CHUYỂN GEN KHÁNG HIV Ở KHỈ VÔ MÈO

Con mèo nhà là một loài có hệ thần kinh phức tạp, các loài có thể truy cập với giá trị cụ thể trong các tình huống nghiên cứu nơi động vật gặm nhấm là không phù hợp trên cơ sở tính dễ mắc bệnh, kích thước, hoặc các yếu tố khác. Ví dụ, các nghiên cứu trong con mèo đã tiết lộ nhiều kiến thức hiện nay của chúng ta về các tổ chức của bộ não động vật có vú, đặc biệt là vỏ não, và người và mèo được mỗi ảnh hưởng với virus mãn tính AIDS đại dịch nhạy cảm với các yếu tố hạn chế các loài cụ thể. Một khả năng cho biến đổi thông tin di truyền mèo là cần thiết để nhận ra tiềm năng đặc biệt. Dưới đây chúng tôi giới thiệu một yếu tố hạn chế retrovirus, rhesus macaque TRIMCyp và GFP, vào dòng tế bào mầm mèo nhà. Phương pháp thiết lập trao đổi thông tin di truyền bởi biến đổi gen giao tử trực tiếp lần đầu tiên trong bất kỳ động vật ăn thịt. Chúng tôi sản xuất các kết quả thống nhất chuyển gen và quan sát biểu hiện phổ biến rộng rãi, không có khảm, và truyền tải dòng mầm mà không có F1 im lặng. Tế bào Lympho mèo TRIMCyp chuyển gen chống FIV nhân rộng. Cách tiếp cận này mang lại một khả năng đầu tiên để thử nghiệm thao tác các yếu tố hạn chế vi rút AIDS tại các hệ thống, mức độ chăn nuôi toàn bộ trong một loài nhạy cảm. Ngoài việc xác định nếu một loài có thể được thực hiện miễn dịch di truyền virus AIDS của nó, nó có thể được sử dụng để kiểm tra HIV1 gen tiềm năng điều trị, và để xây dựng mô hình mèo có liên quan đến các bệnh khác. Felis catus đã được thuần hóa trong hơn 9.000 năm và số lượng 0,51,0 tỷ trên toàn thế giới. Giám sát y tế của động vật đồng hành phổ biến ...

1 SỰ TRAO ĐỔI THÔNG TIN DI TRUYỀN HẠN CHẾ VIRUS AIDS VÀO TRONG CON MÈO NHÀ Pimprapar Wongsrikeao1, Dyana Saenz1, Tommy Rinkoski1, Takeshige Otoi2 & Eric Poeschla1,3 GIỚI THIỆU Con mèo nhà loài có hệ thần kinh phức tạp, loài truy cập với giá trị cụ thể tình nghiên cứu nơi động vật gặm nhấm không phù hợp sở tính dễ mắc bệnh, kích thước, yếu tố khác Ví dụ, nghiên cứu mèo tiết lộ nhiều kiến thức tổ chức não động vật có vú, đặc biệt vỏ não, người mèo ảnh hưởng với virus mãn tính AIDS đại dịch nhạy cảm với yếu tố hạn chế loài cụ thể Một khả cho biến đổi thông tin di truyền mèo cần thiết để nhận tiềm đặc biệt Dưới giới thiệu yếu tố hạn chế retrovirus, rhesus macaque TRIMCyp GFP, vào dòng tế bào mầm mèo nhà Phương pháp thiết lập trao đổi thông tin di truyền biến đổi gen giao tử trực tiếp lần động vật ăn thịt Chúng sản xuất kết thống chuyển gen quan sát biểu phổ biến rộng rãi, khảm, truyền tải dòng mầm mà F1 im lặng Tế bào Lympho mèo TRIMCyp chuyển gen chống FIV nhân rộng Cách tiếp cận mang lại khả để thử nghiệm thao tác yếu tố hạn chế vi rút AIDS hệ thống, mức độ chăn nuôi toàn loài nhạy cảm Ngoài việc xác định loài thực miễn dịch di truyền virus AIDS nó, sử dụng để kiểm tra HIV-1 gen tiềm điều trị, để xây dựng mô hình mèo có liên quan đến bệnh khác Felis catus hóa 9.000 năm số lượng 0,5-1,0 tỷ toàn giới Giám sát y tế động vật đồng hành phổ biến rộng lớn, 250 bệnh lý di truyền phổ biến cho mèo người biết đến Bộ gen Felis catus gần giải trình tự lắp ráp xảy Hơn 90% gen xác định mèo có homolog, so sánh với chuột có xếp lại gen Kích thước trung bình, khả sinh sản nhiều, giống với hệ thống người, phong phú, chi phí khiêm tốn phức tạp hệ thần kinh thú ăn thịt làm cho mèo có giá trị nghiên cứu thử nghiệm khác nhau, từ sinh học thần kinh di truyền, nhãn khoa bệnh truyền nhiễm khác Chúng bao gồm điều kiện mà chuột không hữu ích sở tính dễ mắc bệnh, kích thước quan yếu tố khác Các biến đổi di truyền vậy, quan tâm cho nghiên cứu sức khỏe người mèo có tiềm để phát triển bảo vệ khỏi tác nhân gây bệnh dịch để giải phóng khác nhau, loài ngoại mèo, tất 36 phải đối mặt với mối đe dọa tuyệt chủng Trên giới có hai đại dịch AIDS, mèo nhà đại dịch khác người Các vius mãn tính nguyên nhân gây bệnh, feline immuno- deficiency virus (FIV) HIV-1, đánh giá cao, chúng tương tự cấu trúc gene, biểu bệnh tế bào chủ sử dụng yếu tố phụ thuộc Sự khác biệt lentivirus có nhiều thông tin có khả khai thác Ví dụ, yếu tố hạn chế lentivirus cific lentiviral TRIM APOBEC3 protein-s6 trình hạn chế FIV HIV- với mẫu khác biệt Những gen chưa nghiên cứu cách có kiểm soát cấp độ hệ thống loài cách giới thiệu vào hệ gen loại virus AIDS dễ mắc loài (linh trưởng thú họ mèo giới) Với thách thức cố hữu để biến đổi di truyền khỉ, virus– sus- ceptible AIDS mèo dùng riêng cho nghiên cứu đưa vào phương pháp di truyền sử dụng chuột Ngược lại với loài linh trưởng, loài mèo thiếu kháng virus TRIM5α genes11 có potently hạn chế proteins9,10 APOBEC3, thiết lập khả hấp dẫn để thử nghiệm gen cấp toàn động vật, cho trao miễn dịch gen dựa thân họ thiết kế vari ants12, 13 có khả để phát triển mô hình bệnh Để nhận tiềm loài virus học mô hình không virus học, phương tiện để thực hành sửa đổi hệ gen mèo cần thiết Tế bào soma chuyển nhân (SCNT) gần sử dụng để tạo mèo thể proteins14,15 huỳnh quang Tuy nhiên, hiệu nhân vô tính động vật thấp, kết SCNT bị lỗi lập trình lại biểu sinh hầu hết phôi Động vật có vú nhân với tổng giải phẫu dường bình thường có nhiều bất thường thất bại để xóa lập trình lại nhớ biểu sinh hoàn toàn Hai phương pháp để tạo chuột biến đổi gen tiêm DNA vào nhân non phôi thụ tinh tiêm tế bào gốc phôi biến đổi gen (ESC) dòng vào giai đoạn đầu phôi Tuy nhiên, động vật có vú nonrodent, tiêm vào nhân non không hiệu quả, phương pháp thứ hai bị chặn thiếu ESC germline có khả Sự biến đổi di truyền với