BÁO cáo MIỄN DỊCH học

BÁO cáo MIỄN DỊCH học BÁO cáo MIỄN DỊCH học BÁO cáo MIỄN DỊCH học BÁO cáo MIỄN DỊCH học BÁO cáo MIỄN DỊCH học BÁO cáo MIỄN DỊCH học BÁO cáo MIỄN DỊCH học BÁO cáo MIỄN DỊCH học BÁO cáo MIỄN DỊCH học BÁO cáo MIỄN DỊCH học BÁO cáo MIỄN DỊCH học BÁO cáo MIỄN DỊCH học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ BÁO CÁO MIỄN DỊCH HỌC PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH HỌC (NGUYÊN LÝ- GIỚI THIỆU MỘT VÀI PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH HỌC) MÃ SỐ HỌC PHẦN: NN112 GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN: PGs Ts TRẦN NGỌC BÍCH Lê Thị Mỹ Phượng B1303709 Phan Ngọc Thảo B1303850 Bùi Thị Yến Nhi B1303823 Nguyễn Thị Ngọc Mai B1303807 Nguyễn Ngọc Thanh Vy B1303759 Lê Duy Thống B1203163 Huỳnh Thị Kim Tuyền B1308946 Cần Thơ, Tháng 04/2015 LỜI MỞ ĐẦU Phương pháp huyết học giúp ta phát kháng nguyên kháng thể sở phát hình thành tổ hợp kháng nguyên - kháng thể trộn thành phần biết (kháng nguyên kháng thể) với dịch nghi có chứa yếu tố (kháng thể kháng nguyên) Phát kháng nguyên bệnh phẩm chứng tỏ vật bị cảm nhiễm mầm bệnh có kháng nguyên tương ứng Tuy nhiên, phản ứng phát kháng nguyên thường có độ nhạy thấp khó có bệnh phẩm thích hợp đặc biệt động vật sống Vì vậy, người ta thường vận dụng phản ứng phát kháng thể Phản ứng có nhược điểm khó giải thích kết phản ứng Kết dương tính thường nói khứ thể động vật tiếp xúc với kháng nguyên tương ứng vừa cảm nhiễm tự nhiên, vừa tiêm phòng Như vậy, loại trừ trường hợp đáp ứng miễn dịch vacxin giết hủy hay loại thải vật kháng thể dương tính lạm sát Tuy nhiên, trường hợp bệnh tiến triển lấy máu kiểm tra kháng thể hai lần mà thấy có gia tăng lượng kháng thể chứng tỏ bệnh mầm bệnh tương ứng tiến triển Về mặt kỹ thuật nguyên tắc phản ứng kháng nguyên - kháng thể đơn giản, tổ hợp kháng nguyên kháng thể hình thành thường khó phát thủ thuật thích hợp Chính vậy, xuất phương pháp phân tích khác Có thể nói, phương pháp thủ thuật phát tổ hợp kháng nguyên - kháng thể Ngoài ra, phản ứng định lượng (thường bán định lượng) xác định hiệu giá kháng thể có ý nghĩa quan trọng đánh giá đáp ứng miễn dịch tập đoàn Do đó, ứng dụng phản ứng miễn dịch học sử dụng phổ biến Mục lục PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH HỌC Quy luật chung phản ứng 1.1 Khái niệm Phản ứng miễn dịch hay gọi phản ứng kháng nguyên- kháng thể Phản ứng kháng nguyên- kháng thể phản ứng miễn dịch học Phản ứng nói lên kết hợp kháng nguyên- kháng thể trường hợp cụ thể tác động tương hỗtương ứng kháng nguyên- kháng thể Khả xác phản ứng cao, phân biệt dạng protein gần chủng loại, hóa chất giống hình dạng, phân tử lượng phát tỉ lệ kháng thể vô nhỏ (ở tỉ lệ pha loãng 10-4) Ở in vivo, nguyên nhân tượng bảo vệ phản vệ Ở in vitro, sở nhiều thử nghiệm dùng để phát kháng nguyên, kháng thể kháng nguyên - kháng thể, sở để phân loại sinh học vi sinh học y học, nông học 1.2 Cơ chế phản ứng miễn dịch học Phản ứng kháng nguyên- kháng thể kết tương ứng thành phần kháng nguyên kháng thể Phản ứng xảy điều kiện định như: nhiệt độ, muối môi trường, thể, chất bổ trợ, chuyển động phân tử Kết kháng nguyên- kháng thể lên kết chặt chẽ với nhờ lực lý- hóa phân tử kháng nguyên kháng thể Song phản ứng xảy trạng thái hoàn nguyên KN + KT KN -KT Phản ứng kết hợp KN-KT xảy theo giai đoạn khác nhau: - Sự liên kết đặc hiệu kháng nguyên-kháng thể - Hình thành phức hợp KN-KT trực tiếp gián