens và sắc màu gây độc

ĐỀ TÀI GVHD: Ks Phạm Minh Nhựt Nhóm 13_07DSH02 Lê Tuấn Tú Nguyễn Thanh Xuân Nguyễn Thị Hồng Nhƣ Nguyễn Thị Xuân Kiều - 2010 - MỤC LỤC Phần I: Tổng quan Pseudomonas fluorescens 1.1.Lịch sử phát 1.2.Phân loại 1.2.1 Giới thiệu chung Pseudomonas fluorescens 1.2.2 Pseudomonas fluorescens 1.3.Đặc điểm 1.3.1 Đặc điểm chung 1.3.2 Đặc điểm sinh hóa 1.4.Cấu trúc tế bào 1.5.Cơ chế hoạt động Pseudomonas fluorescens 1.5.1 Đối với thực vật 1.5.1.1 Vi sinh vật đối kháng 1.5.1.2 Gây hại trồng 1.5.2 Đối với động vật 1.5.2.1 Dấu hiệu bệnh 1.5.2.2 Phòng trị 1.5.3 Đối với thực phẩm 1.5.3.1 Pseudomonas fluorescens gây hư hỏng bề mặt thịt 1.5.3.2 Pseudomonas fluorescens gây hư hỏng nhiều loại thực phẩm 1.5.4 Pseudomonas ảnh hưởng đến vi khuẩn Listeria 1.5.5 Bệnh học 1.6.Bệnh triệu chứng 1.7.Ứng dụng Pseudomonas fluorescens 1.7.1 Sản xúât thuốc bảo vệ thực vật 1.7.2 Sản xuất thuốc kháng sinh 1.7.3 Sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp 2,4-DAPG 1.7.4 Kiểm soát mầm bệnh 1.7.5 Làm nước thải công nghiệp Phần II: Các phƣơng pháp xác định Pseudomonas fluorescens 2.1 Phương pháp truyền thống 2.1.2 Định tính Pseudomonas fluorescens 2.1.2.1 Tiến hành 2.1.2.2 Kết 2.1.2.3 Quy trình thử nghiệm sinh hóa 2.1.3 Thử nghiệm amôn hóa 2.2 Phương pháp đại 2.2.1 Phương pháp PCR 2.2.2 Phương pháp HPLC Phần III: Kết luận đề nghị Phụ lục Tài liệu tham khảo LỜI MỞ ĐẦU Ngộ độc thực phẩm vấn đề giới quan tâm nhiều xúât nơi, lúc diện hẹp hay diện rộng Các chủng vi khuẩn, nấm có khả gây nhiễm khuẩn thực phẩm nghiên cứu cách tỉ mỉ từ hình thái, chế đến triệu chứng gây bệnh Điều dễ thấy thực phẩm bắt đầu trình hư hỏng màu sắc Vậy gây nên vệt màu thực phẩm? Nó có ảnh hưởng nhiều đến sức khoẻ không ta bị nhiễm? Và bạn có thắc mắc làm nên màu sắc không trừ thực phẩm có ảnh hưởng đến thứ khác có liên quan đến sống ta không? PHẦN I: TỔNG QUAN VỀ PSEUDOMONAS FLUORESCENS 1.1 Pseudomonas sp Các chi Pseudomonas nhà thực vật học người Đức đặt tên năm 1894 ông mô tả loài Pseudomonas năm 1895 Pseudomonas vi khuẩn gram âm, hiếu khí, hình que có tiên mao Pseudomonas tồ đất, nước tìm thấy bề mặt thực vật động vật Vi khuẩn Pseudomonas biết đến loài chuyển hóa linh hoạt phát triển nhiều điều kiện tăng trưởng Pseudomonas tác nhân gây bệnh trồnng nhiên số loài gây bệnh cho người Pseudomonas fluorescens có khả phát triển 4ºC gây hư hỏng thực phẩm đông lạnh Nó gây bệnh cho người không phát triển nhiệt độ thể Một số chủng Pseudomonas fluorescens ức chế mầm bệnh nông nghiệp nhiễm trùng nấm… 1.2 Phân lọai 1.2.1 Giới thiệu chung Pseudomonas fluorescens Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Pseudomonadales Familia: Pseudomonadaceae Chi: Pseudomonas Loài: Pseudomonas fluorescens