NUÔI CẤY INVITRO TỪ MÔ SẸO

MỞ ĐẦU……………………………………………………………………….1 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………………2 1.1 Sơ lược lý thuyết mô sẹo…………………………………………………...2 1.1.1 Khái niệm mô sẹo…………………………………………………...2 1.1.2 Đặc tính của mô sẹo………………………………………………...2 1.1.3 Ứng dụng của mô sẹo……………………………………………...2 1.1.4 Sự tạo chồi từ mô sẹo……………………………………………....3 1.1.5 Cảm ứng tạo mô sẹo………………………………………………..4 1.2 Pháp nuôi cấy mô sẹo………………………………………………………4 1.2.1 Nguyên tắc nuôi cấy mô sẹo………………………………………..4 1.2.2 Đặc điểm của quá trình nuôi cấy mô sẹo…………………………..6 1.2.3 Nhân giống thông qua giai đoạn callus……………………………6 Chương 2: SƠ LƯỢC VỀ LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU TẾ BÀO THỰC VẬT.....................................................................................................................10 Chương 3: QUI TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO BẰNG CÁCH TẠO MÔ SẸO………………………………………………………………………..14 3.1 Sơ đồ ……………………………………………………………………….14 3.2 Thuyết minh……………………………………………………………….15 3.3 Vật liệu và môi trường nuôi cấy………………………………………….17 3.3.1 Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy…………………………………...17 3.3.1.1 Khoáng đa lượng……………………………………………………………17 3.3.1.2 Khoáng vi lượng……………………………………………………………..17 3.3.1.3 Vitamine ……………………………………………………………………..18 3.3.1.4 Các chất điều hòa sinh trưởng…………………………………………….18 3.3.1.5 Các chất hữu cơ khác……………………………………………………….18 3.3.2 Môi trường nuôi cấy………………………………………………...19 3.3.2.1 Đường………………………………………………………………..19 3.3.2.2 Các khoáng đa lượng……………………………………………...20 3.3.2.3 Các khoáng vi lượng……………………………………………….21 3.3.2.4 Các vitamine………………………………………………………..22 3.3.2.5 Các chất điều hòa sinh trưởng……………………………………23 3.3.2.6 Các chất hữu cơ khác……………………………………………...24 3.3.2.7 Chú ý…………………………………………………………………25 Chương 4: CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊNG CỨU…………………………26 4.1 Nghiên cứu sự hình thành mô sẹo và tế bào đơn cây Kiwi……………..26 4.1.1 Phân tích:……………………………………………………………26 4.1.1.1 Vật liệu………………………………………………………………26 4.1.1.2 Môi trường nuôi cấy:………………………………………………26 4.1.1.3 Điều kiện nuôi cấy………………………………………………….26 4.1.2 So sánh:……………………………………………………………...26 4.1.3 Kết luận:……………………………………………………………..28 4.2 Tạo mô sẹo và tái sinh chồi từ mô lá non cây bí Kì Nam……………….28 4.2.1 Phân tích…………………………………………………………….28 4.2.1.1 Vật liệu:……………………………………………………………...28 4.2.1.2 Phương pháp:………………………………………………………28 4.2.1.3 Môi trường nuôi cấy……………………………………………….29 4.2.1.4 Bố trí thí nghiệm……………………………………………………29 4.2.2 So sánh:……………………………………………………………...29 4.2.3 Đánh giá …………………………………………………………….30 4.3 Quá trình phát sinh mô sẹo và chồi của cây Long Não………………...30 4.3.1 Phân tích…………………………………………………………….30 4.3.1.1 Vật liệu………………………………………………………………30 4.3.1.2 Phương pháp………………………………………………………..31 4.3.1.3 Bố trí thí nghiệm …………………………………………………..31 4.3.1.4 Điều kiện nuôi cấy…………………………………………………31 4.3.2 Kết quả và thảo luận……………………………………… ………..32 4.3.3 Đánh giá:…………………………………………………………….34 4.4 Khảo sát khả năng tạo mô sẹo từ cuống lá, phiến lá và nụ hoa phục vụ cho việc vi nhân giống hoa đồng tiền (Gerbera jamesonii Bolus)………………………………………………………………………..34 4.4.1 Phân tích…………………………………………………………….34 4.4.1.1 Vật liệu:…………………………………………………….............34 4.4.1.2 Phương pháp……………………………………………………….34 4.4.2 So sánh :…………………………………………………………….35 4.4.3 Đánh giá:……………………………………………………………36 KẾT LUẬN……………………………………………………………….........36 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………….37 Ngành CNSH đã và đang ngày càng tỏ ra thực sự có ý nghĩa lớn đối với đời sống con người, hiện đã được Chính phủ ưu tiên đầu tư cho những nghiên cứuvà những kế hoạch mang tính ứng dụng cao. CNSH được xem là cánh tay đắc lực trong lĩnh vực nông nghiệp kỹ thuật cao và các nước phát triển trên thế giới đã và đang ứng dụng hiệu quả như Mỹ, Nhật, Thái Lan,...Ngành này không chỉ bó hẹp ở lĩnh vực nông nghiệp mà còn là ngành học của sức khỏe, khoa học thực phẩm và bảo vệ môi trường. Trong lĩnh vực nông nghiệp, CNSH hiện đại sẽ mang lại những đột phá về nhân giống, lai tạo