tiếp nhìn thấy Sự liên kết kháng nguyên với kháng thể mang tính đặc hiệu cao Tính đặc hiệu tương tự enzyme với chất, nghĩa khớp với khóa với chìa Kháng thể liên kết toàn với kháng nguyên mà phần định kháng nguyên gọi định kháng nguyên hay epitope Kích thước epitope khoảng 7x12x35 Ao gồm 5-7 acid amin Phần tương ứng kháng thể gọi vị trí kết hợp kháng nguyên paratope Mỗi epitope gắn đặt hiệu với paratope kháng thể sinh dòng kháng thể đặc hiệu Một kháng nguyên có nhiều epitope khác tạo thành nhiều dòng kháng thể khác tương ứng với epitope Hình Phức hợp kháng nguyên- kháng thể Hình Kháng nguyên với epitope Hình Kháng thể với epitope khác Về mặt kỹ thuật nguyên tắc phản ứng kháng nguyên - kháng thể đơn giản, tổ hợp kháng nguyên- kháng thể hình thành thường khó phát thủ thuật thích hợp Chính vậy, xuất phương pháp phân tích khác Có thể nói, phương pháp thủ thuật phát tổ hợp kháng nguyên- kháng thể 1.3 Phân loại phản ứng miễn dịch học Người ta chia phản ứng huyết học làm nhóm: - Nhóm thứ nhất: phát kháng thể nhờ kháng nguyên biết - Nhóm thứ hai: phát kháng nguyên nhờ kháng thể biết Trong nhóm người ta lại chia thành loại đơn giản (có 2-3 thành phần tham gia) loại phức tạp (có thành phần tham gia) 1.3.1 Nhóm phản ứng loại đơn giản a Loại thành phần KN + KT KN -KT Phản ứng nhìn thấy được, đánh giá gọi phản ứng đơn giản trực tiếp, ví dụ phản ứng HA (Haemagglutination) Trường hợp thành phần phải gắn chất khối (hồng cầu) cho phép ta quan sát, gọi phản ứng đơn giản gián tiếp, ví dụ phản ứng HA gián tiếp Trong phản ứng thành phần có kháng thể hoàn toàn (hóa trị 2) kháng nguyên hoàn toàn (đa hóa trị) kết phản ứng có khả tạo ‘lưới’- nhìn thấy Còn thành phần hóa trị hoàn toàn phản ứng không tạo lưới- không quan sát trực tiếp b Loại thành phần Chia làm nhóm - Nhóm : Sự kết hợp kháng nguyên- kháng thể kết phản ứng không nhìn thấy được, buộc phải đọc kết gián tác động kháng nguyên với hệ thống thị (động vật thí nghiệm, phôi gia cầm, môi trường thay đổi pH) Điển hình nhóm phản ứng phản ứng trung hòa để xác định đặc tính mầm bệnh (vi khuẩn, virus) sản phẩm chúng (độc tố) - Nhóm 2: Kháng nguyên kháng thể kết hợp với không nhìn thấy được, kết phản ứng đánh giá theo thành phần thứ Thành phần kết hợp trước với kháng nguyên kháng thể làm biến đổi nhìn thấy Điển hình nhóm phản ứng phản ứng loại ức chế ngưng kết hồng cầu HI (Haemagglutination Inhibition) 1.3.2 Nhóm phản ứng loại phức tạp Thường dùng để phát kháng nguyên kháng thể không hoàn toàn Khi tiến hành phản ứng phải dùng nhiều thành phần, nhiều hệ thống phản ứng phát kháng nguyên kháng thể Điển hình phản ứng kết hợp bổ thể, phản ứng miễn dịch huỳnh quang Sự kết hợp kháng nguyên, kháng thể nhờ lực sau: - Lực hút phân tử (Vander Waals) - Lực Coulomb (lực hút tỉnh điện nhóm ion trái dấu) - Lực hút phân tử đồng hóa trị (S-S) - Lực liên kết cầu nồi hydro nhóm OH Trong phản ứng huyết học chất có cấu tạo bề mặt tương đối giống thường cho liên kết giống (trong phản ứng chéo) 1.4 Tác động sinh học Là phản ứng bảo vệ thể Mặt có lợi: loại bỏ mầm bệnh, độc tố, yếu tố lạ xâm nhập vào thể chất thể bị biến đổi Mặt có hại: phản ứng gây nên bệnh lý miễn dịch Đôi phản ứng miễn dịch mà thể từ chối yếu tố có lợi cho thân Các phản ứng miễn dịch học thường dùng chẩn đoán bệnh 2.1 Phản ứng ngưng kết 2.1.1 Khái niệm Là phản ứng liên kết tiểu thể có kích thước nhỏ (tính Micromet) thành cấu trúc lớn quan sát mắt thường Ở