germline trans - mision đạt số động vật có vú vector lentivirus tiêm vào tế bào trứng hợp tử đơn bào Điều không đạt loài động vật ăn thịt Dưới trình bày noãn bào nhắm mục tiêu biến đổi di truyền lentivirus mèo nhà KẾT QUẢ Đa biến đổi gen thể mèo khảm hệ phôi Chúng tối ưu hóa chất phản ứng, sưu tập giao tử, vi tiêm para- metter, nuôi cấy phôi chuẩn bị nhận để thiết lập mèo biến đổi gene tối ưu (Fig 1a) Chúng thu từ giao tử hai giới mà không cần thủ tục bổ sung vi phẫu quan sinh dục động vật bị loại bỏ sau phun thiến Hình | chuyển gen hệ phôi mèo giao thức chuyển gene Tối ưu hóa PMSG: mang thai hormon kích thích sinh dục huyết ngựa; HCG: hormon kích thích sinh dục màng đệm người; IU, đơn vị quốc tế; IVM: làm chín invitro; IVC: nuôi cấy invitro (b) Biểu gen nuôi invitro phôi giai đoạn đầu phát triển (blastocyst) sau tiêm pre – IVF lentiviral vector vào noãn bào mèo Chuyển gen GFP vào phôi mèo giai đoạn đầu phát triển từ noãn bào trước thực IVF với TsinG Ảnh tiêu điểm biến đổi gen (TBDmGpT), phôi nang miễn dịch với virus thấy có gắn tín hiệu HA-tagged rhTRIMCyp, GFP gene phát huỳnh quang sứa, DAPI nhuộm thấy hình ảnh DNA hạt nhân hai gene kết hợp (a) (c) (d) (e) Trong thí nghiệm tóm tắt bảng phụ 1, tiêm 195 lớp vitro-trưởng thành I II trứng mèo nhà để tiêm lentivirus vector TSinG5 quanh bề mặt noãn bào (PVSMI); thực tiêm 10-12 h trước 10-12 sau thụ tinh ống nghiệm (IVF) (Hình bổ sung.) Sau nuôi phôi giai đoạn phôi nang (ngày 7) So sánh tỷ lệ phát triển phôi (bảng phụ 2) tăng cường biểu GFP (gọi GFP suốt) (Hình 1b) cho thấy tỷ lệ chuyển gene thành công mức cao (> 75%) trình dung nạp tốt, phân chia túi phôi tỷ lệ hình thành không khác biệt đáng kể PVSMI phôi chứng (Bảng 1) Không có khác biệt hình thái tổng số tế bào ưu tiên cho tiêm vector thời gian trước sau thụ tinh ống nghiệm (Bảng 1) Tuy nhiên, khảm ghi biểu protein huỳnh quang không đồng dạng túi phôi không đáng kể chúng tiêm vectơ trước thực IVF đáng kể với tiêm sau thụ tinh ống nghiệm(Bảng 1) Để điều tra nhiều gen chuyển thể phôi mèo bước PVSMI, vi tiêm 418 tế bào trứng với vector lentivirus đơn kép gen chuyển Tổ hợp gen chuyển gen mã hóa GFP, GFP cộng RFP, GFP cộng rhesus macaque TRIMCyp (Hình 1.) Sự kết hợp sau thể từ promoter kép (f) 2A đơn peptide liên kết preprotein Sau tiêm, thực tiêm với tinh trùng mèo 10 sau Chúng quan sát phôi phổ biến, biểu phong phú hai protein mã hóa gen vectơ kép phôi nang mèo tiêm vector lentivirus trước thực IVF (hình 1b Và Bảng 2) Chúng quan sát thấy tác dụng có hại trước IVF phát triển phôi biểu GFP không phân biệt kết hợp gen chuyển (Bảng 2) Ngoài ra, peptide 2A promoter kép cách hiệu để biểu đồng thời sáng-tối 14-10 h Chúng quản lý để mèo mang thai tác dụng hormon kích thích sinh dục huyết ngựa vào ngày hormon kích thích sinh dục màng đệm người vào ngày -1 với lentivirus vector truyền vào, giao phối phóng thích chúng từ ngày tiêm hormon kích thích sinh dục người vào ngày trước chuyển phôi thắt ống dẫn tinh mèo đực, xác nhận không tinh trùng mèo đực để gây rụng trứng hình thành thể vàng phẫu thuật bị thủng nang với kim, tự nhiên rụng trứng Yếu tố hạn chế mèo biến đổi gen hệ GFP Hai mươi hai phôi chuyển giao có kết năm mang thai (có nhãn A-E), năm sinh ba mèo sống (Bảng 1) Chúng đạt tỷ lệ cao biến đổi gen, với 10 số 11 sinh kiểm tra thấy biến đổi gen (1/12, cách tự nhiên bị sẩy thai 10 ngày non, tiêu thụ mẹ thay kiểm tra) Ba đực hai mèo biến đổi gen cái, tên TgCat1-5, sinh tự nhiên tất năm biến đổi gen (Hình 2, bảng bổ sung hình 2) TgCat1 (đực), TgCat2 (đực) TgCat3 (cái) sống sót, mèo thứ tư thứ năm chết (Bảng 1) TgCats1-3 mạnh mẽ (g) (h) Quá trình từ sưu tập trứng chuyển vào ống dẫn trứng 3-4 ngày (Hình 1a.) Chúng lựa chọn ngẫu nhiên phôi cho cắm sâu vào từ tế bào trứng phân cắt mà phải chịu tác động IVF chuyển chúng vào ống dẫn trứng phẫu thuật tiếp xúc lúc 48-72 h sau lentivirus vector dẫn truyền Chúng thực chọn lọc trước cho biểu gen sau tiêm (phôi chọn huỳnh quang đáng tin cậy vào thời điểm chuyển giao) Chúng thực chuẩn bị đồng hormon chuyển vào mèo môi trường ánh (i) từ sinh ra, cho ăn, chơi, phát triển xã hội hóa bình thường khỏe mạnh, TgCat2 bị ẩn tinh hoàn Nó có viêm da ngứa không liên tục, mà dị ứng thực phẩm Trong năm phát triển thoát vị bụng kích thích đưa tinh hoàn xuống, chữa khỏi phẫu thuật Mặc dù loại trừ vector chèn gen độc tính TgCat2 điều kiện hội chứng dễ nhận biết (j) (k) (l) Mười lăm đến hai mươi lăm phôi, sản phẩm tế bào trứng tiêm vào, chuyển giao cho ống dẫn trứng để tổng cộng 30-50 chuyển giao; 22 chuyển gen dẫn đến mang thai (A-E) Lứa tuổi tính đến tháng Bảy năm 2011 Trong tổng số vector TSinT2AG TgCat5 chết lưu sau bong non xảy ra, phát triển đầy đủ kiểm tra siêu âm ngày trước sinh cho thấy nhịp tim bình thường; TgPre7 không khả thi chẩn đoán siêu âm bị phá khoảng ngày 50 thai kỳ Trong tổng số vector Tsing Ngày 45 chụp X quang thai kỳ C cho thấy năm bào thai Họ sinh sớm khoảng 10 ngày, 51-53 ngày thai kỳ, với hình thái kích thước thích hợp cho giai đoạn cuối (m) TgPre5 tiêu thụ người mẹ thay phân tích Fan phát triển, thai nhi không chuyển gen giao h sau TgCat3 Không mang thai kết hai chuyển phôi vector tải nạp TBDmGpR (n) (o) Souther blot DNA sau cắt enzyme cắt giới hạn từ ba mèo biến đổi gen sống, từ TgCat4 từ bốn bào thai bị sẩy thai cho thấy tất tám biến đổi gen, với 6-12 chèn mèo (Fig 2b) Xét nghiệm PCR gen DNA xác nhận mức độ cao chuyển đổi gen (Hình 2c) Băng lai Southern blot cụ thể, tất kiểm soát