giống cây trồng, vật nuôi, nuôi cấy mô thực vật và “cao cấp” hơn là sinh vật chuyển gene. Những giống cây trồng cho năng suất cao, kháng sâu bệnh, chịu được thuốc diệt cỏ, chịu được sự khắc nghiệt của môi trường sống, có khả năng loại bỏ chất ô nhiễm là những kết quả mà công nghệ sinh học nông nghiệp mang đến. Với xu thế phát triển nông nghiệp công nghệ cao thì triển vọng của ngành này là rất lớn. Nhờ ứng dụng các thành tựu mới mẻ của công nghệ sinh học như nhân giống in vitro bằng cách tạo mô sẹo ,... người ta có thể tạo ra được những giống cây trồng không những có năng suất cao mà còn chống chịu được với sâu bệnh, thích nghi tốt với thời tiết… Đối với các loại cây quí hiếm, có giá trị thương mại lớn, kĩ thuật nhân giống in vitro bằng cách tạo mô sẹo đã đem lại những hiệu quả kinh tế hết sức rõ rệt.

SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016 MỞ ĐẦU Ngành CNSH ngày tỏ thực có ý nghĩa lớn đời sống người, Chính phủ ưu tiên đầu tư cho nghiên cứuvà kế hoạch mang tính ứng dụng cao CNSH xem cánh tay đắc lực lĩnh vực nông nghiệp kỹ thuật cao nước phát triển giới ứng dụng hiệu Mỹ, Nhật, Thái Lan, Ngành không bó hẹp lĩnh vực nông nghiệp mà ngành học sức khỏe, khoa học thực phẩm bảo vệ môi trường Trong lĩnh vực nông nghiệp, CNSH đại mang lại đột phá nhân giống, lai tạo giống trồng, vật nuôi, nuôi cấy mô thực vật “cao cấp” sinh vật chuyển gene Những giống trồng cho suất cao, kháng sâu bệnh, chịu thuốc diệt cỏ, chịu khắc nghiệt môi trường sống, có khả loại bỏ chất ô nhiễm kết mà công nghệ sinh học nông nghiệp mang đến Với xu phát triển nông nghiệp công nghệ cao triển vọng ngành lớn Nhờ ứng dụng thành tựu mẻ công nghệ sinh học nhân giống in vitro cách tạo mô sẹo , người ta tạo giống trồng có suất cao mà chống chịu với sâu bệnh, thích nghi tốt với thời tiết… GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [1] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016 Đối với loại quí hiếm, có giá trị thương mại lớn, kĩ thuật nhân giống in vitro cách tạo mô sẹo đem lại hiệu kinh tế rõ rệt Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nuôi cấy tế bào thực vật 1.1.1 Khái niệm mô sẹo - Khi phần bị cắt hay bị tổn thương thân, rễ, … đặt vào môi trường thích hợp sau thời gian xuất phần mô lồi có màu trắng nhạt vàng nhạt mô gọi mô sẹo hay callus 11.2 Đặc tính mô sẹo - Mô sẹo phát triển không theo quy luật có khả biệt hóa thành rễ, chồi phôi để hình thành cấy hoàn chỉnh 1.1.1 Ứng dụng mô sẹo Nuôi cấy mô sẹo khâu quan trọng nuôi cấy mô tế bào Mô sẹo nguyên liệu khởi đầu cho nghiên cứu quan trọng khác như: phân hóa mô GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [2] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016 tế bào, chọn dòng tế bào, nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy phôi soma, sản xuất chất thứ cấp có hoạt tính sinh học… • Nhân giống in vitro loài thực vật phương pháp nhân giống đỉnh sinh trưởng hiệu hay khó thực nuôi cấy mô sẹo • Nghiên cứu trình hình thành quan • Làm nguồn nguyên liệu để nuôi cấy tế bào đơn cho chọn lọc dòng tế bào • Thu nhận sản phẩm hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học cao • Nuôi cấy huyền phù tế bào Nhân giống invitro cách tạo mô sẹo ứng dụng để nhân nhanh giống có xuất cao, chất lượng tốt, thích nghi với điều kiện sống trì ưu lai Khả sử dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật vào công tác giống trồng với mô sẹo có mục đích tạo phôi vô tính, nuôi cấy tế bào đơn tách tế bào trần, tạo có biến dị soma ( tạo nhiều biến dị nuôi cấy mô), tạo lượng chồi lớn( lớn phương pháp đỉnh sinh trưởng) Nhân giống invitro cách tạo mô sẹo giúp bảo tồn giống quý GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [3] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016 1.1.4 Sự tạo chồi từ mô sẹo Theo Thomas Davey (1975) hình thành chồi từ mô sẹo kích thích bởi: - Các chất sinh trưởng - Các chất sản sinh nuôi cấy mô sẹo - Các chất chứa sẵn mẫu cấy Khả hình thành chồi từ mô sẹo phụ thuộc vào: - Số lần cấy chuyền ( chất mẫu cấy có khả tổng hợp thời gian dài) - Sự hình thành tế bào xốp 1.1.2 Cảm ứng tạo mô sẹo Sự