Tài liệu Thí nghiệm vi sinh vật

+ Bật công tắc xu nố g nếu muốn sử dụng chế độ l cắ liên tụcContinuous... Môi tr ng tăng sinh ườ...  Thực hiện được kỹ thuật pha loãng bậc 10..  Thực hiện được kỹ thuật hộp trãi và hộp

BU I 1 Ổ :H ƯỚ NG D N S D NG THI T B , D NG C PHÒNG THÍ Ẫ Ử Ụ Ế Ị Ụ Ụ NGHI M VI SINH VÀ KỸ THU T LÀM NÚT BÔNG, BAO GÓI CÁC Ệ Ậ

D NG C H P KH TRÙNG Ụ Ụ Ấ Ử

M C TIÊU Ụ

Sau khi h c xong bài này, sinh viên có kh năng:ọ ả

- Chu n b trang thi t b c n thi t c a m t phòng thí nghi m vi sinh v t.ẩ ị ế ị ầ ế ủ ộ ệ ậ

- V n d ng đ c các quy t c an toàn trong phòng thí nghi m vi sinh v t.ậ ụ ượ ắ ệ ậ

- Áp d ng đ c các ph ng pháp ti t trùng môi tr ng, d ng c ụ ượ ươ ệ ườ ụ ụ

- Bao gói d ng c ụ ụ

1.1Gi i thi u và h ớ ệ ướ ng d n s d ng các lo i d ng c và thi t b trong phòng thí ẫ ử ụ ạ ụ ụ ế ị nghi m vi sinh v t ệ ậ

1.1.1 H ướ ng d n th c hi n nôi quy và các thao tác an toàn ẫ ự ệ

- Hi u đúng nguyên t c, ph ng pháp làm vi c v i vi sinh v t(VSV).ể ắ ươ ệ ớ ậ

- Thao tác an toàn trên đ i t ng VSV m t đ cao.ố ượ ở ậ ộ

- Không ăn u ng , hút thu c trong phòng thí nghi m(PTN) VSV.ố ố ệ

- M c áo blouse trong th i gian th c hành.ặ ờ ự

- Không dùng mi ng hút b ng ng hút (pipette) đ đ nh l ng VSV ho c hóa ch t ệ ằ ố ể ị ượ ặ ấ

mà ph i dùng qu bóp cao su khi thao tác b ng ng hút.ả ả ằ ố

- H p petri đã đ môi tr ng ho c sau nuôi c y VSV, không m n p, dùng tay đ sộ ổ ườ ặ ấ ở ắ ể ờ

và dùng mũi đ ng i.ể ử

- Khi l tay làm đ VSV ra n i làm vi c, dùng khăn tay hay gi y t m c n ỡ ồ ơ ệ ấ ẩ ồ 700 đ lau ể

và lau s ch l i b ng khăn hay gi y t m c n 70ạ ạ ằ ấ ầ ồ 0 khác

- Khi s d ng que c y đ gieo c y VSV c n ph i đ c kh trùng b ng cách đ t trênử ụ ấ ể ấ ầ ả ượ ử ằ ố

ng n l a đèn c n tránh v ng vãi ra xung quanh.ọ ử ồ ươ

- Tr c và sau khi thao tác trên VSV c n lau tay kĩ b ng c n 70ướ ầ ằ ồ 0 Khi th c hi n thao ự ệtác này c n tránh xa ng n l a đèn c n khi tay còn t.ầ ọ ử ồ ướ

- C n ghi chú tên ch ng VSV và ngày tháng thí nghi m lên các d ng c ch a môi ầ ủ ệ ụ ụ ứ

tr n nuôi c y VSV.ườ ấ

- T t c các ch t th i và môi tr ng ch a ho c nhi m VSV c n đ c h p kh trùngấ ả ấ ả ườ ứ ặ ễ ầ ượ ấ ử

tr c khi đem đ vào thùng rác Các d ng c nhi m VSV c n đ c ngâm trong ướ ổ ụ ụ ễ ầ ượdung d ch sát khu n tr c khi r a.ị ẩ ướ ử

- Không đ th ch vào b n r a và ng thoát n c.ổ ạ ồ ử ố ướ

1.1.2 H ướ ng d n s d ng các lo i d ng c chuyên d ng trong phòng thí nghi m ẫ ử ụ ạ ụ ụ ụ ệ

vi sinh.