mèo DNA, khác từ mèo để mèo lớn so với kích thước tối thiểu dự đoán xác định khoảng cách từ vị trí hạn chế kết thúc vector tiền virus, lập đồ hệ gen mèo (Bảng phụ 3) (p) (q) (r) Hình |mèo mang gen chuyển (A) ánh sáng huỳnh quang bao quanh 485 hình ảnh nM ánh sáng chiếu sáng cho tín hiệu GFP vào thời điểm sau sinh cho TgCat3 Trong 30 ngày tháng hình ảnh chụp ảnh TgCat3với mèo đối chứng không chuyển gen (bên phải) Lông, móng vuốt, râu ria, mũi, lưỡi niêm mạc miệng họng huỳnh quang hiển nhiên; huỳnh quang không rõ vùng lông đen (s) (B) hiển thị kết Southern blot DNA từ TgCat1, TgCat2 TgCat3 khoảng cách từ ngã ba DNA vật chủ vectơ để gen AflIII gần vị trí BamH1trong cặp sở; P, promoter; LTR, lặp lại đoạn cuối dài; G, EGFP (mẫu dò); T, TRIMCyp DNA đoạn cuối phân giải với AflIII (blot trái) ADN hệ gen từ tế bào đơn nhân máu ngoại vi phâng giải với BamH1 (blot phải) Sau điện di chuyển sang Southern blot, màng khảo sát cho tổng hợp DNA vector (C) DNAđược khuếch đại PCR bán định lượng mèo con, DNA sử dụng mồi cho chuỗi rhTRIMCyp (t) (u) DNA tế bào lưỡng bội bình thường hóa với tín hiệu thu với mồi GAPDH (v) (w) 10 (x) (y) (z) (aa) (ab) Hình | điểm yếu miễn dịch thách thức FIV tế bào máu đơn nhân (PBMCs) chuyển gen (a) băng điện di cho GFP chóp HA rhTRIMCyp PBMCs phân lập từ mèo biến đổi gen kiểm soát Tất PBMC kích hoạt ), trừ mẫu TgCat1 nhãn “không làm phóng xạ” (b) Dòng chảy đếm tế bào phân tích GFP biểu PBMCs tỷ lệ tế bào GFP dương (ac) Toàn thể phân tích cho thấy biểu gen diện rộng (ba) TgCat4 sinh sau mang thai đơn giản thời điểm mang thai bình thường (65 d) Đó hình thái bình thường chết sau đẻ từ tai nạn sản khoa liên quan đến nguyện vọng rõ ràng, nguyên nhân xác xác định khám nghiệm tử thi Con mèo cung cấp hội để nghiên cứu tất mô (Fig 5a) Kiểm tra quan chi tiết mô học không xác định bất thường TgCat4 sản phẩm noãn bào tải nạp vector TsinG, GFP thúc đẩy promoter HCMV, chèn 10 vector (Fig 5) Như TgCat3, mèo huỳnh quang màu xanh rực rỡ lông da, immunoblotting tiết lộ biểu phong phú GFP tất mô thử nghiệm: não, tủy sống, tim, lách, da, cơ, gan, thận, ruột non dày (Fig 5a bổ sung hình 4) Nội tạng rõ ràng huỳnh quang màu xanh cấp tổng, mô mỡ (ví dụ, tất chất béo thuộc màng nối màng tim) ghi nhãn kháng thể mô cố định thấy biểu thống tất tế bào (Hình 5c) Khi mô sống khúc chụp ảnh trực tiếp cho GFP kính hiển vi huỳnh quang (bb) biểu phổ biến tương tự (Hình 5d.) Một thai kỳ thứ tư (C; Bảng 1), mà chúng xác định năm hình thành, phù hợp với kích thước xương thai nhi cách phân tích X quang ngày 45 thai kỳ (bổ sung hình 2d.), Kết thúc bị sẩy thai nối tiếp ngày 51 53 (~ 10 d trước hạn) Chúng phục hồi bốn số mèo non (tên TgPre1-4; Bảng 1) cho gộp phân tử khám nghiệm tử thi Giải phẫu không xác định khuyết tật bẩm sinh Đối với TgCat1-4, Souther blot cho thấy TgPre1-4 chuyển gen đầy đủ, với 10-13 gen chèn vector TsinG (Fig 5b) biểu GFP tương tự tìm thấy tất mô thử nghiệm (Hình 5a, c) Chúng thăm dò biểu rhTRIMCyp (Hình bổ sung.) Sử dụng nội tạng từ mèo chết yểu sau đứt thai (Bảng 1; TgCat5), quan sát thấy biểu rhTRIMCyp phổ biến tương tự, bao gồm quan lymphoid (hạch bạch huyết, tuyến ức lách) Phù hợp với liệu immunoblotting, mô quan cá nhân huỳnh quang màu xanh cấp tổng FACS PBMCs thai nhi từ TgPre14 cho thấy 74-100% GFP dương (Hình 5e) Souther blots DNA từ sản phẩm thai kì không đơn (bc) độc mìn mà có tạp nhiễm (hình 2b Và 5b), cho thấy sản phẩm độc đáo mặt di truyền noãn bào tải nạp khác nhau, không tạo sản phẩm song tính sau dẫn truyền (bd) Thảo luận Kết mèo biến đổi gen sử dụng vật thí nghiệm cho nghiên cứu y sinh học Cách tiếp cận cho phép thực chuyển đổi gen biến đổi gen tế bào mầm cho lần loài động vật ăn thịt Đáng ý, đạt kết thống chuyển gen, giảm chi phí sàng lọc thời gian Một ý nghĩa thứ hai hiệu cao số đạt nên để chuẩn độ vector liều xuống để tiêm vào tế bào kết hợp vectơ vào tế bào trứng để sản xuất phức tạp đa chuyển gien Cách tiếp cận mở đường: tế bào trứng mèo có thẩm quyền cho chuyển gen hiệu quả, dễ dàng thu không xâm lấn không làm trình gia súc gia tăng từ buồng trứng bị loại bỏ trình phun định kỳ (nội soi thu hồi trứng qua da siêu âm dẫn đường khả thi) Trong túi phôi ống nghiệm tốc độ phát triển cao nhìn thấy trước với phôi chuyển gen tế bào soma (be) chuyển nhân (SCNT) phát triển (1920% so với 3%) 14 Chúng ngăn cản khảm vi tiêm trước thụ tinh ống nghiệm quan sát truyền dòng mầm Sự tồn biểu gen chuyển mèo F1 khuyến khích cho việc thiết lập đường dây hữu ích biến đổi gen Việc thiếu chủng đa dạng bẩm sinh mèo, hạn chế nay, giải dự án chăn nuôi tập trung Giới thiệu yếu tố hạn chế lentivirus (s) vào hệ gen mèo có tiềm cụ thể loài tự nhiên dễ bị nhiễm trùng lentivirus (và AIDS) chuột, chưa sửa đổi biến đổi gen, không bị nhiễm với virus Một số câu hỏi giải Đầu tiên, liệu giới thiệu yếu tố hạn chế hoạt động vào hệ gen loài vi rút AIDS nhạy cảm bảo vệ nó, vậy, mà ba mức độ rộng rãi xem xét việc đến khía cạnh: truyền, thành lập virus máu trì phát triển bệnh Khi gen vi-rút bị thẩm vấn cấp toàn động vật chuyển gen vật chủ tự nhiên, kết tạo ngạc nhiên cung cấp số thông tin Ví dụ, can thiệp chuyển gen gần chống lại cúm gà ngăn ngừa lây truyền vi rút thứ cấp để liên lạc chuyển gen không chuyển, (bf) tác dụng tử vong sau kiểm tra khả mẫn cảm với virus Bởi yếu tố hạn chế lentivirus loài cụ thể chưa kiểm tra cách giới thiệu thử nghiệm kiểm soát thành vật, câu hỏi trực tiếp với cách tiếp cận cho dù yếu tố hạn chế chuyển gen bắt chước thí