hình thành mô sẹo chia làm thời kỳ: - Thời kỳ cảm ứng tế bào chuyên hóa mẫu cấy chuyển ngược trạng thái phát triển, biến đổi hình thái chức theo hướng tế bào phân sinh - Thời kỳ phân chia tế bào: tế bào phân hóa mô sẹo có tần suất phân chia tương đối nhanh - Thời kỳ phân hóa tế bào: tốc độ phân chia sinh trưởng giảm dừng hẳn, mô sẹo xuất cấu trúc mô dẫn GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [4] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016 Tác nhân chủ yếu gây cảm ứng mô sẹo chất điều hòa sinh trưởng Không phải tất thực vật cảm ứng tạo mô sẹo chất sinh trưởng thực vật Tùy thuộc vào chủng loại mẫu cấy mà có khác biệt loại hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng bổ sung vào môi trường nuôi cấy để cảm ứng mô sẹo Tùy mục đích nghiêng cứu thực nghiệm mà chọn loại hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng thực vật cảm ứng mô sẹo 1.2 Pháp nuôi cấy mô sẹo 1.2.1 Nguyên tắc nuôi cấy mô sẹo Trong đặc tính sinh lý thể thực vật, bị tổn thương mặt vật lý (những vết cắt thể, tổn thương côn trùng công) thực vật có khả hình thành tế bào để hàn kín chỗ tổn thương Những tế bào hình thành tế bào mô sẹo Mô sẹo khối tế bào nhu mô phát triển vô tổ chức, diện giai đoạn hoá lignin khác thực vật, thường tế bào vùng tượng tầng (vùng phân sinh) tượng tầng liber –mộc, tượng tầng vỏ gốc đoạn cắt tạo thành Những tế bào mô sẹo thường có hình cầu, màu trắng nâu nhạt Khối mô sẹo có khả tái sinh thành hoàn chỉnh điều kiện môi trường chất kích thích sinh trưởng tạo mô sẹo GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [5] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016 Nuôi cấy tạo mô sẹo thực loài thực vật khả nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Những mô thực vật dùng nuôi cấy tạo mô sẹo là: tượng tầng libe mộc, tượng tầng vỏ, phôi nhũ, tế bào diệp lục, lá, trụ bì rễ, tử diệp… Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống mẹ Từ cụm tế bào mô sẹo tái sinh cho lúc cho nhiều chồi nuôi cấy Mô sẹo thường tạo xáo trộn trình tạo quan, tạo rễ Do đó, non hay mảnh thân non trưởng thành dễ tạo mô sẹo Ngược lại, mảnh quan trưởng thành khả tạo mô sẹo Sự tạo mô sẹo thực vật xảy môi trường nuôi cấy bổ sung lượng auxin (2,4-D) thích hợp Sự tạo mô sẹo tác dụng auxin trình: - Sự phản phân hoá tế bào nhu mô: xảy tế bào nhu mô mộc libe, nhu mô vỏ hay lõi - Sự phân chia tế bào tượng tầng: tế bào bào tượng tầng phần lớn hai mầm dễ dàng phân chia tác động auxin đỉnh sinh trưởng - Sự xáo trộn mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ) GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [6] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016 Màu sắc mô sẹo không giống môi trường nuôi cấy khác hay phận khác chúng thường có màu vàng, trắng, nâu hay trắng xanh… Nồng độ loại kích thích tố sử dụng môi trường nuôi cấy yếu tố có ảnh hưởng đến hình thành phát triển mô sẹo Thường mô sẹo hình thành môi trường giàu auxin; dùng auxin riêng rẽ hay kết hợp với kết hợp với cytokinin tùy loại Hàm lượng hormon nội sinh chiều di chuyển hormon mẫu cấy có ảnh hưởng đến phát sinh mô sẹo Vì nguồn mẫu cấy, việc lấy mẫu cấy, cách đặt mẫu cấy môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến phát sinh mô sẹo dẫn đến phản ứng khác mẫu cấy Với số vấn đề không quan trọng có số chịu ảnh hưởng lớn 1.2.2 Đặc điểm trình nuôi cấy mô sẹo Nuôi cấy tế bào thực vật khởi đầu việc hình thành tế bào không phân hóa, gọi callus Nuôi cấy callus đạt cách nuôi cấy mẫu mô tách từ thực vật môi trường dinh dưỡng có chất làm rắn agar GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [7] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016 Môi trường dinh dưỡng chứa chất dinh dưỡng khoáng đa lượng, vi lượng, nguồn carbon nhiều loại chất điều hòa sinh trưởng thực vật Đánh giá xác ảnh hưởng thành phần môi trường dinh dưỡng chất điều hòa sinh trưởng lên khả sinh trưởng callus yêu cầu quan trọng để xác định môi trường tối ưu cho nuôi cấy Các thông số phổ biến dùng đánh giá sinh trưởng nuôi cấy callus bao gồm khối lượng tươi, khối lượng khô số sinh trưởng Trong nuôi cấy callus, tế