Hình Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens Tên: Pseudomonas fluorescens 1.2.2 Pseudomonas fluorescens 1.3 Đặc điểm 1.3.1 Đặc điểm chung Pseudomonas fluorescens trực khuẩn hiếu khí không nha bào gram âm 16S rRNA, hình que sống đất, thực vật nước bề mặt Di chuyển linh hoạt nhờ có nhiều roi (flagella), phát triển tối ưu nhệt độ 77ºF 86º (25º-30ºC) Pseudomonas fluorescens thành viên nhóm vi khuẩn huỳnh quang pseudomonas nguyên nhân không thường xuyên bệnh nhiễm trùng máu Hình Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens sử dụng flagella để đẩy thân thông qua lớp đất nƣớc Một số chủng Pseudomonas ngăn chặn dịch bệnh cách bảo vệ hạt rễ tránh nhiễm nấm Tuy nhiên chủng Pseudomonas fluorescens lại nguyên nhân gây hư hỏng thực phẩm gây bệnh loài thủy sản 1.3.2 Đặc điểm sinh hóa Pseudomonas fluorescens sản xuất sắc tố hòa tan pyoverdine sắc tố phát huỳnh quang màu xanh vàng kích thích bước sóng thấp 260nm Sắc tố tạo môi trường có nồng độ sắt thấp, dễ khuếch tán có chức chế trao đổi sắt vi khuẩn H ì Hình Pseudomonas fluorescens – agar: môi trƣờng dinh dƣỡng Pseudomonas vi khuẩn hiếu khí bắt buộc số chủng có khả sử dụng nitrat thay oxi chất nhận điện tử cuối hô hấp tế bào Pseudomonas fluorescens với pseudomonas tương tự khác cho lipase nhiệt ổn định proteases Tạo enzyme gây hư hỏng sữa, hư hỏng casein, làm chất lượng thực phẩm tạo chất nhớt, gây tượng đông máu Pseudomonas fluorescens không phát triển điều kiện yếm khí vi khuẩn quang hợp không thải oxi nên có vai trò làm nguồn nước Loài tăng trưởng môi trường nghèo dinh dưỡng gồm khoáng carbon Một số đặc điểm sinh hóa Pseudomonas fluorescens là: không lên men glucose, có khả thủy giải gelatin, tinh bột, oxidase (+), khử nitrate (+) 1.4 Cấu trúc tế bào Bộ gen Pseudomonas fluorescens PF-5 chứa NST tròn với 7.1Mbp 63.3% hàm lượng GC, chứa 87 RNAs 6137 protein, 5.7% chuỗi gen góp phần vào trao đổi chất thứ cấp (lớn Pseudomonas) Bộ gen Pseudomonas fluorescens PfO-1 NST với 6.43841 Mbp 60.5% hàm lượng GC, chúng gồm 95 RNAs 5736 protein 1.5 Cơ chế họat động Pseudomonas fluorescens 1.5.1 Đối với thực vật: 1.5.1.1 Vi sinh vật đối kháng Nhiều công trình nghiên cứu tác nhân phòng trừ sinh học công bố từ đầu kỉ 20 cho vi khuẩn tác nhân phòng trừ sinh học, nhóm vi khuẩn hoại sinh mà phổ biên Pseudomonas spp Nhóm vi khuẩn sản xuất chất kích thích tăng trưởng cây, chất ức chế làm suy yếu tác nhân gây bệnh hai (Baker1988) Cơ chế ban đầu ức chế tác nhân gây bệnh tiết chất kháng sinh (Fravell1988) Các yếu tố việc tiết chất siderophore, HCN, cạnh tranh dinh dưỡng có vai trò việc ức chế tác nhân gây bệnh Pseudomonas fluorescens có khả đối kháng với 10 loại nấm bệnh lưu tồn đất, kích thích phát triển trồng cách sử lý hạt có