1.1.2.1 D ng c ụ ụ

a ng nghi m Ố ệ : đ c dùng đ ch a môi tr ng nuôi c y và nuôi c y VSV Môi tr ng có ượ ể ứ ườ ấ ấ ườ

th d ng l ng hay r n Mi ng ng nghi m có th đ c đ y b ng nút bông không ể ở ạ ỏ ắ ệ ố ệ ể ượ ậ ằ

th m n c, b ng silicon, gi y nhôm hay n p v n khi phân tích VSV s d ng gi y nhôm ấ ướ ằ ấ ắ ặ ử ụ ấhay silicon đ h n ch s nhi m VSV.ể ạ ế ự ễ

b Đĩa Petri (petri dishes): G m n p l n đ y lên n p nh có hình tròn, đ ng kính ồ ắ ớ ậ ắ ỏ ườ

6,8,10,12 cm Đĩa Petri đ c gói l i b ng gi y tr c khi đem h p ti t trùng b ng nhi t ượ ạ ằ ấ ướ ấ ệ ằ ệ

m hay s y b ng nhi t khô M c đích c a bao gói nh m ngăn ng a VSV nhi m vào môi

tr ng tr c và sau khi c y đ ng th i đ g n h n và tránh v d ng c khi đ a vào n i ườ ướ ấ ồ ờ ể ọ ơ ỡ ụ ụ ư ồ

h p và quá trình thao tác.ấ

c Bình tam giác (bình nón): th ng s d ng đ chu n đ , ch a đ ng môi tr ng, dung ườ ử ụ ể ẩ ộ ứ ự ườ

d ch, nuôi c y vi sinh v t, th c hi n các ph n ng, bình c u còn thích h p cho các ph n ị ấ ậ ự ệ ả ứ ầ ợ ả

ng c n xúc tác nhi t đ

Bình tam giác, bình c u th ng có th tích t 50ml đ n 10 lít tùy theo dung d ch ầ ườ ể ừ ế ị

ch a đ ch n lo i bình thích h p.ứ ể ọ ạ ợ

T ng t Petri bình tam giác đ c làm nút bông và gói l i b ng gi y ph n đ u ươ ự ượ ạ ằ ấ ầ ầ

tr c khi đem h p ti t trùng Giúp ngăn ng a VSV nhi m vào môi tr ng tr c vào sau ướ ấ ệ ừ ễ ườ ướnuôi c y, tránh cho h i n c trong quá trình h p l t vào bình, VSV xâm nh p khi đã h p ấ ơ ướ ấ ọ ậ ấxong nên c n làm nút bông cũng nh b c gi y bên ngoài.ầ ư ọ ấ

d đèn c n ồ : là lo i đèn đ c đ t b ng c n 90ạ ượ ố ằ ồ 0, m c đích nh m t a nhi t t o m t vùng ụ ằ ỏ ệ ạ ộxung quanh vô trùng h n ch VSV khác xâm nh p môi tr ng nuôi c y VSV Đèn c n có ạ ế ậ ườ ấ ồ

th đ c dùng đ kh trùng lo i que c y b ng cách h hay đ t trên ng l a đèn c n.ể ượ ể ử ạ ấ ằ ơ ố ọ ử ồ

e Phi n kính(lame) và lá kính (lamelle): ế

- Phi n kính là mi ng th y tinh hình ch nh t, có đ trong su t cao, dày 2mm dùng đ ế ế ủ ữ ậ ộ ố ể

ch a gi t VSV tr ng thái s ng hay nhu m màu khi quan sát chúng b ng kính hi m vi.ứ ọ ở ạ ố ộ ằ ể

- Lá kính: là mi ng th y tinh hình vuông, có đ trong su t cao dày 0.1-0.2 mm dung đ ế ủ ộ ố ể

đ y lên gi t VSV trên phi n kính đ quan sát tr ng thái s ng c a t bào VSV.ậ ọ ế ể ạ ố ủ ế

f Các lo i que c y ạ ấ

- Que c y th ng: ấ ẳ dùng đ c y đi m vsv Nh ng vsv c n c y sâu.ể ấ ể ữ ầ ấ

- Que c y vòng ấ : dùng c y ria trên m t th ch hay phân l p VSV trên b m t th ch ho c ấ ặ ạ ậ ề ặ ạ ặ

c y chuy n trên môi tr ng l ng.ấ ề ườ ỏ

- Que c y móc ấ : dùng đ c y các lo i n m m c hay x khu n.ể ấ ạ ấ ố ạ ẩ

- Que trang: dùng đ tr i gi t sinh kh i VSV trên b m t th ch.ể ả ọ ố ề ặ ạ

g Micropipette

Là lo i ng hút máy có đ chính xác cao dùng đ đ nh l ng m t th tích chính xác dungạ ố ộ ể ị ượ ộ ể

d ch VSV, môi tr ng nuôi c y (l ng) hay trong dung d ch hóa ch t.ị ườ ấ ỏ ị ấ

M i lo i micropipette đ u có lo i đ u tip t ng ng đ hút Khi hút các lo i n ng đ ỗ ạ ề ạ ầ ươ ứ ể ạ ồ ộkhác nhau hay hóa ch t khác nhau ph i thay đ i đ u típ đ tránh nhi m hóa ch t ho c ấ ả ổ ầ ể ễ ấ ặvsv n ng đ khác nh h ng đ n k t qu phân tích.ồ ộ ả ưở ế ế ả