bào callus trải qua biến dị dòng soma trình cấy chuyển Vì vậy, dòng tế bào ổn định di truyền nên lựa chọn để tránh sản xuất thất thường chất trao đổi thứ cấp nuôi cấy Thông thường, sau số lần cấy chuyển, callus xem dòng tế bào đồng thông số sinh trưởng dòng tế bào lặp lại trình cấy chuyển loại môi trường nuôi cấy Bouque cộng (1998) nghiên cứu nuôi cấy 217 dòng callus khác từ loài chi Psoralea nhận thấy, sau 16 lần cấy chuyển (48 tuần), có khoảng 90% số dòng callus sinh trưởng ổn định Fett-Neto cs (1994) nuôi cấy tế bào Taxus cuspidate thu dòng tế bào ổn định sinh trưởng sau năm cấy chuyển 1.2.3 Nhân giống thông qua giai đoạn callus GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [8] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016 Trong nhân giống in vitro tái sinh hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu vật nuôi cấy ban đầu nhanh chóng thu mà đồng mặt di truyền Tuy nhiên, nhiều trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh mà phát triển thành khối callus Tế bào callus cấy chuyển nhiều lần không ổn định mặt di truyền Để tránh tình trạng thiết phải sử dụng loại callus vừa phát sinh, tức callus sơ cấp để tái sinh hy vọng thu tái sinh đồng Thông qua giai đoạn callus thu cá thể virus trường hợp Kehr Sehaffer (1976) thu tỏi GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [9] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016 Hình 4.2 Nhân giống thông qua giai đoạn tạo mô sẹo A Mô sẹo tỏi sau tuần nuôi cấy B Mô sẹo sau tuần nuôi cấy C Tạo chồi từ mô sẹo D Cây tái sinh từ mô sẹo E Củ tỏi thu từ nuôi cấy mô thông qua tạo mô sẹo Sơ đồ 4.2 Mẫu mô phát sinh callus, callus tạo chồi phát triển hoàn chỉnh (thông qua phương thức phát sinh chồi bất định) GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [10] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016 Chương CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VỀ NUÔI CÂY MÔ SẸO 4.1 Nghiên cứu hình thành mô sẹo tế bào đơn Kiwi ( Dương Tấn Nhựt*, Trần Thị Thu Hà, Trịnh Thị Hương, Hoàng Văn Cương, Nguyễn Phúc Huy) TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(4): 505-514 4.1.1 Phân tích: 4.1.1.1 Vật liệu Cây Kiwi tuần tuổi phòng sinh học phân tử chọn tạo giống trồng, Viện sinh học Nhiệt đới 4.1.1.2 Môi trường nuôi cấy: Môi trường MS có bổ sung 30g /l sucrose , 8g/l agar chất điều hòa sinh trưởng thực vật; pH khoảng 5,7 – 5,8 trước hấp khử trùng nhiệt độ 121 C, áp suất atm 30 phút 4.1.1.3 Điều kiện nuôi cấy Thời gian chiếu sáng 16h/ ngày, cường độ chiếu sáng 2,500 – 3000 lux độ ẩm trung bình 75 % - 80 % 4.1.2 So sánh: GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [30] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016 + Các mẫu hình thành mô sẹo tất thí nghiệm có bổ sung 2,4-D đạt 100 % ; môi trường không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng mẫu không phát sinh mô sẹo  chất điều hòa sinh trưởng đóng vai trò quan trọng môi trường nuôi cấy + Ở nồng độ 0,8 mg/l 2,4- D cho tiêu khối lượng tươi , khô lớn nhất, nồng độ ( 0,2 ; 0,4 ; 0,6 ; 1,0 mg/ l 2,4 – D ) khác biệt rõ ràng + Mô sẹo hình thành nồng độ 0,2 ; 0,4 ; 1,0 mg/l 2,4 – D có màu trắng đục, cứng ; nồng độ 0,6 mg/l 2,4- D có màu xanh nhạt, trong, mềm ; nồng độ 0,8 mg/l 2,4- D có màu xanh trong, mềm, xốp, thích hợp làm nguyên liệu cho nuôi cấy lỏng lắc  Môi trường MS có bổ sung 0,8 mg/l 2,4- D sau tuần nuôi cấy thích hợp để tạo mô sẹo từ mẫu kiwi in vitro + Mẫu đặt úp cho khối lượng tươi, khô mô sẹo hình thành cao so với mẫu đặt ngửa + Nồng độ 2,4 –D thích hợp cho nuôi cấy lỏng lắc tế bào kiwi 0,6 mg/l + pH môi trường thích hợp cho môi trường nuôi cấy lỏng lắc tế bào 0,1 + Nồng độ đường sucrose thích hợp 60g/ l + Bình nuôi có V=250 ml V môi trường tối ưu cho 0,8g mô sẹo sinh trưởng phát triển môi trường lỏng lắc 20ml GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [31] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016 Môi trường MS bổ sung 30g/l sucrose, 8g/l agar thích hợp cho hình thành mô sẹo 4.1.3 Kết luận: Từ kết thu cho thấy, môi trường MS có bổ sung 30 g/l sucrose, g/l agar 0,8 mg/l 2,4-D