đây, kháng nguyên cấu phần nằm bề mặt tiểu thể 2.1.2 Các loại phản ứng ngưng kết a Phản ứng ngưng kết nhanh phiến kính Đây phản ứng có tính chất định tính, cho kết sơ Thường sử dụng kháng nguyên biết nhuộm màu để phát kháng thể tương ứng huyết Thường dùng để chẩn đoán bệnh truyền nhiễm Ví dụ: Bệnh thương hàn gà Typhus avium CRD (Chromic Respiratory Disease) Hình Phản ứng ngưng kết nhanh phiến kính Cách làm: + Dùng phiến kính, bên thí nghiệm, bên đối chứng + Bên thí nghiệm nhỏ giọt huyết cần chẩn đoán, sau nhỏ giọt kháng nguyên biết  trộn đều, sau 1- phút đọc kết + Nếu huyết có kháng thể tương ứng  kháng nguyên + kháng thể tạo thành đám ngưng kết b Phản ứng ngưng kết chậm ống nghiệm Phản ứng vừa có tính chất định tính, vừa định lượng kháng thể, cho kết tương đối xác Cách làm: Dùng loạt ống nghiệm, cho vào ống thứ lượng huyết thanh, pha loãng huyết theo số (1/2; 1/4; 1/8 ) theo số 10 Sau cho vào ống nghiệm lượng kháng nguyên (lượng kháng nguyên tương đương với lượng kháng thể) Trộn để nhiệt độ thích hợp (tủ ấm 37oC) sau 30 phút vài giờ, đọc kết tính hiệu giá ngưng kết Hiệu giá ngưng kết: Là độ pha loãng cao huyết mà khả gây tượng ngưng kết Phản ứng thường sử dụng để chẩn đoán bệnh xảy thai truyền nhiễm Hình Phản ứng ngưng kết nhanh ống nghiệm c Phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động Trong phản ứng ngưng kết, dùng kháng nguyên hoà tan để phát kháng thể tương ứng phải cần đến tế bào mang làm giá đỡ, mang phân tử kháng nguyên hoà tan Thường dùng hồng cầu làm tế bào mang Nguyên lý: - Kháng nguyên hoà tan trở thành kháng nguyên hữu hình cách gắn kháng nguyên hoà tan vào hồng cầu, hồng cầu làm giá đỡ cho kháng nguyên Phản ứng ngưng kết dễ dàng xảy - Có nhiều phương pháp gắn kháng nguyên hoà tan lên bề mặt hồng cầu: Dùng số hoá chất axit tanic, benzidin, muối crom, glutaldehyt để xử lý hồng cầu Các chất có nhóm chức gắn với hồng cầu, nhóm gắn với kháng nguyên - Khi kháng nguyên gặp kháng thể tương ứng, phản ứng ngưng kết xảy ra, ta quan sát rõ Ngoài sử dụng hồng cầu làm giá đỡ, sử dụng hạt chất dẻo như: hạt latex, bentonít Các hạt có tác dụng hấp phụ kháng nguyên hoà tan vào 2.1.3 Ưu, nhược điểm phản ứng ngưng kết Ưu điểm: Phản ứng đơn giản, dễ làm, độ nhạy cao, tốn kém, sử dụng rộng rãi Nhược điểm: Hay cho phản ứng dương tính giả, khó đạt trình độ xác cao 2.2 Phản ứng trung hòa Dựa theo nguyên lý: “ Phản ứng trung hòa phản ứng huyết học gián tiếp dựa tác động trung hòa kháng nguyên huyết miễn dịch đặc hiệu Phản ứng sử dụng chủ yếu để xác định mầm bệnh phân lập (đặc biệt virus) định lượng hàm lượng huyết miễn dịch thể sinh vật cần chẩn đoán” Phản ứng trung hòa : xảy kháng thể bao vây, trung hòa ngoại độc tố vi khuẩn bao vây virus Kháng thể đặc hiệu có khả trung hòa độc tố, độc lực vi sinh vật, làm tính chất vi sinh vật sản phẩm a Phản ứng trung hòa độc tố Độc tố vi khuẩn vô độc formol trở thành giải độc tố, không tính độc tính kháng nguyên cao, nên người ta thường dùng giải độc tố làm vắc xin, tiêm cho thể, chúng kích thích thể sinh kháng thể tốt Khi kháng thể đặc hiệu gặp độc tố tương ứng chúng kết hợp làm cho độc tố không hoạt tính hay gọi độc tố bị trung hòa Huyết chứa kháng thể kháng độc tố gọi huyết kháng độc tố sử dụng vào mục đích chữa bệnh Khi tiêm huyết kháng độc tố vào thể, gặp độc tố, chúng kết hợp trung hòa độc tố đó, phản ứng trung hòa thể Nếu cho kháng độc tố (kháng thể đặc hiệu chống độc tố) kết hợp