Trên micropipette có th đi u ch nh th tích hút b ng cách v n s t ng ng.ể ề ỉ ể ằ ặ ố ươ ứ

Cách hút m u: ấ

 V n nút xoay đi u ch nh s µl hút nh t đ nh.Trong bài báo cáo s p t i có 2 ch s : ặ ề ỉ ố ấ ị ắ ớ ỉ ố0.1ml= 100µl và 1ml=1000 µl G n ng típ t ng ng v i m i n ng đ ch t c n ắ ố ươ ứ ớ ỗ ồ ộ ấ ầhút khác nhau

 Nh n và gi nút phía trên đ hút th tích t ng ng Sau khi hút nh nút ra.ấ ữ ể ể ươ ứ ả

 Khi nh ch t c n hút ra ng nghi m , thì nh n nút n c 1 sau đó nh n thêm 1 l n ả ấ ầ ố ệ ấ ấ ấ ầ

n a là n c 2 đ nh h t ch t c n hút ra S dĩ có 2 n c vì sau khi b m n c 1 th ữ ấ ể ả ế ấ ầ ở ấ ấ ấ ểtích có th v n còn trên đ u típ, mũi típ nên nh n n c 2 giúp th tích hút xu ng ể ẫ ầ ấ ấ ể ố

h t k t qu thí nghi m chính xác h n.ế ế ả ệ ơ

 Làm s ch đ u típ và c t micropipetteạ ầ ấ

L u ý ư :Thay đ i đ u típ s ch đã h p kh trùng khi c n hút nhi u n ng đ khác nhau hayổ ầ ạ ấ ử ầ ề ồ ộhóa ch t khác nhau vì nút v n đi u ch nh th tích d h nên c n thao tác c n th n ấ ặ ề ỉ ể ễ ư ầ ẩ ậtránh v n đi v n l i nhi u l n.ặ ặ ạ ề ầ

1.1.2.2 H ướ ng d n s d ng các lo i thi t b chuyên d ng trong phòng thí nghi m ẫ ử ụ ạ ế ị ụ ệ

vi sinh.

a N i h p ồ ấ : là thi t b b t bu c ph i có trong PTN vi sinh cho phép tiêu di t t t c các ế ị ắ ộ ả ệ ấ ả

d ng s ng c a VSV(t bào sinh d ng, bào t ) N i h p có c u t o 2 l p v nên có kh ạ ố ủ ế ưỡ ử ồ ấ ấ ạ ớ ỏ ảnăng ch u đ c áp su t cao Bu ng kh trùng có g n valve thoát khí, áp k , nhi t k ị ượ ấ ồ ử ắ ế ệ ế

- Khi s d ng ph i dùng n c c t châm vào thùng, tránh b đóng c n N c ph i đ c ử ụ ả ướ ấ ị ạ ướ ả ượchâm đ n m c quy đ nh.ế ứ ị

- Nhi t đ h p 121ệ ộ ấ 0C trong 15 phút (th ng đ 20-30 phút vì lúc này nhi t đ m i lên ườ ể ệ ộ ớ

t i m c 121ớ ứ 0C lúc này m i là th i gian thanh trùng, ti t trùng cho d ng c ).ớ ờ ệ ụ ụ

- Ch m n p và l y gi d ng c h p ra khi nhi t đ d i 100ỉ ở ắ ấ ỏ ụ ụ ấ ệ ộ ướ 0C và áp su t b ng 0.ấ ằ

* Cách v n hành n i h p ậ ồ ấ

 B c 1: ướ M ở nắp nồi hấp, l y ấ hai giỏ inox ra ngoài

 B c 2: ướ Cho n cướ c tấ vào nồi hấp đ nế khi ng p cậ on ốc c m ả ứng khoảng 1-2 cm

 B c 3: ướ Cho d nụ g c ụ và môi trường c n ầ hấp kh ử trùng vào giỏ r i ồ đưa vào nồi hấp

 B c 4: ướ Đóng nắp và khóa van

 B c 5: ướ B t ậ công tắt ở bên hông, cài đ t ặ thông s ố nhiệt độ,áp suất, thời gian, b mấ l n ầ lượt các nút “set” và “start” H p nhi t đ 121ấ ở ệ ộ 0C Trong

th i gian 30 phút.ờ

 B c 5: ướ Khi đã có tín hiệu thì mở nồi h pấ ra, m t hi n th báo nhi t đ ặ ể ị ệ ộ

d i 100ướ 0 và có đèn báo “ complete” ch p ch p màu đ , ớ ớ ỏ chờ 1 phút cho b tớ nóng và l yấ d nụ g c ụ môi tr ng raườ m n i h p đi u ki n áp su t b ng 0 và ở ồ ấ ở ề ệ ấ ằnhi t đ d i 100ệ ộ ướ 0C Đ đ m b o an toàn và tránh n n i h p.ể ả ả ổ ồ ấ