với mẫu đặt úp thích hợp cho hình thành mô sẹo từ mẫu Kiwi in vitro Môi trường MS lỏng có bổ sung 0,6 mg/l 2,4-D, 60 g/l sucrose với pH điều chỉnh 6,1 môi trường tối ưu cho sinh trưởng phát triển tế bào mô sẹo trình nuôi cấy lỏng lắc Thể tích môi trường lỏng 20 ml (đối với bình nuôi tích 250 ml) sau 16 ngày cấy chuyền tối ưu cho nuôi cấy 0,8 g mô sẹo Kiwi để thu huyền phù tế bào Tế bào mô sẹo chuyển từ môi trường rắn sang lỏng chịu số xáo trộn định, nên cần thời gian để thích nghi với môi trường điều kiện nuôi cấy, áp suất thẩm thấu… 4.2 Tạo mô sẹo tái sinh chồi từ mô non bí Kì Nam (Lê Hồng Giang Nguyễn Bảo Toàn Trường Đại học Cần Thơ )_ Tạp chí Khoa học 2010:16a 216-222 GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [32] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016 4.2.1 Phân tích 4.2.1.1 Vật liệu: + Cây bí Kì Nam thu đảo Phú Quốc , tỉnh Kiên Giang, trồng trại Nghiên cứu Thực nghiệm Nông Nghiệp , khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ 4.2.1.2 Phương pháp: - Khử trùng mẫu cấy + Mẫu non rửa nhẹ vòi nước máy, sau ngâm dung dịch bột giặt 10 phút, rửa lại vòi nước + Tiếp theo, mẫu khử trùng dung dịch sodium hypochloride 10 % điều kiện vô trùng, lắc nhẹ, rửa lần nước cất + Sau ngâm tiếp dung dịch HgCl2 , lắc nhẹ, rửa lần nước cất 4.2.1.3 Môi trường nuôi cấy + Môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật NAA BA, than hoạt tính 4.2.1.4 Bố trí thí nghiệm - Thí nghiệm 1: Hiệu NAA BA lên tạo mô sẹo GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [33] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016 + Đạt hiệu cao với tỉ lệ 75 % sau 40 ngày nuôi cấy - Thí nghiệm 2: Tái sinh chồi môi trường MS bổ sung than hoạt tính + Mô sẹo không phát sinh chồi môi trường có bổ sung than hoạt tính + Rễ nuôi cấy với mô sẹo tạo mô sẹo màu xanh đạt tỷ lệ khoảng 40 %, mô sẹo hình thành chồi với tỉ lệ 54,17 % 4.2.2 So sánh: - NAA có hiệu phản phân hóa mô để tạo mô sẹo từ mô non bí Kì Nam Sang môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l NAA đơn hay kết hợp mg/l BA hay bổ sung 2mg/l NAA kết hợp 2mg/l BA có hiệu cao tạo mô sẹo , đạt tỉ lệ 75 % sau 40 ngày nuôi cấy - Mô sẹo tạo từ mô non môi trường MS có bổ sung NAA & BA có dạng mềm, rời, có rễ, sinh trưởng nhanh môi trường MS chất điều hòa sinh trưởng thực vật, có bổ sung 1g/l than hoạt tính 4.2.3 Đánh giá - Mô sẹo hình thành quan chồi môi trường MS có bổ sung 1g/l than hoạt tính, mô sẹo nuôi cấy môi trường chết 100% GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [34] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016 - Mô sẹo từ mô non bí sinh trưởng nhanh môi trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng 4.3 Quá trình phát sinh mô sẹo chồi Long Não Nguyễn Thị Quý Cơ, Trần Văn Tiến, Võ Thị Bạch Mai, Trần Trọng Tuấn, Nguyễn Hải Sơn Chi cục Lâm nghiệp TP.HCM; Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, TP.HCM; Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam; Trường Đại học Cửu Long, Vĩnh Long 4.3.1 Phân tích 4.3.1.1 Vật liệu Chồi đỉnh đốt thân long não năm tuổi trồng Trạm thực nghiệm Lâm nghiệp Tân Tạo - Chi cục Lâm nghiệp thành phố Hồ Chí Minh, sau khử trùng cấy vào môi trường WPM bổ sung 2% sucrose, 0,5 mg/l BA để cảm ứng tạo chồi Sau 30 ngày, cắt chồi in vitro vừa hình thành làm vật liệu cho thí nghiệm nghiên cứu 4.3.1.2 Phương pháp Môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy môi trường WPM (McCown Woody plant medium) (Lloyd and McCown, 1980) bổ sung 2% sucrose, g/l GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [35] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016 agar, điều chỉnh pH 5,7 trước hấp khử trùng autoclave nhiệt độ 121ºC, áp suất 1atm 30 phút 4.3.1.3 - Bố trí thí nghiệm Nuôi cấy tạo mô sẹo Các non tách từ chồi in vitro đặt vào môi trường WPM bổ sung 2% sucrose chất điều hòa sinh trưởng thực vật NAA riêng rẽ (0,5 mg/l); NAA (0,5 mg/l) kết hợp với BA (0,2 mg/l); NAA (0,5 mg/l) kết hợp với 2,4D (0,2 mg/l); 2,4 D riêng rẽ (0,2 mg/l) Đánh giá khả tạo mô sẹo, khối lượng tươi, khối lượng khô sau 60 ngày nuôi cấy Đánh giá khả tái sinh chồi