hay chất mang hoạt chủng vào đất với giá thể làm thức ăn làm giảm mức độ trầm trọng bệnh đồng thời gia tăng phát triển tăng suất cho trồng Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens ký sinh phần vỏ rễ trồng, giúp cho phát triển nhanh chống lại vi sinh vật gây hại, dẫn đến tăng suất (Lazarovits-1997) Pseudomonas fluorescens sản sinh nhiều hợp chất hóa học có cấu trúc từ đơn giản đến phức tạp với đặc tính chất kháng sinh Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens P217 có khả ức chế phát triển vi khuẩn Ralstonia solanacearum Pseudomonas solanacearum gây bệnh héo xanh cho số trồng có giá trị kinh tế cao cà chua, khoai tây, cà tím, ớt…Dòng PF AIR2 phân lập than bùn kìm hãm phát triển nấm Rhizotina solani gây bệnh khô vằn, lỡ cổ rễ Vi khuẩn Pf 2-79 dễ phát triển định cư vài lòai thực phẩm Do sống nhiệt độ máy lạnh nên tác nhân kiểm soát hữu hiệu mầm bệnh có tính chịu lạnh mầm bệnh Listeria monocytogenes Yersinia enterocolitica 1.5.1.2 Gây hại trồng: Là vi sinh vật phụ sinh, thành viên hệ vi sinh vật hạt-củ-rễ Trực tiếp phá hoại tế bào ký chủ, hút vật chất sống tế bào ký chủ Chủng Pseudomonas fluorescens Pf-5 enzym hủy hoại tường tế bào thực vật thành phần xenlulaza, pectinase, lyase pectin Tuy nhiên loại bỏ số nguồn carbohydrate, axit béo, loại dầu hydrolyze protein thực vật gây hư hỏng sữa, thịt cá 1.5.2 Đối với động vật: gây bệnh nhiễm khuẩn (bệnh đốm đỏ) lòai thủy sản, đặc biệt loài cá nuôi Vi khuẩn tác nhân gây bệnh quan trọng, trở lực chủ yếu kìm hãm phát triển cá Hầu hết vi khuẩn gây bệnh phần hệ vi sinh vật bình thường môi trường (nước biển, ao, hồ, sông rạch) nói chung vi khuẩn xem tác nhân gây bệnh thứ cấp tác nhân gây bệnh hội Tuy nhiên có số loài vi khuẩn tác nhân khởi phát, bệnh xảy thường biến động yếu tố môi trường stress gây chết cao Tỷ lệ chết nhiễm khuẩn lên đến 100%, bệnh xảy dạng mãn tính, bán cấp tính cấp tính 1.5.2.1 Dấu hiệu bệnh: Xuất huyết đốm nhỏ da, xung quanh miệng nắp mang, phía mặt bụng, bề mặt thể bị chảy máu, tuột nhớt không xuất huyết vây hậu môn Pseudomonas fluorescens gây nhiễm khuẩn huyết thường xâm nhập vào thể cá qua thương tổn mang, da, vẩy tác nhân học, nuôi với mật độ cao, dinh dưỡng kém, hàm lượng oxi giảm… Hình Xuất huyết cá 1.5.2.2 Phòng trị Giảm mật độ nuôi, cung cấp nguồn nước tốt Dùng vaccine phòng bệnh Tắm KMnO4 với lượng 0.4g/100ml không quy định thời gian 1.5.3 Đối với thực phẩm Vi khuẩn tác nhân tượng biến thoái hư hại thực phẩm Thức ăn, thức uống, sữa tươi, fromage, rau quả…đều bị chua nhớt, đóng ván, hôi thối, có bọt, có gaz có màu khác thường 1.5.3.1 Pseudomonas fluorescens gây hƣ hỏng bề mặt thịt - Thịt bị hóa nhầy: thường có bề mặt thịt ướp lạnh độ ẩm không khí cao 90% (giai đọan đầu