* Thao tác s d ng máy l cử ụ ắ

- C mắ điện

- Đ tặ ống nghi mệ lên ph nầ núm đen

+ B t ậ công t cắ lên nếu muốn s ử dụng ch ế đ ộ l cắ gián đoạn(Manual) Nhấn nhẹ và gi cữ h tặ nố g nghi m ệ trong vài giây rồi nh cấ ống nghi mệ ra

+ Bật công tắc xu nố g nếu muốn sử dụng chế độ l cắ liên tục(Continuous)

1.2 Kỹ thu t làm nút bông ng nghi m, bình tam giác ậ ố ệ

Nh m ngăn nhi m VSV t ngoài vào môi tr ng tr c và sau khi c y VSV.ằ ễ ừ ườ ướ ấ

B c 1 Dùng tay xé m t mi ng l n bông hình ch nh t, g p các rìa mi ng bông vào ướ ộ ế ớ ữ ậ ấ ếtrong cho g n không b xù.ọ ị

B c 2: Cu n ch t l i thành nút sao cho v a khít ng nghi m ho c bình tam giác (khôngướ ố ặ ạ ừ ố ệ ặquá ch t cũng nh không quá l ng) Nút bông không quá dài cũng không quá ng n đ ặ ư ỏ ắ ểthu n ti n cho quá trình thao tác.ậ ệ

Sau khi làm nút bông xong bao gói và h p kh trùng.ấ ử

1.3 Kỹ thu t bao gói d ng c ậ ụ ụ

M c đích là ngăn ng a VSV nhi m vào môi tr ng tr c và sau khi c y, đ tránh v ụ ừ ễ ườ ướ ấ ể ỡ

d ng c th y tinh trong quá trình thao tác Dùng gi y không th m n c Vì gi y th m ụ ụ ủ ấ ấ ướ ấ ấ

n c d b rách trong quá trình thao tác sau khi h p kh trùng Trong phòng thí nghi m ướ ễ ị ấ ử ệVSV, ng i ta th ng bao gói trên nhi u d ng c :ườ ườ ề ụ ụ

- Bao gói ng nghi m : tùy theo m c đích nuôi c y mà nên cu n theo t ng ki u cho ố ệ ụ ấ ố ừ ểphù h p:ợ

 M c đích là gi gi ng: Ng i ta cu n gi y t o thành nh m t n p ch p có ụ ữ ố ườ ố ấ ạ ư ộ ắ ụ

th l y ra và ch p vào d dàng Vì n p ch p này sẽ đ c dùng đi dùng l i ể ấ ụ ễ ắ ụ ượ ạnhi u l n sau m i l n l y gi ng trong thí nghi m ra Mép cu n sau cùng ề ầ ỗ ầ ấ ố ệ ốnên g p nhét cho g n.ấ ọ

 M c đích là phân tích: n p gi y ng nghi m s d ng m t l n r i b Nên taụ ắ ấ ố ệ ử ụ ộ ầ ồ ỏ

có th cu n đ n gi n h n Mép gi y đ c g p nhét ho c c t thunể ố ơ ả ơ ấ ượ ấ ặ ộ

- Gói gi y đĩa Petri:ấ

B c 1 Đ t 2,3 cái đĩa trên m t t gi y hình ch nh t đã đ c c t phù h p.ướ ặ ộ ờ ấ ữ ậ ượ ắ ợ

B c 2 Túm l y 2 c nh nh c a hình ch nh t g p cu n mép 2-3 l n cho ch t ướ ấ ạ ỏ ủ ữ ậ ấ ộ ầ ặ

v a cái đĩa.ừ

B c 3 Sau đó n 2 đ u mép còn l i xu ng và g p mép hình tam giác nh n gi aướ ấ ầ ạ ố ấ ọ ở ữ

nh gói quà.ư

B c 4 G p ng c hai hình tam giác đó xu ng đ ch ng đĩa đè lên gi n p g p.ướ ấ ượ ố ể ồ ữ ế ấ