khả sinh phôi mô sẹo 4.3.1.4 Điều kiện nuôi cấy Mẫu nuôi cấy nhiệt độ 25 ± 2ºC, quang kỳ 12 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng 45 µmol.m-2s-1, độ ẩm trung bình 75 - 80 % 4.3.2 Kết thảo luận Mô sẹo phát triển không theo quy luật có khả biệt hóa thành rễ, chồi phôi để hình thành hoàn chỉnh Hai điều kiện cho tạo mô sẹo non phần non trưởng thành dễ cho mô sẹo điều kiện nuôi cấy in vitro, tác dụng auxin (như 2,4 D NAA ) áp dụng riêng rẽ hay phối hợp với cytokinin GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [36] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016 Trong thí nghiệm này, thời gian đầu sau 20 ngày nuôi cấy, cho thấy có tượng hóa nâu; sau 40 ngày, bắt đầu có hình thành mô sẹo vị trí vết thương Sau 60 ngày, khối mô sẹo phát triển mạnh, xốp có màu trắng ngà Trong đó, nghiệm thức WPM bổ sung 0,5 mg/l NAA kết hợp với 0,2 mg/l BA cho trọng lượng tươi trọng lượng khô cao 3,30g 0,27g thích hợp cho việc hình thành mô sẹo tốt so với nghiệm thức sử dụng auxin riêng lẻ không kết hợp với cytokinin Thông thường, 2,4 D chất có tác dụng mạnh việc kích thích hình thành mô sẹo, nhiên với long não, 2,4 D tác dụng NAA Mô sẹo hình thành môi trường WPM bổ 0,5 mg/l NAA hay môi trường WPM bổ sung 0,5 mg/l NAA 0,2 mg/l BA có trọng lượng tươi trọng lượng khô cao Trong trường hợp này, mô sẹo màu trắng vàng, xốp, tế bào có dạng cụm tròn, rời rạc nên có khả tái sinh cao Khi có diện 2,4 D môi trường nuôi cấy, hiệu hình thành mô sẹo thấp khả tái sinh giảm Đặc biệt, khối mô sẹo hình thành môi trường WPM bổ sung 0,2 mg/l 2,4 D có trọng lượng tươi (0,66g) trọng lượng khô thấp (0,04g) ; đồng thời, khối mô sẹo mềm, mọng nước, màu trắng đục, tế bào trơn láng, không hình thành cụm Sự tạo mô sẹo phụ thuộc vào nguồn gốc mô cấy auxin Thông thường, 2,4 D NAA thường sử dụng làm nguồn auxin ngoại sinh cho hình thành mô sẹo loài thực vật (Dixon and Gonzales, 1994; Hsia and Korbam, 1996; Morita et al., 1999) Ngoài ra, việc cảm ứng tạo mô sẹo GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [37] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016 thường đòi hỏi kết hợp auxin cytokinin (Bùi Trang Việt, 2000) Mẫu non từ chồi in vitro cấy vào môi trường có NAA; 2,4 D hầu hết có tượng hóa nâu, tinh dầu tiết gây nên tượng Tuy nhiên sau 40 ngày nuôi cấy, tác động chất điều hòa sinh trưởng thực vật, mô sẹo bắt đầu hình thành từ vị trí vết thương, sau tế bào mô sẹo phát triển mạnh tạo thành khối Mô thực vật bị tổn thương có khuynh hướng làm lành vết thương cách phản phân hóa tế bào để phân chia tạo tế bào khác che lấp vùng bị tổn thương Nhờ có chất điều hòa sinh trưởng thực vật, tế bào thúc đẩy phát triển nhanh Tóm lại, việc sử dụng auxin riêng lẻ hay kết hợp với cytokinin môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng khác trình cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu cấy Sự kết hợp auxin cytokinin môi trường nuôi cấy với tỉ lệ định ảnh hưởng đến trình tạo sẹo (Letham, 1974; Akiyashi et al., 1983) cytokinin giúp trình xảy nhanh Vì vậy, kết hợp 0,5 mg/l NAA 0,2 mg/l BA môi trường khoáng WPM cho hiệu tạo mô sẹo cao hơn, khối mô sẹo tạo nhiều hơn, trọng lượng tươi trọng lượng khô cao 4.3.3 Đánh giá: GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [38] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016 Kết thí nghiệm cho thấy môi trường WPM bổ sung 0,5 mg/l NAA 0,2 mg/l BA tốt cho việc hình thành mô sẹo từ tế bào nhu mô non vị trí vết thương 4.4 Khảo sát khả tạo mô sẹo từ cuống lá, phiến nụ hoa phục vụ cho việc vi nhân giống hoa đồng tiền (Gerbera jamesonii Bolus) (Nguyễn Thị Mỹ Duyên , Trương Thị Hằng - ThS Khoa Nông nghiệp & Tài nguyên Thiên nhiên, Trường Đại học An Giang Khoa Nông nghiệp & Tài nguyên Thiên nhiên, Trường Đại học An Giang)- Tạp chí khoa học trường đại học An Giang (2014) 4.4.1 Phân tích 4.4.1.1 - Vật liệu: Giống hoa đồng tiền ĐT 54 màu cam, thuộc giống lai tạo từ viện ăn miền Nam, sau mang vườn Long Xuyên trồng thu mẫu làm thí nghiệm 4.4.1.2 Phương pháp - Thí nghiệm 1: Nghiên cứu thời gian khử trùng thích hợp HgCl 0,1% cho cuống phiến non hoa Đồng