trình hư hỏng) Trên bề mặt thịt hình thành lớp dày đặc vi khuẩn gây hại thực phẩm khác Micrococcus aureus, Micrococcus candidus nấm men Thịt bảo quản nhiệt độ từ đến 2ºC với độ ẩm tương đối từ 85% đến 90% tốt (có thể bảo quản tuần lễ mà thịt không hóa nhầy) - Chủng Pseudomonas fluorescens hình thành vết màu xanh lục bề mặt thịt: tác động vi khuẩn hô hấp hiếu khí bề mặt thịt xuất vết màu Khi mỡ bị ôi thiu xuất perocid màu vàng biến thành màu xám tối sau trở nên xanh Nếu thịt có mùi bình thường không phát thấy có độc tố sau tẩy vết màu sử dụng bình thường - Khuẩn Pseudomonas phân giải mỡ thúc đẩy trình oxy hóa mỡ, mỡ bị oxy hóa tác động đồng thời ánh sáng không khí Hình Gây vết màu xanh lục bề mặt thịt 1.5.3.2 Pseudomonas fluorescens gây hƣ hỏng nhiều loại thực phẩm - Trên thịt gia cầm khuẩn Pseudomonas gây mùi hôi, gây mùi khó chịu lòng trắng trứng - Chủng Pseudomonas fluorescens gây cho sữa có màu xanh cây, làm cho vỏ trứng có màu xanh trắng gây vết màu xanh cá ướp lạnh - để yên cho vệt bôi khô - đưa phiến kính qua lại vài lần lửa đèn cồn - thực tương tự để tạo vệt bôi chung chủng vi sinh vật đối chứng phiến kính khác (dùng E.coli làm chủng đối chứng gram (-) Staphylococcus aureus làm chủng đối chứng cho gram (+)) - theo phương pháp Jensen: nhỏ vài giọt dung dịch Methyl violet lên vệt bôi, giữ yên 20 giây Dùng bình xịt bơm nước lên vệt bôi để rửa phẩm nhuộm Nhỏ vài giọt KI/I2 lên vệt bôi, để yên phút Xịt cồn 95% lên vệt bôi rửa phẩm nhuộm đến vừa màu Để yên vài giây rửa lại với nước Nhuộm dung dịch safranin 30 giây, rửa lại với nước, thấm nước dư giấy lọc - quan sát màu nhuộm tế bào vật kính 100X Tế bào nhuộm gram (-) có màu đỏ hồng  Thử nghiệm oxidase: - cắt miếng giấy lọc thành dải nhỏ dài 10-40 mm - nhúng vào hóa chất (dung dịch 1% tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride oxalate) - thấm bớt dịch hóa chất thừa giấy thấm - để khô 35ºC giữ chai tối màu nhiệt độ phòng - dùng que cấy vòng bạch kim chuyển sinh khối lên phần giấy lọc - sau 10 giây đọc kết (không vượt thời gian này) - pseudomonas spp có phản ứng oxidase (+): giấy lọc có màu đỏ tía đậm sau 10 giây  Thử nghiệm nitratase: - cấy ria khuẩn lạc thử ngnhiệm bề mặt đâm sâu xuống thạch Nitrate Motility Agar ống thạch sâu - ủ 35ºC 24h - nhỏ vài giọt sulfanilic acid naphthylamine: màu hồng đậm hay màu đỏ chứng tỏ có biến đổi nitrate thành nitrite Nếu môi trường không đổi màu có tạo thành bọt khí rạn nứt môi trường xem phản ứng (+) - Pseudomonas fluorescens cho kết (+) khả khử nitrate thành nitrite giải phóng nitơ  Thử nghiệm tạo sắc tố pyoverdine: - cấy ria khuẩn lạc thử nghiệm lên môi trường thạch Pseudomonas Agar F - ủ 25ºC ngày - soi đĩa tia UV (260nm) - Pseudomonas fluorescens tiết sắc tố