- Cu n gi y bó ng nghi m có ch a môi tr ng Bó ng nghi m th ng t 4-6 ng ố ấ ố ệ ứ ườ ố ệ ườ ừ ố

sẽ đ c cu n xung quanh đáy ng thí nghi m Chi u cao gi y t đáy lên 1/3 ng ượ ố ố ệ ề ấ ừ ốnghi m và đ c c t l i b ng m t s i thun Ph n trên mi ng ng nghi m cũng ệ ượ ộ ạ ằ ộ ợ ầ ệ ố ệ

cu n t ng t nh ph n đáy và đ h ph n gi a c a bó óng thí nghi m C n đố ươ ự ư ở ầ ể ở ầ ữ ủ ệ ầ ểđáy ng nghi m phía d i tránh đ l n sẽ khi n môi tr ng sau khi h p b đ y ố ệ ướ ể ộ ế ươ ấ ị ầ

h t ra ngoài do áp l c tăng khi gia nhi t trong quá trình h p.ế ự ệ ấ

- Cu n gi y bình tam giác: Bình tam giác đ c cu n nh ph n mi ng ng nghi m.ố ấ ượ ố ư ầ ệ ố ệ

- Cu n gi y d ng c khác: Các d ng c đ c cu n gi y nh : pipette, c c th y tinh, ố ấ ụ ụ ụ ụ ượ ố ấ ư ố ủque c yấ

M t s câu h i: ộ ố ỏ

1 T i sao ph i làm nút bông và bao gói d ng c ? ạ ả ụ ụ

VSV là loài sinh tr ng và phát tri n khá nhanh vì v y trong quá trình th c hành vi c ưở ể ậ ự ệ

h n ch m c th p nh t s xâm nh p c a VSV bên ngoài vào môi tr ng nuôi c y là ạ ế ứ ấ ấ ự ậ ủ ườ ấ

r t c n thi t nó nh h ng đ n k t qu nuôi c y vì vây thí nghi m không có đ tin ấ ầ ế ả ưở ế ế ả ấ ệ ộ

D ng c thí nghi m th ng đ c s dung đi s d ng l nhi u l n đ ng th i s xâm ụ ụ ệ ườ ượ ử ử ụ ạ ề ầ ồ ờ ự

nh p c a vsv t môi tr ng bên ngoài nên sẽ không hoàn toàn s ch mà có th ch a VSV ậ ủ ừ ườ ạ ể ứkhác bên trong Vì v y tr c khi nuôi c y ph i r a s ch và h p kh trùng đ t o không ậ ướ ấ ả ử ạ ấ ử ể ạgian vô trùng tiêu di t VSV bên trong cũng nh xung quanh thành d ng c giúp k t qu ệ ư ụ ụ ế ảnuôi c y v sau không b nhi m VSV không mong mu n làm nh h ng k t qu ấ ề ị ễ ố ả ưở ế ả

3 T i sao h p m t s d ng c nên dùng gi y b c, m t s khác l i dùng bông? ạ ấ ộ ố ụ ụ ấ ạ ộ ố ạ

Vì gi y b c khi đ y ng nghi m d dàng nh ng đ i v i các d ng c ch thao tác 1 l nấ ạ ậ ố ệ ễ ư ố ớ ụ ụ ỉ ầ

r i b nh n c c t thì nên dùng gi y b c, còn đ i v i các d ng c thí nghi m đ c ồ ỏ ư ướ ấ ấ ạ ố ớ ụ ụ ệ ượ

s d ng đi s d ng l i hi u l n thì không nên dùng gi y b c vì gi y b c có nh c ử ụ ử ụ ạ ề ầ ấ ạ ấ ạ ượ

đi m là d rách đ ng th i khi bao l i l n 2,3 thì nhăn và không kín đ c d n đ n vsvể ễ ồ ờ ạ ầ ượ ẫ ế

d xâm nh p, v i l i bao gi y b c t n kém h n, quá trình thao tác thí nghi m sẽ ễ ậ ớ ạ ấ ạ ố ơ ệnhanh h n khi dùng nút bông.ơ

4 T i sao đĩa petri l i có n p l n, n p nh ? ạ ạ ắ ớ ắ ỏ

Vi c n p l n đ y lên n p nh có ý nghĩa r t l n Th nh t nó giúp cho tuy t đ i kín ệ ắ ớ ạ ắ ỏ ấ ớ ứ ấ ệ ố

đ c n p d i tránh vsv bên ngoài xâm nh p Th 2 trong quá trình thí nghiêm thao ượ ắ ướ ậ ứtác c n nhanh đ tránh vsv bên ngoài xâm nh p nên n p l n phía trên giúp m và ầ ể ậ ắ ớ ở