nghiệm tự nhiên mà thường diễn rộng lớn mà thời gian tiến hóa, với lựa chọn loại thải siêu vi, đưa loài miễn dịch di truyền để lentivirus riêng Nó đưa dự đoán rõ ràng Ví dụ, có khỉ tự nhiên khỉ mặt TRIM5 mà không chặn khỉ truyền virus suy giảm miễn dịch động vật họ này, xuất để hạn chế mức độ nhân rộng thể gây áp lực lựa chọn vỏ capsid Khi lai mở rộng hoàn thành với yếu tố hạn chế mèo biến đổi gen, thách thức FIV thực Dù có hay không nhiều yếu tố hạn chế cần thiết để đạt bảo vệ chống vi rút, khái niệm việc sử dụng chúng cho mục đích liệu pháp gen kích thích nỗ lực để đưa không thích miễn dịch người mèo Cả hai TRIMCyps gần kĩ sư công nghệ sinh học hạn chế FIV kiểm tra hệ thống Thật (bg) vậy, FIV số lentivirus bị hạn chế TRIMCyps khỉ già trẻ giới Chúng cho mèo chuyển gen với phân tử bảo vệ vật chủ trao bảo vệ từ virus gây bệnh cho loài mèo hoang dã, tất phải đối mặt với mối đe dọa tuyệt chủng nhanh chóng đơn vị phân loại hệ sinh thái mang tính biểu tượng có sức lôi động vật ăn thịt Mèo chuyển gen có tác động bổ sung Như đề xuất gần đây, mèo nhà có tiềm cho mô hình HIV1 bệnh vì, ngoại trừ cho thụ thể nhập bào virus, gen mèo cung cấp yếu tố phụ thuộc cần thiết cho HIV-1 nhân rộng Đây khác biệt so với chuột Gen dễ tháo lắp nhắm mục tiêu dự đoán cách kết hợp phương pháp tiếp cận với công nghệ Hơn nữa, tiếp cận chuyển gen này, loài phong phú với kích thước trung gian tế bào có liên quan đến hệ thần kinh phức tạp cho phép vật mẫu khác có liên quan lĩnh vực sinh học thần kinh, nơi mà mèo mô hình tối quan trọng Các nghiên cứu mèo tiết lộ nhiều kiến thức tổ chức não động vật có vú, đặc biệt vỏ não thị (bh) giác; làm việc lĩnh vực quan trọng để làm sáng tỏ chế thần kinh thị giác Mặc dù chuyển gen loài không phổ biến loài gặm nhấm, việc tạo số lượng nhỏ đường với công cụ di truyền xây dựng sở tri thức lớn loài để làm thay đổi đáng kể khả cho hiểu biết vỏ não (bi) Những chuột biến đổi gen có nhiều lợi thế, khác biệt với sinh lý người hạn chế sử dụng chúng nhiều cách Nhiều bệnh mô hình hóa chuột Transgenesis thực marmosets28, chứng minh truyền dòng mầm, macaques29 Hai mô hình động vật linh trưởng tương đối rõ ràng, hạn chế phát sinh khan hiếm, chi phí, thời gian mang thai dài khỉ, thời gian kéo dài đến tuổi trưởng thành (4-8 năm) yêu cầu để bảo vệ xử lý từ việc truyền cercopithecine herpesvirus Đối với mục đích việc AIDS có liên quan, New World khỉ loài khỉ đuôi sóc không nhạy cảm với lentivirus (bj)Ngay với promoter virus generic quan sát biểu gen chuyển 16 số 16 phận thể mèo thử nghiệm Chúng quan sát thấy biểu rhTRIMCyp mô bạch huyết AIDS có liên quan (hạch bạch huyết, lách tuyến ức) Mature lưu thông dòng máu tiếng chuyên môi trường phiên mã, 15-80% PBMCs mèo sống GFP-dương nuôi cấy Biến thể phản ánh hiệu ứng định vị gen Trong đó, mô-cụ thể promoter tăng cường yếu tố khác sử dụng, mèo với phần biểu PBMC cung cấp hội thử nghiệm tốt, họ cho phép câu hỏi lựa chọn dòng tế bào vi rút qua trung gian vivo30 giải quyết, mô hình dựa tế bào thực tế tình hình điều trị, ví dụ, liệu pháp gen HIV-1 bệnh Một vấn đề quan trọng liệu có phải nhiễm FIV dẫn đến lựa chọn lâu dài chủng tế bào lympho virus-refrac- tory quan sát thấy thiếu thốn nonobese gây tiểu đường nặng kết hợp miễn dịch với (NOD-SCID) IL2Rγ chuột vô cấy với CCR5 - / - CD34 cells30 Ngược lại, hệ thống virus nhân lên, xác định đột biến có phát sinh hay không? (bk) (bl) Các Phương pháp phương pháp tài liệu tham khảo liên quan có sẵn phiên trực tuyến báo http://www.nature.com/naturemethods / Lưu ý: thông tin bổ sung có sẵn trang web Nature Methods (bm) (bn) Lời cảm ơn Tài trợ từ Viện Quốc gia Hoa Kỳ Y tế cấp AI47536 EY14411 hỗ trợ trước phát triển công nghệ then chốt Chúng cảm ơn Helen C Levitt Foundation tài trợ thí điểm ban đầu A Keller phối hợp đó, thành viên phòng thí nghiệm cho thảo luận trợ giúp hữu ích, H Fadel cho việc hỗ trợ với trang web hướng đột biến, thành viên loài chuột biến đổi gen để chia sẻ vi tiêm thiết bị, G Towers (University College London) cho rhTRIMCyp cDNA, Mayo Clinic cán thú y để tư vấn hỗ trợ phẫu thuật (bo) (bp) Tác giả đóng góp Tất tác giả thiết kế thí nghiệm, phân tích liệu phê bình thảo E.P hình thành dự án tuyển dụng P.W T.O E.P T.O giám sát dự án P.W D.S sản xuất vector giao tử lấy; P.W microinjected vector kỹ thuật nuôi cấy làm phôi P.W phôi chuyển với hỗ trợ từ T.R E.P phẫu thuật P.W., D.S T.R (bq) mèo theo dõi, làm xét nghiệm tế bào mô virus P.W., D.S E.P viết thảo (br) Lợi ích cạnh tranh tài Các tác giả tuyên bố lợi ích tài cạnh tranh (bs) (bt) Được đăng trực tuyến http://www.nature.com/naturemethods / in lại cho phép thông tin có sẵn trực tuyến http: //www.nature com / in lại / index.html (bu) MenottiRaymond, M & O'Brien, S.J Mèo nhà, Felis catus, mô hình bệnh di truyền nhiễm trùng Thông tin mô hình Nghiên cứu Y sinh (ed., Conn, PM) 221-232 (Humana Press, 2008) (bv) O'Brien, S.J et al Nghiên cứu genomics mèo Xu hướng Genet 24, 268-279 (2008) (bw) Meli, M.L et al Virus bệnh bạch cầu mèo mầm bệnh khác mối đe dọa quan trọng tồn linh miêu Iberian nguy cấp (Lynx pardinus) PLoS ONE 4, e4744 (2009) (bx) Willett, B.J et al Sử dụng chung thụ thể chemokine CXCR4 mèo virus suy giảm miễn dịch người J Virol 71, 6407-6415 (1997) (by) Llano, M et al Một vai trò thiết yếu cho LEDGF / p75 hội nhập HIV (bz) (ca) Khoa học 314, 10 Stern , M.A et al Nhân rộng sản xuất Vif - khảm HIV - tế bào mèo J Virol 84 , 7378-7395 (2010 ) (cg) 11 McEwan , W.A et al TRIM5 phân dạng Mèo