pyoverdine phát hùynh quang khuếch tán agar dọc theo đường cấy Hình 10 A P.fluorescens phát triển môi trường thạch dinh dưỡng, ánh sáng bao quanh B P.fluorescens phát triển môi trường thạch dinh dưỡng, ánh sáng cực tím C P.fluorescens phát triển môi trường Pseudomonas Agar F, ánh sáng bao quanh D P.fluorescens phát triển môi trường Pseudomonas Agar F, ánh sáng cực tím 2.1.2 Thử nghiệm amon hóa protein Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có khả amon hóa protein (gây tượng thối rửa): tạo thành NH3 từ hợp chất nitơ hữu Thí nghiệm: - lấy 3-5g thịt cá cắt nhỏ cho vào bình tam giác - để miệng bình giấy thị để xác định sản phẩm phân hủy (giấy quỳ hồng xác định có mặt NH3, giấy lọc tẩm dung dịch 10% chì axetat xác định có mặt H2S, giấy lọc tẩm dung dịch nóng oxalic axit bão hòa để xác định có mặt indon) - đậy nút để nhiệt độ từ 28-35ºC Sau ngày trình phân hủy prôtêin xảy tạo mùi hôi thối đặc trưng Sau 57 ngày miếng thịt nát vụn, môi trường lên men đổi màu, sau thịt dần bị vô hóa thành dịch lỏng Kiểm tra kết quả: lấy giọt dịch phân hủy làm tiêu nhuộm màu cố định để quan sát vi sinh vật xem có phải chủng Pseudomonas fluorescens không 2.2 Các phƣơng pháp đại 2.2.1 Phƣơng pháp PCR Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) phương pháp in vitro để tổng hợp DNA dựa khuôn trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng khuôn thành hàng triệu nhờ họat động enzyme polymerase cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đọan DNA Hỗn hợp phản ứng nhân gen tích 25µl với thành phần: 16,7 µl nước 2,5 µl đệm Taq (10x) 2,5 µl dung dịch dNTP (10mM) µl dịch mồi Prf (10mM) µl dịch mồi Prr (10mM) µl dịch DNA khuôn 0,3 µl Taq Polymerase Phản ứng thực với chu trình nhiệt sau: Giai đọan đầu: ADN biến tính 95ºC phút 30 giây, tiếp tục biến tính 94ºC phút, mồi gắn nhiệt độ 52ºC phản ứng kéo dài chuỗi 72ºC phút 20 giây Giai đọan chính: lặp lại 30 lần chu kỳ nhiệt giống giai đọan đầu, khác chỗ ADN biến tính lần nhiệt độ 94ºC phút, tiếp sau pha cuối phản ứng kéo dài chuỗi trì 72ºC 10 phút sản phẩm bảo quản 4ºC Kết kiểm tra điện di agarose 0.8%, nhuộm EtBr hình thiết bị hình UV 745 bp Hình 11 Kết PCR dựa vào DNA khuôn mẫu trích từ dòng Pseudomonas fluorescens với primer chuyên biệt gen mã hóa chất kháng sinh khác Hình 12: Kết chạy gel DNA Pseudomonas fluorescens từ PCR 2.2.2 Phƣơng pháp HPLC (High – Performance Liquid Chromatography) dùng để phát khả tạo 2,4-DAPG Pseudomonas fluorescens 2.2.2.1 Phƣơng pháp HPLC Phương pháp gọi phương pháp sắc kí lỏng cao áp: khả phân tách tốc độ phân tách cao nhiều so với phương pháp cổ điển, cột HPLC dễ dàng tái sử dụng không cần phải nhồi cột lại tái sinh cột, độ lặp lại lớn kiểm sóat thông số gây ảnh hưởng, máy tự