tiền GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [39] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016  HgCl2 0,1% với thời gian 10 phút cho hiệu khử trùng tốt hai loại mẫu cấy cuống non phiến non hoa Đồng tiền  Mẫu cấy từ phiến cho kết tạo mẫu in vitro 62,5% cao so với mẫu cấy cuống 50% - Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng BA, NAA 2,4D đến tạo mô sẹo cuống lá, phiến nụ hoa non Đồng tiền  Trên phiến non nụ hoa non có tượng tạo mô sẹo tốt cuống non, đa số cho mô sẹo chặt, có màu xanh mô sẹo dễ dàng tái sinh chồi  Đến giai đoạn 28 ngày sau cấy, tạo mô sẹo tăng thêm mẫu cấy( cuống non, phiến non, nụ hoa non) - Thí nghiệm 3: Nhân mô sẹo - Thí nghiệm 4: Nuôi cấy chồi hoa Đồng tiền 4.4.2 So sánh : - Khử trùng Đồng tiền HgCl2 0,1% với thời gian tốt 10 phút Dưới mức thời gian cho tỷ lệ nhiễm cao - Mô sẹo tạo tốt môi trường B3 (MS + 1,5 mg/l 2,4D) hầu hết mẫu cấy cuống non, phiến non nụ hoa non hoa Đồng tiền (phiến non cho tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo cao nhất, Và hai loại mẫu cấy GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [40] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016 phiến non nụ hoa non cho kết tạo mô sẹo cao 83,3% (28 NSKC)) - Kết nhân mô sẹo tốt môi trường MS bổ sung mg/l BAP + mg/l kinetin + mg/l NAA + 2,5 mg/l 2,4D sau tuần nuôi cấy - Nghiệm thức tốt cho việc nhân mô sẹo C1 (3 mg/l BA + 0,5 mg/l NAA) C6 (3 mg/l BA + mg/l TDZ) Vì theo Nguyễn Văn Hồng (2009), mô sẹo có màu xanh, vàng đến vàng nhạt có khả tái sinh thành chồi cao - Đối với việc nhân chồi hoa Đồng tiền, môi trường thích hợp MS có sử dụng mg/l BA, - Khi sử dụng môi trường MS bổ sung 1,5 mg/l BAP có thêm 15% nước dừa mang lại hiệu cao nhân nhanh chồi sau tái sinh 4.4.3 Đánh giá: - Đối với việc nhân chồi hoa Đồng tiền, nồng độ BA cao mg/l cho kết nhân chồi không cao GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [41] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016 KẾT LUẬN Với lợi tạo số lượng giống mới, đồng đều, bệnh , bảo tồn vốn gen ( gen quý) mẹ, hạn chế tạo biến dị di truyền, sản xuất hợp chất thứ cấp… , nhân giống in vitro cách tạo mô sẹo mở hướng cho sản suất nông nghiệp hàng hóa nay, hướng phát triển cần phải quan tâm , đầu tư phát triển thêm GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [42] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi Trang Việt (2000) Sinh lý thực vật đại cương Phần I: Dinh dưỡng Nhà xuất Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh Dương Tấn Nhựt, Trần Thị Thu Hà, Trịnh Thị Hương, Hoàng Văn Cương, Nguyễn Phúc Huy, TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(4): 505-51 Lê Hồng Giang Nguyễn Bảo Toàn Trường Đại học Cần Thơ _ Tạp chí Khoa học 2010:16a 216-222 Nguyễn Đức Lượng Lê Thị Thuỷ Tiên 2002 Công nghệ tế bào, Nhà xuất Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Quý Cơ, Trần Văn Tiến, Võ Thị Bạch Mai, Trần Trọng Tuấn, Nguyễn Hải Sơn,Tạp chí Khoa học Phát triển 2014, tập 12, số 7: 10341041 GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [43] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016 Nguyễn Thị Mỹ Duyên , Trương Thị Hằng _Tạp chí khoa học trường đại học An Giang (2014) GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [44] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật [...]... 3.3.2 Môi trường nuôi cấy GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [21] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016 Thành phần nuôi cấy mô thực vật thay đổi tùy theo loài, bộ phận và mục đích nuôi cấy vì vậy thành phần môi trường là khác nhau Thành phần môi trường còn thay đổi theo các giai đoạn phát triển, phân hóa khác nhau của mẫu cấy và mục đích nuôi cấy như: duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, ... hợp làm nguyên liệu cho nuôi cấy lỏng lắc  Môi trường MS có bổ sung 0,8 mg/l 2,4- D sau 4 tuần nuôi cấy là thích hợp để tạo mô sẹo từ mẫu lá kiwi in vitro + Mẫu lá đặt úp cho khối lượng tươi, khô của mô sẹo hình thành cao hơn so với mẫu lá đặt ngửa + Nồng độ 2,4 –D thích hợp nhất cho nuôi cấy lỏng lắc tế bào kiwi là 0,6 