giải thích vắng mặt virus giới hạn tế bào mèo nhà J Virol 16 , (ch) 461-464 (2006) (ci) 8270-8275 Huthoff, H & Towers, G.J Hạn chế chép virus (cj) 12 (cb) APOBEC3G / F TRIM5alpha Xu hướng Microbiol 16, 612-619 (2008) (cc) Saenz, DT, Teo, W., Olsen, JC & Poeschla, E Hạn chế vi rút suy giảm miễn dịch mèo Ref1, LV1 protein TRIM5a linh trưởng J Virol 79, 15.175-15.188 (2005) (cd) Wilson, S.J et al Tiến hóa độc lập TRIMCyp kháng virus khỉ nâu Proc Natl Acad Khoa học viễn tưởng USA 105, 3557-3562 (2008) (ce) (cf) Munk , C et al Chức năng, cấu trúc , cách đọc thông qua nối thay gen APOBEC3 mèo Genome Biol , R48 (2008 ) (2009 ) Dietrich, I et al Potent hạn chế lentivirus giống mèo TRIM5, tổng hợp cyclophilin A phản ứng tổng hợp J Virol 84, 8980-8985 (2010) 13 Neagu, M.R et al Ức chế mạnh HIV-1 TRIM5-cyclophilin, protein phản ứng tổng hợp từ thành phần người J Clin Đầu tư 119, (ck) (cl) 3035-3047 (2009) 14 Yin, X.J et al Thế hệ mèo biến đổi gen nhân biểu protein huỳnh quang màu đỏ Biol Reprod 78, 425431 (2008) (cm) 15 Gomez, M.C et al Thế hệ mèo chuyển gen nhân sử dụng vector lentivirus Nhân tế bào gốc 11, 167-176 (2009) (cn) 16 Meissner, A & Jaenisch, R chuyển nhân động vật có vú Dev Dyn 235, (co) (cp) 2460-2469 (2006) 17 Yamanaka, S & Blau, H.M Tái tạo nhân ba phương pháp tiếp cận Nature 465, 704-712 (2010) (cq) (cr)18 Pfeifer, A lentivirus transgenesis-một công cụ đa cho nghiên cứu liệu pháp gen Curr Gene Ther 6, 535-542 (2006) 19 Richardson, M.W et al Phương thức lây truyền ảnh hưởng đến suy giảm miễn dịch virus loại 1ở người hạn chế TRIM5alpha rhesus J Virol 82, 11.117-11.128 (2008) (cs) (ct) 20 Lyall, J et al Ngăn chặn lây cúm gia cầm gà biến đổi gen Khoa học 331, 223-226 (2011) 21 Lim, S.Y et al TRIM5alpha điều khiển virus suy giảm miễn dịch khỉ Rhesus PLoS Pathog 6, e1000738 (2010) (cu) 22 Bieniasz, P.D & Cullen, B.R Nhiều tác nhân để suy giảm miễn dịch người từ virus loại tế bào động vật gặm nhấm J Virol 74, 9868-9877 (2000) (cv) 23 Hubel, D.H & Wiesel, T.N Các lĩnh vực kiến trúc (cw) chức vỏ não thị giác mèo J Physiol (Lond.) 160, 106-154 (1962) 24 Hubel, D.H & Wiesel, T.N Các giai đoạn nhạy cảm với tác động sinh lý với mèo J Physiol (Lond.) 206, 419-436 (1970) (cx) 25 Blakemore, C & Văn Sluyters, R.C Yếu tố bẩm sinh môi trường phát triển vỏ não thị giác mèo J Physiol (Lond.) 248, 663-716 (1975) (cy) 26 Blakemore, C., Van Sluyters, RC, Peck, CK & Hein, A Sự phát triển vỏ não thị giác sau mắt mèo Nature 257, 584-586 (1975) (cz) 27 Douglas, R.J & Martin, K.A Mạch thần kinh vỏ não Annu Rev Neurosci 27, 419451 (2004) (da) 28 Sasaki, E et al Thế hệ loài linh trưởng (không phải người) biến đổi gen với khả di truyền dòng mầm Nature 459, 523-527 (2009) (db) 29 Yang, S.H et al Chú ý đến mô hình biến đổi gen bệnh Huntington động vật linh trưởng (không phải người) Nature 453, 921-924 (2008) (dc) 30 Holt, N et al Tế bào gốc/máu tổ tiên người (dd) thay đổi zinc-finger nucleases, mục tiêu để kiểm soát CCR5 HIV-1 thể Nat Biotechnol 28, 839-847 (2010) (de) (df) Phương pháp trực tuyến Tổng hợp Tất thủ tục với gia súc chấp thuận Mayo Clinic, Animal Care sử dụng Ủy ban an toàn sinh học Các nghiên cứu liên quan đến pathogen cụ thể (nghiên cứu mèo) cung cấp thức ăn nước uống miễn phí Kiểm tra nhà cung cấp để loại trừ tác nhân gây bệnh cụ thể cho mèo herpesvirus (rhinotracheitis), virus bệnh bạch cầu mèo, mèo calicivirus, coronavirus mèo, virus panleukopenia mèo, virus suy giảm miễn dịch mèo, mèo nhiễm đầy tranh cãi viêm phúc mạc, bệnh dại, chlamydia mèo toxoplasmosis Vắc xin đưa sở là: mèo herpesvirus virus bệnh dại, calcivirus, virus panleukopenia, Chlamydia psittaci (dg) Mèo nhà polyestrous cần tăng cường theo dõi định kỳ, kiểm soát thời gian light31 Thao tác dài ngày sử dụng để gây estrus32 ánh sáng 14 h 10 h chu kỳ ngày đêm tối (dh) trì sở này, với khởi đầu nhẹ lúc 06:00 Một mèo đực thắt ống dẫn tinh, xác minh để có azoosper - mic, cung cấp cho phôi phụ nữ người nhận cho giao phối lib thể hình 1a (di) Ooctye in vitro trưởng thành (IVM) Giao tử sử dụng để hình thành phôi lấy từ tuyến sinh dục bị loại bỏ sau khử trùng tự chọn Khu phức hợp tế bào trứng (Oocyte - cumulus complexes (COCs) thu hồi vòng lặp lại slicing với mô buồng trứng có sửa đổi đệm phosphat mặn (Mpbs) có bổ sung mg ml-1 albumin huyết bò (BSA) 50 mg ml-1L gentamicin Chỉ cấp I II oocytes33 sử dụng COC chọn rửa trưởng thành biến đổi TCM-199 (Gibco) có chứa IU ml-1 chorionic người gonadrotropin (HCG), 0.5 IU ml-1 mang thai gonadotropin huyết ngựa (PMSG), 10 mg ml-1 yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF), mg ml-1 BSA không khí ẩm có 5% CO2 không khí 38 ° C 28 h (dj)Thụ trinh ống nghiệm nuôi cấy invitro 28 sau IVM bổ sung tinh trùng, rửa hai lần Brackett-Oliphant vừa bổ sung 137 mg ml-1 sodium pyruvate, mg (dk) ml-1 BSA, 50 mg ml-1 gentamicin, ly tâm (dl) 1800 rpm phút Các dịch bỏ thu bột tinh trùng dưới, pha loãng 500 ml thụ trung bình (G-IVF Plus, Vitrolife), đặt lồng ấp phép tinh trùng bơi lên 30 phút Nồng độ tinh trùng điều chỉnh tới × 106 ml-1 10 tế bào trứng chuyển vào 100 ml microdroplets tinh trùng dầu khoáng đồng nuôi cấy 12 h, sau hợp tử giả định gỡ bỏ từ tinh trùng với pipette nhỏ nòng, rửa sạch, nuôi cấy dung dịch muối cân biến đổi Earl (MK -1) sup - plemented với mg ml-1 BSA 50 mg ml-1 gentamicin cho d Ba ngày sau tiếp xúc với tinh trùng, phôi phân chia, lựa chọn để chuyển nhượng sau nuôi cấy MK-1 vừa bổ sung 5% (v/v) FBS (FBS, phòng thí nghiệm