động hóa cao HPLC dễ dàng sử dụng mức độ lớn mức độ thu mẫu - HPLC định kết phân tách cao nhờ sử dụng hạt hấp phụ mịn < 20 μm, có diện tích bề mặt lớn - HPLC sử dụng dung môi, đòi hỏi dung môi phải không chứa bọt khí - HPLC sử dụng cột sắc ký thép không rỉ ống thủy tinh đường kinh là 2,1;3,2 4,5 mm ́ -teflon với Hình 13: Hệ thống phƣơng pháp HPLC 2.2.2.2 Tiến hành - Chuẩn bị mẫu: chọn lọc vi khuẩn Pseudomonas fluorescens dựa vào khả phát hùynh quang trữ mẫu -80ºC dung dịch glycerol - Các dòng Pseudomonas fluorescens nhân sinh khối môi trường KB lỏng 28ºC 36h pH = - Ly tâm thu dung dịch, tiến hành acid hóa với trifluoroacetic 10% Chiết rút lần dung dịch acid hóa với ethyl acetate - Thu dung dịch chiết rút làm khô hệ thống BUCHI rotavapor R-114, hòa tan 1ml methanol - Phân tích hệ sắc ký dùng Columm 100-5 C18AB Ser No 8075636, máy HEWLETT PACKARD với lượng mẫu phân tích lần 20µl dung môi 35% - acetonitrile chứa 0,1% H3PO4, tốc độ dòng dung môi 0,5ml/phút, bước song 270nm, thời điểm ghi nhận 11,6 phút - Sử dụng mẫu chuẩn 2,4-diacetylphlorogluinol (TRC) để thiết lập phương pháp chuẩn thiết lập đường tương quan dùng quy đổi nồng độ có dung dịch phân tích Hình 14: Sắc kí đồ HPLC phát hợp chất kháng sinh sinh học 2,4-DAPG dung dịch lỏng dòng vi khuẩn đối kháng Pseudomonas fluorescens A Mẫu chuẩn với thời gian phát ứng với 2,4-DAPG 11,6p với nồng độ 0,2ppm B Dung dịch chiết xúât từ vi khuẩn PBV1 phân lập từ vải C Sắc kí đồ mẫu chuẩn cộng với mẫu chiết suất PBV1 D Sắc kí đồ vi khuẩn PMT51 phân lập từ rễ mồng tơi có nồng độ 2,4-DAPG 26,1µg/ml dung dịch chiết xuất III KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens dòng vi khuẩn thông thường diện thực phẩm, nồng độ gây ngộ độc thực phẩm đến người không cao nhiên tác nhân gây bệnh loài thủy sản nuôi ao hồ Mặt khác chủng Pseudomonas fluorescens có lợi cho trồng, sản xuất lọai thuốc bảo vệ thực vật, kháng sinh nên trọng nghiên cứu thực vật Tuy khả gây độc không có, có khả gây bệnh diện rộng người nên cần phải nghiên cứu chuyên sâu tác nhân, triệu chứng gây bệnh giống trường hợp nhiễm xác Pseudomonas fluorescens Mỹ 2004-2006 Những ứng dụng Pseudomonas fluorescens nông nghiệp cần nghiên cứu phát triển để sử dụng dòng vi khuẩn cách hiệu PHỤ LỤC: số môi trường thuốc thử dùng cho việc xác định Pseudomonas fluorescens King’s B Proteose peptone No.3 20g Glycerol 10ml K2HPO4 1,5g MgSO4 1,5g Agar 15g Nước cất lít Cho vào tất thành phần trừ MgSO4 Làm nóng lắc để hòa tan agar Chỉnh pH đến 7,2 ± 0,2 Thêm MgSO4 từ từ trộn Phân phối 4ml vào ống nghiệm 13 x 100mm Hấp 121ºC 15 phút, để nghiêng ống nghiệm Hình 15: A- Pseudomonas fluorescens King’s B B- Pseudomonas fluorescens King’s B đƣợc quan sát dƣới đèn UV Pseudomonas Agar F Proteose