mg/l + pH môi trường thích hợp nhất cho môi trường nuôi cấy lỏng lắc của tế bào... hình thành mô sẹo từ mẫu lá cây Kiwi in vitro Môi trường MS lỏng có bổ sung 0,6 mg/l 2,4-D, 60 g/l sucrose với pH được điều chỉnh về 6,1 là môi trường tối ưu nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của tế bào mô sẹo trong quá trình nuôi cấy lỏng lắc Thể tích môi trường lỏng 20 ml (đối với bình nuôi có thể tích 250 ml) và cứ sau mỗi 16 ngày thì cấy chuyền là tối ưu nhất cho nuôi cấy 0,8 g mô sẹo cây Kiwi... khoảng 40 %, và mô sẹo này hình thành chồi với tỉ lệ 54,17 % 4.2.2 So sánh: - NAA có hiệu quả trong sự phản phân hóa mô để tạo ra mô sẹo từ mô lá non cây bí Kì Nam Sang môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l NAA đơn hay kết hợp 2 mg/l BA hay bổ sung 2mg/l NAA kết hợp 2mg/l BA có hiệu quả cao trong sự tạo mô sẹo , đạt tỉ lệ 75 % sau 40 ngày nuôi cấy - Mô sẹo được tạo ra từ mô lá non trên môi trường MS có bổ... tạo mô sẹo GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [33] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016 + Đạt hiệu quả cao với tỉ lệ 75 % sau 40 ngày nuôi cấy - Thí nghiệm 2: Tái sinh chồi trên môi trường MS bổ sung than hoạt tính + Mô sẹo không phát sinh chồi trên cả môi trường không có và có bổ sung than hoạt tính + Rễ nuôi cấy cùng với mô sẹo tạo mô sẹo màu xanh đạt tỷ lệ khoảng 40 %, và mô. .. giống: + Mẫu được nuôi cấy trên môi trường nhân tạo để tạo mô sẹo, , sau đó biệt hóa thành các mô khác nhau để tạo thể nhân giống in vitro - Các phương pháp tăng sinh mô + Tạo phôi soma + Tăng cường sự phát triển chồi bên + Sự phát triển chồi bất định - Nhân giống in vitro: + Vật liêu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thường giống môi trường tạo thể chồi Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp... sinh trưởng của mô sẹo cà rốt trên môi trường rắn có chứa thạch agar - Năm 1939, ba nhà khoa học Gautheret, Nobecourt và White đã đồng thời nuôi cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và thuốc lá, mô sẹo có khả năng sinh trưởng liên tục - Năm 1941, nhà khoa học Overbeck chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa trong nuôi cấy phôi từ mẫu cây họ cà... hòa sinh trưởng thực vật trong nuôi cấy invitro - Năm 1958, Kerint và Sterwward tạo được phôi và cây hoàng chỉnh từ tế bào thượng tâng cây cà rốt - 1960 Morelddax thành công trong nhân giống invitro lòa lan Cymbidium từ mẫu nuôi cấy là đỉnh sinh trưởng Nuôi cấy các đỉnh sinh trưởng hình thành dạng cụm chồi gọi là các protocom Khi tách các protocom tiếp tục nuôi cấy trên môi trường phù hợp, mẫu sẽ hình... Helminthosporium maydis trong nuôi cấy mô sẹo ngô - Năm 1980-1992 nhiều thành công mới trong lĩnh vực công nghệ gen thực vật Hiện nay, nuôi cấy mô tế bào thực vật đang ở giai đoạn thứ 4, nuôi cấy mô được ứng dụng khá phổ biến trong nhân giống cây trồng, chọn tạo giống, tạo đột biến, tạo sinh khối, sản xuất các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học… các ứng dụng về nuôi cấy mô tế bào thực vật nói riêng... trên môi trường MS không có chất điều hòa sinh trưởng thực vật, không có hoặc có bổ sung 1g/l than hoạt tính 4.2.3 Đánh giá - Mô sẹo không có sự hình thành cơ quan chồi trên môi trường MS không có và có bổ sung 1g/l than hoạt tính, mô sẹo nuôi cấy trên cả 2 môi trường này đều chết 100% GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [34] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016 - Mô sẹo từ mô ... CoCl2.6H2O - Iodua kali KI 3.3.1.3 Vitamine GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [20] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật SVTH: Phạm Như Ngọc 201 5-2 016 - Myo- inositol - Acid nicotinic - Pyroidyxin HCl - Thiamin... 3.3.1.2 Khoáng vi lượng - Sunphat mangan MnSO4.4H2O - Acid boric H3BO5 - Kẽm sunphat ZnSO4.7H2O - Magie sunphat MgSO4.7H2O - Molydat amon (NH4)6Mo7O24.4H2O - Molydat Natri NaMoO4 - Clorua coban... chỉnh Thành phần môi trường nuôi cấy gồm: - Đường làm nguồn cung cấp cacbon - Khoáng đa lượng - Khoáng vi lượng - Các vitamine - Chất điều hòa sinh trưởng - Ngoài ra, tùy thuộc vào mục đích cấy