Hyclone) 50 mg ml-1 gentamicin cho thêm ngày để đánh giá lực phát triển để phôi dâu phôi nang giai đoạn (dm) Sản xuất phôi biến đổi gen Trước tiêm đến lentivirus vector, tế bào cumulus móc lấy từ tế bào trứng 18 20 h sau ủ môi trường nuôi chín (trước nhóm tiêm IVF) từ (dn) hợp tử khoán tối 12-14 h sau ủ thụ tinh trung bình (sau tiêm nhóm IVF) Một khối lượng ~ 100 pl vector tiêm trực tiếp vào không gian noãn perivitelline 12 h trước 12 sau thụ tinh ống nghiệm cách sử dụng mịn kéo kính mao quản (Femtotips, Eppendorf) kết nối với microinjector (Eppendorf FemtoJet) có điều chỉnh độ phun áp suất bồi thường với lần tiêm 12 s Sau tiêm, tế bào trứng rửa trở nuôi cấy IVM vừa thứ 28, trưởng thành chúng sử dụng cho IVF Đối với tiêm sau IVF, hợp tử rửa sau nuôi cấy MK-1 trung bình Với điều kiện phát triển, tế bào trứng biến đổi mức độ cao độc tính rõ ràng cho hợp tử phát triển ban đầu thời gian microinjec- tion trước thụ tinh tạo đáng tin cậy phôi phi khảm (do) Chuyển phôi, phát mang thai, sinh đẻ ảnh graphy (dp) SPF 2-3 tuổi phương tiện chuyển phôi Nó hoạt động với 150 IU PMSG tiêm bắp 96-120 h trước thụ tinh ống nghiệm, sau tiêm 100 IU HCG 72 h sau PMSG Ngoài ra, việc giao phối lib với mèo đực bị thắt ống dẫn tinh thực từ ngày (dq) HCG injec- tion ngày trước cấy phôi Các mèo bị đánh thuốc mê vào ngày chuyển nhượng với keta- (5mg kg-1), medetomidine (0,03mg/kg) buprenorphine (0.01mg kg-1) dùng đường tiêm bắp trì với 1-3% khí isoflurane Trước rạch bụng, medetomi - đảo ngược với tiêm bắp atipamezole để giảm thiểu tác dụng alpha - agonist Một vết rạch đường khoảng cm bụng thực vào buồng trứng, vào ống dẫn trứng exteriorized Mỗi buồng trứng kiểm tra rụng trứng Nếu kiêm hemorrhagi- corpus hay thể vàng, nang trứng đâm kim để giả tạo gây rụng trứng Sau đó, lỗ transmural ống dẫn trứng thực với kim 28 gauge điều thay tay kéo pipette chuyển thuỷ tinh, qua 15-25 phôi nạp sẵn (tải nạp, chẻ, > giai đoạn tế bào ) 10-20 ml MK-1 vừa chuyển giao cho ống dẫn trứng kính hiển vi visualiza – tion Các pipette thu hồi vết rạch khâu lại thành ba lớp (dr) Tình trạng mang thai xác định với kit relaxin dành cho chó (Synbiotics) vào ngày thứ 30 sau chuyển giao (ds) phim chụp X quang vào ngày 45 Mèo nhận mang thai theo dõi hàng ngày hạn thời gian sinh mèo xảy sinh tự nhiên có hỗ trợ Tất hoạt động động vật biến đổi gen chụp ảnh với máy ảnh Nikon lúc cách sử dụng ánh sáng giống hệt nhau, lọc, cài đặt máy ảnh, với GFP chụp ảnh ánh sáng màu xanh chiếu sáng với lọc thông dài (dt) Bổ sung hình (du) Chứa hình ảnh bổ sung Miễn dịch huỳnh quang mô miễn dịch Phôi nang (Hình 1c.) gắn vào mặt với BD - Cell Tak, tế bào mô kết dính, cố định vào permeabilized 15 phút nhiệt độ phòng PBS có bổ sung % (w/v) paraformalde - hyde 1% (v/v) Triton X - 100 chặn 1% BSA PBS 15 phút Tải nạp, kiểm soát phôi nang kích hoạt PBMCs chụp kính hiển vi tiêu điểm với GFP fluroes - huỳnh chụp ảnh trực tiếp HA - tagged rhTRIMCyp, phát sử dụng anti - HA (ái lực cao chống HA đơn dòng chuột, Roche, sử dụng độ pha loãng 1:1000) , sau ủ RT, rửa sạch, sau ủ với Cy3, liên hợp chống kháng thể (dv) IgG giây - bậc trung (1:500 pha loãng, Chemicon International ) cho 1h Điều khiển protein xác nhận tín hiệu xuyên tiếp nhận kênh phôi nang có nguồn gốc từ trứng untransduced âm tính hình Sau phút để thực bước rửa PBS gắn với việc bổ sung chống phai thuốc thử với DAPI (Invitrogen) cho nhuộm DNA hạt nhân, phôi phân tích kính hiển vi đồng tiêu laser (Axiovert (dw) (dx) 100M; Carl Zeiss MicroImaging) Mô động vật cố định với 4% paraformaldehyde parafin Nối tiếp 10 micromet phần thực Mô miễn dịch thực cách sử dụng DAKO Envision Plus Phần Dewaxed xylene hydrat rượu Hoạt động peroxidase nội sinh bị chặn lại với 0,03% hydrogen peroxide Phần ủ với độ pha loãng 1:200 kháng thể đơn dòng chuột (Clontech, JL8, 1:5000 ) 2h Dako Envision chống chuột kháng thể thứ cấp (1:200) áp dụng 30 phút Các phần gắn kết cách sử dụng kéo dài vàng chống phai màu thuốc thử quan sát kính hiển vi ánh sáng Mô động vật cố định với 4% paraformaldehyde (dy) parafin-nhúng Nối tiếp 10 micromet phần thực Mô miễn dịch thực cách sử dụng DAKO Envision Plus Phần Dewaxed xylene hydrat rượu Hoạt động peroxidase nội sinh bị chặn lại với 0,03% hydrogen peroxide Phần ủ với 1: 200 pha loãng chuột kháng thể đơn dòng (Clontech, JL8, 1: 5000) h Dako Envision chống chuột kháng thể thứ cấp (1: 200) sau áp dụng 30 phút Các phần gắn kết cách sử dụng Kéo dài vàng chống phai màu thuốc thử quan sát kính hiển vi quang học Vectors nhiễm FIV Tất vectơ trình tự vector có sẵn từ tác giả theo yêu cầu Vector lentivirus HIV-1 dựa việc cho phép PCR dựa theo dõi nhiễm FIV thí nghiệm tương lai GFP phiên nâng cao (EGFP) Tsin vector lentivirus loạt trước described5, sử dụng trước sánh 293T thâm chuyển Nunc nhà máy di động con- centrated siêu ly tâm sử dụng phương pháp 34-36 thành lập Các vectơ chuyển tiếp có cPPT-CTS WPRE yếu tố U3-xóa Vectơ gen kép với Rhesus (Macaca mulatta) TRIMcyp8 EGFP sử dụng lợn teschovirus 2A pep- tide37 thể (dz) pro-protein đơn (cytomegalovirus người gen sớm (HCMV) -promoted rhTRIMCypP2A-GFP) promoter bidirectional vui lòng cung cấp Amendola et al.38 với tandemly xếp kinase phosophglycerate (PGK) CMV tối thiểu (mCMV, 0.16 kb) yếu tố promoter chuyển rhTRIMcyp GFP tương ứng sợi đối diện VSV- vectơ G-type giả sản xuất nhà máy di động hai buồng (CF2) tập trung siêu ly đệm sucrose described5,36 Vectors chuẩn độ dòng tế bào thận mèo tế bào (CrFK) sử dụng đo