52.5115

gggg

Chloramphenicol đ ngu i đ n 50ể ộ ế oC m i b sung vào.ớ ổ

Ti t tr ng môi tr ng 121ệ ườ ườ ở oC trong th i gian 15 phút.ờ

 Choloramphenicol th ng có tác d ng kìm khu n, nh ng có th di t khu nườ ụ ẩ ư ể ệ ẩ

n ng đ cao ho c đ i v i vi khu n nh y c m cao Chloramphenicol c

ch t ng h p protein c a nh ng vi khu n nh y c m b ng cách g n vàoế ổ ợ ủ ữ ẩ ạ ả ằ ắ

ti u th 50S c a ribosom.ể ể ủ

 Rose Bengal th ng đ c s d ng làườ ượ ử ụ  nh ng tác nhân c ch vi khu n.ữ ứ ế ẩ

SPW (SaltPepton Water): môi tr ng tăng sinh.ườ

ggml

Ti t trùng môi tr ng 121ệ ườ ở o C trong th i gian 15 phút.ờ

L u ý khi pha ư : do thành ph n c a Pầ ủ CA và DRBC có agar nên khi pha môi tr ng ph iườ ả

k t h p v i gia nhi t đ cho agar hoà tan đ ng đ u.ế ợ ớ ệ ể ồ ề

Sau khi pha xong:

 PCA: màu vàng.

 DRBC: màu đỏ.

 SPW: màu vàng.

2.2 Phân lo i môi tr ạ ườ ng:

2.2.1 Phân lo i môi tr ạ ườ ng nuôi c y vi sinh v t theo c u trúc: ấ ậ ấ

a Môi tr ng l ng: ườ ỏ

Th ng dung đ tăng sinh hoá, nhân gi ng th c p, lên men,…c a VSV Môiườ ể ố ứ ấ ủ

tr ng l ng không ch a ch t làm đ c môi tr ng, nh : agar, getalin….ườ ỏ ứ ấ ặ ườ ư

b Môi tr ng r n ườ ắ

Ngoài các thành ph n dinh d ng, môi tr ng r n là môi tr ng có thêmầ ưỡ ườ ắ ườthành ph n làm đ c (agar, gelatin….) ng i ta th ng dung lo i môi tr ng nàyầ ặ ườ ườ ạ ườphân l p VSV, quan sát khu n l c, đ nh l ng VSV (trong phân tích các ch tiêuậ ẩ ạ ị ượ ỉ

t ng s vi khu n hi u khí, t ng s n m men, n m m c…), hay nghiên c u nh ngổ ố ẩ ế ổ ố ấ ấ ố ứ ữ

2.2.2 Phân lo i môi tr ạ ườ ng nuôi c y VSV theo thành ph n: ấ ầ

a Môi tr ng t ng h p ườ ổ ợ : (n m men, n m m c…)ấ ấ ố

Là lo i môi tr ng có thành ph n hoá h c xác đ nh, đ c pha ch tạ ườ ấ ọ ị ượ ế ừ

nh ng hoá ch t tinh khi t.ữ ấ ế

Vd: môi tr ng nuôi c y n m men, n m m c Czapek-dox (đ c thay b ngườ ấ ấ ấ ố ượ ằDRBC)

b Môi tr ng t nhiên ườ ự

Là lo i môi tr ng ch a các thành ph n có ngu n g c t t nhiên, khôngạ ườ ứ ầ ồ ố ừ ự

có thành ph n hoá h c rõ rang.ầ ọ

c Môi tr ng bán t ng h p ườ ổ ợ :

Là lo i môi tr ng v a có m t s thành ph n hoá h c xác đ nh v a có m tạ ườ ừ ộ ố ầ ọ ị ừ ộ

s thành ph n có ngu n g c t nhiên g m nh ng h n h p ch t ch a xác đ nh rõ.ố ầ ồ ố ự ồ ữ ỗ ợ ấ ư ị

2.2.3 Phân lo i môi tr ạ ườ ng nuôi c y VSV theo công d ng: ấ ụ

a Môi tr ng ti n tăng sinh ườ ề :

Là môi tr ng l ng dùng đ tăng sinh không có tính ch n l c, làm giàu m tườ ỏ ể ọ ọ ậ

đ c a các VSV hi n di n trong m u Lo i môi tr ng này giàu dinh d ng khôngộ ủ ệ ệ ẫ ạ ườ ưỡ

có các ch t c ch tăng tr ng ch n l c, có tác d ng ph c h i và giúp s tăngấ ứ ế ưở ọ ọ ụ ụ ồ ự

tr ng đ ng th i c a nhi u lo i VSV hi n di n trong th c ph m nh ng ít nhi uưở ồ ờ ủ ề ạ ệ ệ ự ẩ ư ề

b t n th ng trong quá trình ch bi n và b o qu n th c ph m.ị ổ ươ ế ế ả ả ự ẩ

b Môi tr ng tăng sinh ườ

Là môi tr ng l ng dùng đ tăng sinh ch n l c đ i t ng VSV c n ki mườ ỏ ể ọ ọ ố ượ ầ ểnghi m và c ch s tăng tr ng c a các lo i VSV khác do có ch a các ch t cệ ứ ế ự ưở ủ ạ ứ ấ ứ