peptone No.3 (Difco) 20g Tryptone (Difco) 10g Dipotassium phosphate 1,5g Magnesium sulfate 0,73g Glycerol (Difco) 10g Agar 15g Nước cất lít Cho thành phần môi trường vào nước, trộn Đun sôi để hòa tan thành phần Hấp 121ºC 15 phút, pH cuối Brain Heart Infusion (BHI) Broth Agar Dịch não dê 200g Dịch tim bò 250g Proteose peptone 10g NaCl 5g Na2HPO4 2,5g Dextrose 2g Nước cất lít Hòa tan thành phần môi trường nước cất cách lắc có gia nhiệt nhẹ Thuốc thử nhuộm Gram Phƣơng pháp Jensen - dung dịch 0,25% methyl violet nước cất - dung dịch iodine – potassium iodide: hòa tan 2g KI 20ml nước cất Bổ sung 1g iodine nghiền nhuyễn, để qua đêm Thêm nước cất cho đủ 300ml - dung dịch safranin: 1% safranin (hoặc 1% neutral red) nước cất Phƣơng pháp Hucker - dung dịch crystal violet: hòa tan 2g crystal violet vào 20ml ethanol 95% Hòa tan 0,8g ammonium oxalate 80ml nước cất Trộn chung hai hỗn hợp với nhau, để yên 24h, lọc - dung dịch iodine – potassium iodide: hòa tan 2g KI 20ml nước cất Bổ sung 1g iodine nghiền nhuyễn, để qua đêm Thêm nước cất cho đủ 300ml - dung dịch safranin: nghiền 0,25g safranin cối sứ với 10ml ethanol 95% Chuyển vào ống đong, rửa nước cất thu gộp nước rửa vào ống đong Bổ sung nước cất cho đủ 100m Hình 16 Các bƣớc tiến hành nhuộm gram TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH 1- PGS TS Lê Thanh Mai, S.TS Nguyễn Thị Hiền, PGS.TS Phạm Thu Thủy, TS Nguyễn Thanh Hằng Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men Nhà xuất khoa học kĩ thuật Hà Nội 2- Trần Linh Thước Phương pháp phân tích Vi Sinh Vật nước, thực phẩm mĩ phẩm Nhà xuất giáo dục 3- GS Nguyễn Thành Đạt Sinh học Vi Sinh Vật Nhà xuất giáo dục 4- Lê Lương Tề, Vũ Triệu Mân Bệnh vi khuẩn virus hại trồng Nhà xuất giáo dục 5- Ks.Phạm Minh Nhựt Phân tích đánh giá chất lượng thực phẩm 6- http://en.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas_fluorescens 7- http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Pseudomonas_fluorescens 8- http://www.uniprot.org/ 9- http://parts.mit.edu/ 10- http://genome.jgi-psf.org/ 11- http://inst.bact.wisc.edu/ 12- http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 13- http://www.fda.gov/ 14- http://www.cda.gov/ 15- http://www.mgc.ac.cn GIẢI ĐÁP THẮC MẮC Câu Mối lien quan vi khuẩn Listeria vi khuẩn Pseudomonas fluorescens ? Vi khuẩn Listeria dính bám vào bề mặt máy móc từ xâm nhập vào sản phẩm thức ăn Tuy nhiên Listeria không giỏi bám lên bề mặt thép không gỉ cạnh tranh với vi khuẩn khác Nhưng Pseudomonas fluorescens bám vào bề mặt Listeria có khả bám vào bề mặt cách hiệu Câu Phương pháp HPLC để xác định yếu tố Pseudomonas fluorescens? Phương pháp HPLC áp dụng để xác định khả tạo hợp chất thứ cấp 2,4-DAPG khuẩn Pseudomonas fluorescens