dòng tế bào cho GFP biểu sion Các hoạt động chép ngược sử dụng để bình thường hóa preparations36 PBMCs nuôi cấy môi trường RPMI với 10% FCS, rhIL-2 thuốc kháng sinh kích hoạt với 10 mg ml-1 PHA-E Đối với nhiễm FIV PBMCs, 50.000 PBMCs mèo bị nhiễm × 106 đơn vị RT hoạt động (10 ml) FIV 34TF1039 tạo tế bào thâm chuyển 293T pCT5orfArep, phiên pCT540 sửa chữa thiếu tháng ORF-A codon dừng lại chồng chéo mở rộng PCR phép PBMC nhân rộng Supernatants thu thập khoảng d sau khảo nghiệm cho hoạt động chép ngược mô tả Immunoblotting Lysate tế bào transfected mô bằm ples sam- đồng Ripa (150 mM NaCl 0,5% deoxychomuộn, 0,1% sodium dodecyl sulfate, 1% NP-40, 150 mM Tris-HCl, pH 8,0) có bổ sung chất ức chế protease ( hoàn-Mini, Boehringer) Phân số lysates đun sôi Laemmli sup- plemented với βmercaptoethanol 10 phút, cách gel điện di, chuyển lên màng PVDF (immobilon-P, Millipore), bị chặn Mpbs có chứa mg ml-1 BSA 1% Tween 20 nhiệt độ phòng (2225 ° C) Blots điều trị kháng thể chống lại chính: GFP (JL8, 1: 5000, Clontech), α-tubulin (chuột đơn dòng kháng thể 1: 8000, Sigma), (ea) HA (ái lực cao chống HA kháng thể, đơn dòng chuột, 1: 1000, Roche, mèo # 11867423001) nhiệt độ phòng Sau rửa, kháng thể thứ cấp áp dụng: phosphatase- kiềm conjugated dê chống chuột IgG (Calbiochem) pha loãng 1: 10.000, alkaline phosphatase liên hợp IgG dê chống chuột (Santa Cruz Công nghệ sinh học, Inc., Santa Cruz, CA) pha loãng : 1000 Màng sau ủ với (eb) ECL thuốc thử (Thermo Scientific) tiếp xúc với phim Bộ sưu tập tinh trùng lưu trữ Epidydymi cách mổ xẻ vòng liên tục mịn thái lát Mpbs supplemented với mg ml-1 BSA 50 mg ml-1 gentamicin để giải phóng tinh trùng Các phương tiện lọc với 70 mM di Strainer (BD Falcon) ly tâm 18.000 rpm phút Tinh trùng pel- phép lơ lửng 500 ml THI lòng đỏ đệm (Refrigeration Medium, Irving khoa học) ống microcentrifuge 1,5 ml nhiệt độ phòng làm lạnh đến ° C Các mẫu giữ ° C sử dụng, bảo quản lạnh nitơ lỏng Tinh trùng đực biến đổi gen thu electroejaculation (ec) Blotting Nam DNA gen trẻ sơ sinh tự biến mèo ously hủy bỏ phân tích cách lai Southern blot PCR Tổng số DNA phân lập từ máu, đuôi mẹo trái tim cách sử dụng máu mô kit DNeasy (Qiagen) Năm microgram DNA tiêu hóa với AflIII, BamH1 NdeI Đoạn ADN tách điện di gel agarose 0,8% chuyển giao hoạt động mao dẫn đến màng Nytran Supercharge (Schleicher & Schuell (ed) Bioscience) DNA liên kết chéo với màng cách sử dụng Crosslinker UV (UVC500; Hoefer) Blots sau lai qua đêm 42 ° C ULTRAhyb (Ambion) có chứa EGFP dò 32P-dán nhãn Sau rửa 60 ° C với 0,5% SDS, × SSC 0,5% SDS, 0,1 × SSC, blots tiếp xúc với phim Kodak BioMax MS X-ray (SigmaAldrich) với việc tăng cường hình - 80 ° C phát triển Ban Hình 5b blot phải Hình 2b bàn rộng so với ban blot trái Hình 2b NdeI BamHI cleave, trung bình, 4.096 bp ngoài, AflIII cắt giảm trung bình 1024 nt bp Định lượng RTPCR bán định lượng PCR Chuyển gen kiểm soát mẫu DNA gen (PBMC, chóp đuôi nội tạng) phân tích thời gian thực PCR định lượng cách sử dụng Roche faststart DNA Thạc sĩ SYBR Xanh Kit I Các mẫu QUÂN tified chống lại tiêu chuẩn plasmid serially pha loãng cho tổng GFP sử dụng Roche LightCycler phần mềm Roche LCDA Biến tính ban đầu 95 ° C 10 phút bước tan chảy sau khuếch đại (40-95 ° C, tỷ lệ chuyển nhiệt độ = 0,05 ° C s-1) GFP khuếch đại cách sử dụng 300 nM cảm giác mồi 5'-AGAAC GGCATCAAGGTGAAC-3 'và antisense mồi 5'-TGCTCAGG TAGTGGTTGTCG-3' Khuếch đại phân tích PCR thực sau; 95 ° C 10 s, 62 ° C 10 s, 72 ° C cho 10 s, × 35 chu kỳ, tỷ lệ chuyển đổi nhiệt độ = ° C s Như điều khiển ing mèo GAPDH tảiđã định lượng 300 nM cảm giác mồi 5'ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 'và antisense mồi 5'TCCACCACCCGGTTGCTGTA-3' Khuếch đại phân tích PCR thực cách sử dụng Roche LightCycler sau: 95 ° C 10 s, 54 ° C 10 s, 72 ° C 18 s, × 35 chu kỳ, tỷ lệ chuyển ture tempera= ° C s.Phân tích bán định lượng để TRIMCyp rhesus thực cách sử dụng Phusion Hot Bắt đầu cao Fidelity DNA polymerase (Finnzymes) thermocycler chuẩn Toàn gen chuyển TRIMCyp rhesus (1,4 kb) khuếch đại cách sử dụng 500 nM cảm giác mồi 5'ATGTACCCATACGATGTTCC-3 'và antisense mồi 5'GCCGCTTATTCGAGTTGCC-3' Chương trình bao gồm bước biến tính ban đầu 98 ° C 30 s Khuếch đại PCR thực sau; 98 ° C s, 60 ° C 20 s, 72 ° C 30 s Một bước mở rộng cuối 72 ° C phút (ee) kết thúc chương trình Phản ứng tiến hành cho hai 5, 10, 20, 30, 40 50 chu kỳ Sản phẩm PCR phân tích gel agarose 1% so với khuếch đại truyền xây dựng plasmid 31 Pineda, M.H Hình sinh sản mèo thú y McDonald (ef) Nội tiết sinh sản (eds Pineda, MH & Dooley, MP) (eg) (eh) 505-522 (Iowa State Press, 2003) (ei) 32 Leyva, H., Madley, T & Stabenfeldt, GH Ảnh hưởng thao tác ánh sáng hoạt động buồng trứng melatonin tiết prolactin mèo nhà J Reprod Fertil Suppl 39 125-133 (1989) (ej) 33 Gỗ, T.C & Wildt, D.E Ảnh hưởng chất lượng phức cumulus noãn bào mèo nước khả tế bào trứng trưởng thành, thụ tinh phát triển thành phôi nang ống nghiệm J Reprod Fertil 110, 355360 (1997) 34 Loewen, N & Poeschla, EM lentivirus vectơ Adv Biochem Eng (ek) (el) Biotechnol (2005) 99, 169-191 35 Saenz, DT, Barraza, R., Loewen, N., Teo, W & Poeschla, E Sản xuất (em) sử dụng Feline Immunodeficiency Virus (FIV) dựa vector lentivirus Gene Transfer: A Cold Spring Harbor Laboratory Manual ( eds Rossi, J & Friedman, T.) 57-74 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2006) (en) 36 Miest, T., Saenz, D., Meehan, A., Llano, M & Poeschla, EM Intensive RNAi với vector lentivirus tế bào động vật có vú Phương pháp 47, 298-303 (2009) (eo) 37 Szymczak, A.L & Vignali, D.A Phát triển chiến lược dựa peptide 2A việc thiết kế vector multicistronic Expert Opin Biol Ther (ep) (eq) 5, 627-638 (2005) 38 Amendola, M., Venneri, MA, Biffi, A., Vigna, E & Naldini, L Phối transgenesis dual-gen vector lentivirus mang quảng bá hai chiều tổng hợp Nat Biotechnol 23, 108-116 (2005) (er) 39 Talbott, R.L et al Trình tự nucleotit tổ chức gen vi rút suy giảm miễn dịch (es) mèo Proc Natl Acad Khoa học viễn tưởng USA 86, 5743-5747 (1989) 40 Poeschla, E., Wong-Staal, F & Looney, D dẫn truyền hiệu tế bào không phân chia vi rút suy giảm miễn dịch mèo vector lentivirus Nat Med 4, 354-357 (1998) (et) (eu) (ev) (ew) [...]