ch tăng tr ng đ c hi u.ế ưở ặ ệ

c Môi tr ng ch n l c ườ ọ ọ

Là môi tr ng r n dùng đ phân l p các khu n l c đ n c a đ i t ng choườ ắ ể ậ ẩ ạ ơ ủ ố ượVSV m c tiêu Thông th ng đ phân l p và xác đ nh VSV, ng i ta s d ng môiụ ườ ể ậ ị ườ ử ụ

tr ng có m c ch n l c khác nhau Các môi tr ng phân l p khác nhau có m cườ ứ ọ ọ ườ ậ ứ

ch n l c khác nhau M c đ ch n l c có th ki m soát b ng các ch t c ch tăngọ ọ ứ ộ ọ ọ ể ể ằ ấ ứ ế

tr ng, thành ph n môi tr ng, nhi t đ , oxi…ưở ầ ườ ệ ộ

d Môi tr ng phân bi t ườ ệ

Là môi tr ng r n có ch th giúp cho s phát hi n d dàng đ i t ng VSVườ ắ ỉ ị ự ệ ễ ố ượ

m c tiêu.ụ

e Môi tr ng ch n l c – phân bi t ườ ọ ọ ệ

Là môi tr ng k t h p gi a công d ng ch n l c và phân bi t nh s d ngườ ế ợ ữ ụ ọ ọ ệ ờ ử ụ

k t h p các hoá ch t khác nhau.ế ợ ấ

f Môi tr ng th nghi m sinh hoá ườ ử ệ

Là môi tr ng dùng đ xác đ nh m t ho c m t vài đ c đi m sinh hoá c aườ ể ị ộ ặ ộ ặ ể ủ

ch ng VSV đã đ c phân l p và làm thu n, t o c s đ đ nh danh ch ng phânủ ượ ậ ầ ạ ơ ở ể ị ủ

l p.ậ

g Môi tr ng đông khô th ng ph m ườ ươ ẩ

Là môi tr ng đ c pha ch s n (có th là t ng h p ho c bán t ng h p)ườ ượ ế ẵ ể ổ ợ ặ ổ ợ

d ng khô v i các thành ph n đ c đ nh s n b i nhà s n xu t Cho nên, các lo iạ ớ ầ ượ ị ẵ ở ả ấ ạmôi tr ng đông khô này h n ch s bi n đ ng các thành ph n c a môi tr ng.ườ ạ ế ự ế ộ ầ ủ ườ

Ng i ta th ng dung nh ng lo i môi tr ng này đ phân tích VSV.ườ ườ ữ ạ ườ ể

2.3Phân ph i môi tr ố ườ ng vào ng nghi m, và bình tam giác ố ệ :

 Cho 90ml m i lo i môi tr ng PCA, DRBC, SPW vào bình tam giác,sau đóỗ ạ ườ

đ y nút bông không th m n c và n p bình tam giác.ậ ấ ướ ắ

 Cho 10ml m i lo i môi tr ng PCA, DRBC, SPW vào bình ng nghi m,sauỗ ạ ườ ố ệ

đó đ y nút bông và n p ng nghi m Chú ý khi phân ph i vào ng nghi m ph iậ ắ ố ệ ố ố ệ ảlàm nhanh vì cho dung d ch vào v i th tích ít dung d ch sẽ mau đông.ị ớ ể ị

 Sau đó đem ng nghi m ch a PCA, DRBC đi h p ti t trùng.ố ệ ứ ấ ệ

 Sau khi h p xong ta đ t ng nghiêm ch a PDA, DRBC nghiêng <25ấ ặ ố ứ 0 (đ t oể ạ

b m t r ng h n cho vi c nuôi c y vi sinh v t) và m t s ng đ bìnhề ặ ộ ơ ệ ấ ậ ộ ố ố ể

th ng Khi nghiêng ng môi tr ng dâng lên cách mi ng ng 2 – 3 cm t cườ ố ườ ệ ố ứ

là 2/3 ng nghi m Không đ c đ môi tr ng ch y g n nút bông vàố ệ ượ ể ườ ả ầ

mi ng ng.ệ ố

Th ch đ t nghiêng ạ ặ

 Nhúng n c vào bông th m n c, đ p lên ng nghi m đã đ c đ tướ ấ ướ ắ ố ệ ượ ặnghiêng đ môi tr ng mau đông.ể ườ

- T quang: n i ti p nh n ánh sang t ngu n sang (đèn) đ h i t l i thànhụ ơ ế ậ ừ ồ ể ộ ụ ạchùm sáng h p.ẹ