... cách giao phối trực tiếp, với tất cả các thế hệ con cháu được chuyển gen Do đó, quy trình chuyển gen đảm bảo khả năng sinh sản, và các dòng mầm được biến đổi Biểu (am) hiện gen chuyển tồn tại ở con F1 của cha mẹ F0 chuyển gen, chỉ ra rằng sự im lặng đã không xảy ra (Hình 4) Giao phối của TgCat1 với ba con mèo cái không chuyển gen sản xuất năm mèo con bổ sung từ ba thai Tương tự như các bố, nó có ít bề... cụ thể là cho mèo herpesvirus (rhinotracheitis), virus bệnh bạch cầu mèo, mèo calicivirus, coronavirus mèo, virus panleukopenia mèo, virus suy giảm miễn dịch ở mèo, mèo nhiễm đầy tranh cãi về viêm phúc mạc, bệnh dại, chlamydia mèo và toxoplasmosis Vắc xin được đưa ra trong cơ sở của chúng tôi là: mèo herpesvirus virus bệnh dại, calcivirus, virus panleukopenia, Chlamydia psittaci (dg) Mèo nhà polyestrous... triển bệnh Khi gen vi-rút đang bị thẩm vấn ở cấp toàn bộ động vật chuyển gen trong một vật chủ tự nhiên, kết quả có thể tạo ra ngạc nhiên và cung cấp một số thông tin Ví dụ, một sự can thiệp chuyển gen gần đây chống lại cúm ở gà ngăn ngừa lây truyền vi rút thứ cấp để liên lạc chuyển gen và không chuyển, nhưng (bf) nó không có tác dụng trên tử vong sau khi kiểm tra khả năng mẫn cảm với virus Bởi vì các yếu... lentivirus ở bị hạn chế bởi cả TRIMCyps khỉ già và trẻ của thế giới Chúng tôi cho rằng mèo chuyển gen với các phân tử bảo vệ vật chủ cũng có thể trao bảo vệ từ virus gây bệnh cho loài mèo hoang dã, tất cả đều phải đối mặt với các mối đe dọa tuyệt chủng nhanh chóng và đó là một trong những đơn vị phân loại hệ sinh thái mang tính biểu tượng có sức lôi cuốn nhất trong động vật ăn thịt Mèo chuyển gen có thể... (cd) 8 Wilson, S.J et al Tiến hóa độc lập của một TRIMCyp kháng virus ở khỉ nâu Proc Natl Acad Khoa học viễn tưởng USA 105, 3557-3562 (2008) (ce) (cf) 9 Munk , C et al Chức năng, cấu trúc , và cách đọc thông qua nối thay thế của gen APOBEC3 trên mèo Genome Biol 9 , R48 (2008 ) (2009 ) Dietrich, I et al Potent hạn chế lentivirus bởi một giống mèo TRIM5, tổng hợp cyclophilin A phản ứng tổng hợp J Virol... xác định sau 48 h như hình vẽ RT, sao chép ngược; SSC, phía phân tán (ad) (ae) Biểu hiện kiểu gen và kiểu hình của gen chuyển (af) TgCat3, trong đó gen chuyển biểu hiện được thúc đẩy bởi các tiêu chuẩn (0,52-kilobase) virus gây nhiễm trùng cơ hội ở bệnh nhân HIV nhanh chóng tiến triển thành AIDS và tử vong ở con người (HCMV) promoter của vector TSinT2AG, đã sáng huỳnh quang và ổn định màu xanh lá cây... Thảo luận Kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng những con mèo biến đổi gen có thể được sử dụng như là vật thí nghiệm cho nghiên cứu y sinh học Cách tiếp cận này cho phép thực hiện chuyển đổi gen bởi biến đổi gen tế bào mầm cho lần đầu tiên trong loài này và trong bất kỳ động vật ăn thịt Đáng chú ý, chúng ta đã đạt được những kết quả thống nhất chuyển gen, trong đó giảm chi phí sàng lọc và thời gian Một... đây, mèo nhà có thể có tiềm năng cho mô hình HIV1 bệnh vì, ngoại trừ cho các thụ thể nhập bào của virus, bộ gen con mèo có thể cung cấp các yếu tố phụ thuộc cần thiết cho HIV- 1 nhân rộng Đây là một sự khác biệt cơ bản so với các con chuột Gen dễ tháo lắp và nhắm mục tiêu là có thể dự đoán bằng cách kết hợp phương pháp tiếp cận của chúng tôi với các công nghệ hiện nay Hơn nữa, trong tiếp cận chuyển gen. .. được nhìn thấy trước đây với phôi chuyển gen tế bào soma (be) chuyển nhân (SCNT) phát triển (1920% so với 3%) 14 Chúng ngăn cản khảm bằng vi tiêm trước khi thụ tinh ống nghiệm và quan sát truyền dòng mầm Sự tồn tại của các biểu hiện gen chuyển ở mèo F1 đang khuyến khích cho việc thiết lập đường dây hữu ích biến đổi gen Việc thiếu các chủng đa dạng bẩm sinh của con mèo, một hạn chế hiện nay, có thể được... vector cùng trong TgCat1, mặc dù ngay cả trong biểu hiện GFP mèo này tăng đều đặn từ tích cực hiếm hoi đến 14,8% của 20 tháng (Fig 3b, c) Thứ ba, tất cả ba con mèo bày tỏ hemagglutinin epitope (HA) mỏm gen rhTRIMCyp trong mèo chuyển gen PBMC số lượng lớn như phát hiện bởi điểm yếu miễn dịch (Fig 3a) TgCat1 luôn hiển thị nhiều rhTRIMCyp hơn hai con mèo sống khác bằng cách phân tích dấu vết định lượng bằng ... cách giới thiệu vào hệ gen loại virus AIDS dễ mắc loài (linh trưởng thú họ mèo giới) Với thách thức cố hữu để biến đổi di truyền khỉ, virus– sus- ceptible AIDS mèo dùng riêng cho nghiên cứu đưa... trùng lentivirus (và AIDS) chuột, chưa sửa đổi biến đổi gen, không bị nhiễm với virus Một số câu hỏi giải Đầu tiên, liệu giới thiệu yếu tố hạn chế hoạt động vào hệ gen loài vi rút AIDS nhạy cảm bảo... tiêu chuẩn (0,52-kilobase) virus gây nhiễm trùng hội bệnh nhân HIV nhanh chóng tiến triển thành AIDS tử vong người (HCMV) promoter vector TSinT2AG, sáng huỳnh quang ổn định màu xanh lớp da động