- Ố ục t quang: đi u ch nh t quang lên hay xu ng khi quan sát m u nhu m màuề ỉ ụ ố ẫ ộhay m u s ng.ẫ ố

- Ốc ch nh thô ( c th c p): nâng lên hay xu ng khi quan sát m u nhu m hayỉ ố ứ ấ ố ẫ ộ

m u s ng.ẫ ố

- Ốc ch nh tinh ( c vi c p): gi ng nh c ch nh thô nh ng thay đ i tiêu c t cỉ ố ấ ố ư ố ỉ ư ổ ự ở ố

đ vi c p cho phép nhìn đ c nh nét h n.ộ ấ ượ ả ơ

2.3.2 Cách cho tiêu b n s ng lên lame: ả ố

 R a s ch lame và lamelle b ng c n 70ử ạ ằ ồ o, sau đó lau s ch.ạ

 Nhi u m t gi t tiêu b n s ng lên lame, ễ ộ ọ ả ố

 Đ y lamelle lên tiêu b n s ng: đ t lamelle nghiêng 1 góc 45ậ ả ố ặ 0 so v i lame,ớ

h lamelle t t xu ng lame.ạ ừ ừ ố

 Đ t lame lên bàn mang v t r i đi u ch nh kinh hi n vi cho đ n khi th yặ ậ ồ ề ỉ ể ế ấ

đ c n m men.ượ ấ

Hình nh quan sát đ ả ượ c trên kính hi n vi ể

Câu h i 1: ỏ Môi tr ườ ng DRBC là môi tr ườ ng gì? T i sao môi tr ạ ườ ng DRBC l i c ch ạ ứ ế

 Choloramphenicol th ng có tác d ng kìm khu n, nh ng có th di t khu nườ ụ ẩ ư ể ệ ẩ

n ng đ cao ho c đ i v i vi khu n nh y c m cao Chloramphenicol c ch t ng

h p protein c a nh ng vi khu n nh y c m b ng cách g n vào ti u th 50S c aợ ủ ữ ẩ ạ ả ằ ắ ể ể ủribosom

 Rose Bengal th ng đ c s d ng làườ ượ ử ụ  nh ng tác nhân c ch vi khu n.ữ ứ ế ẩ

Câu h i 2: Trong kỹ thu t nuôi c y VSV, m i loài ho c m i nhóm VSV ỏ ậ ấ ỗ ặ ỗ khác nhau, t i sao c n ph i pha ch các lo i ch t khác nhau và hàm l ạ ầ ả ế ạ ấ ượ ng cũng khác nhau?

Tr l i: ả ờ Vì môi tr ng dinh d ng c a vi sinh v t g m nhi u thành ph n dinh d ng ườ ưỡ ủ ậ ồ ề ầ ưỡ

c n thi t khác nhau, các vi sinh v t khác nhau có nh ng yêu c u không gi ng nhau v ầ ế ậ ữ ầ ố ềcác ch t dinh d ng (tuỳ thu c vào nhu c u c a t ng lo i vi sinh v t) cho nên có r t ấ ưỡ ộ ầ ủ ừ ạ ậ ấnhi u công th c pha ch môi tr ng nuôi c y v i các lo i ch t khác nhau và thành ph nề ứ ế ườ ấ ớ ạ ấ ầcũng khác nhau

BU I 3 Ổ KỸ THU T GIEO C Y VÀ PHÂN LO I VI SINH V T Ậ Ấ Ạ Ậ

3.1 Kỹ thuật gieo cấy:

3.1.1 Mục tiêu:

 Thực hiện được thí nghiệm lấy mẫu phân tích

 Thực hiện được kỹ thuật pha loãng bậc 10

 Thực hiện được kỹ thuật hộp trãi và hộp đổ

3.1.2 Nguyên tắc nuôi cấy vi sinh vật:

 Mọi thao tác nuôi cấy đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh tạpnhiễm vi sinh vật không mong muốn từ môi trường ngoài

 Môi trường và dụng cụ cấy đều phải được khử trùng triệt để

3.2 Kỹ thuật pha loãng mẫu:

 Dùng pipetteman với đầu tip vô trùng hoặc pipette 1ml vô trùng hút 1ml dịch mẫuvào ống nghiệm để được các ống nghiệm tiếp theo Sử dụng các đầu típ khác nhaukhi hút ở các nồng độ khác nhau vì khi hút có thể có 1 lượng vsv trên thành típ màmắt thường không nhìn thấy được ảnh hưởng đến kết quả cấy

 Thay vì dùng nước cất ta có thể sử dụng môi trường tăng sinh để pha loãng

Các loại môi trường gieo cấy:

 Đối với những ống nghiệm chứa thạch đứng thường dùng để cấy sâu đối với các visinh vật kị khí