với độc tố tương đương, phản ứng trung hòa xảy ra, thực in vitro ống nghiệm, thấy phức hợp miễn dịch biểu cụm lơ lửng, người ta gọi phản ứng lên b Phản ứng trung hòa virus Khi virus bị kháng thể đặc hiệu kết hợp không khả gây bệnh nên phản ứng kết hợp virus với kháng thể gọi phản ứng trung hòa virus Nguyên lý phương pháp này: đối tượng nuôi cấy (phôi gà, động vật cảm thụ, môi trường tế bào) virus nhân lên gây bệnh tích cho đối tượng trên, hỗn hợp virus với kháng thể đặc hiệu tương ứng, chúng bị trung hòa, không nhân lên không gây bệnh tích Nếu pha loãng virus (theo số 10) hỗn hợp với lượng tương đương huyết miễn dịch nồng độ, thực phản ứng trung hòa đối tượng trên, người ta gọi phản ứng trung hòa theo phương pháp virus pha loãng, huyết cố định Bằng phản ứng người ta chuẩn độ virus 2.3 Phản ứng kết tủa 10 2.3.1 Nguyên lí chung Kết tủa sử dung kháng nguyên hòa tan phản ứng với kháng thể hòa tan Hiện tượng kết tủa miễn dịch xảy in vitro Người ta nói có miễn dịch in vitro với nghĩa mà mô tả Hiện tượng tủa phức hợp phân tử liên kết KN-KT hình thành mạng lưới ba chiều kháng nguyên nối lại với kháng thể (Marrack 1934) Việc hình thành mạng lưới kết tủa phải cần nhiều điều kiện sau: - Kháng thể phải có hai hóa trị (các mãnh Fab kháng thể hóa trị nên khả này) - Kháng nguyên phải đa hóa trị (các hapten không kết tủa được) - Tính chất kháng nguyên (chủ yếu tính hòa tan) thành phần môi trường (lực ion pH) có vai trò định việc xảy tượng kết tủa - Các kháng thể IgG có chứa 3% glucid, chất gây kết tủa tốt kháng thể IgM chứa tới 10% nên dễ hòa tan gây kết tủa - Các kháng nguyên-kháng thể to dễ tủa 2.3.2 Kết tủa môi trường lỏng Phương pháp Heidelberger Kendall Lần phương pháp cho phép định lượng phản ứng miễn dịch, đến dùng để giải thích tượng tủa xuất không, thay đổi tỉ lệ nồng độ tương đối kháng nguyên kháng thể Trong loạt ống thí nghiệm 2.4 Phản ứng kết hợp bổ thể Phản ứng kết hợp bổ thể thực nhờ hai hệ thống: hệ thống dung khuẩn hệ thống dung huyết với tham gia bổ thể, tương dung khuẩn quan sát mắt thường,do phải dùng hệ thống dung huyết để đánh giá kết Các bước tiến hành thí nghiệm: - Cho hệ thống dung khuẩn (hệ thống 1) ống nghiệm trước, gồm có kháng nguyên biết huyết vật cần chẩn đoán đun cách thủy lên 56o C 30 phút để diệt bổ thể, sau cho tiếp tục vào ống nghiệm lượng bổ thể chuẩn độ vừa đủ lượng cần thiết (thường dùng huyết tươi chuột lang) ủ 37o C vòng 20-30 phút - Sau cho tiếp tục vào ống nghiệm hệ thống hai (hệ thống dung huyết) gồm có hồng cầu huyết miễn dịch chống hồng cầu cừu đun 56 o C 30 phút để diệt bổ thể, ủ tiếp hai hệ thống 37o C 20-30 phút đọc kết - Đọc kết quả: + Nếu hệ thống (hệ thống dung khuẩn), kháng nguyên kháng thể tương ứng, kết hợp kháng nguyên kháng thể chiếm lấy bổ thể, không bổ thể cho hệ 11 thống 2, nên dung huyết, hồng cầu đóng thành cục tròn đáy ống nghiệm Phản ứng dương tính (tức vật có kháng thể tương ứng với kháng nguyên) + Nếu hệ thống kết hợp kháng nguyên kháng thể huyết kháng thể tương ứng, bổ thể không dùng cho hệ thống 1, bổ thể tham gia vào hệ thống làm tan hồng cầu, tạo nên huyễn dịch có màu đỏ Phản ứng âm tính (tức huyết kháng thể tương ứng) 2.5 Phản ứng KN- KT dùng kỹ thuật đánh dấu Trong nhiều trường hợp để phát phức hợp kháng nguyên kháng thể cần phải sử dụng số kỹ thuật nhìn thấy Người ta thường dùng kỹ thuật sau đây: - Phản ứng miễn dịch huỳnh quang: dùng thuốc nhuộm huỳnh quang để nhuộm kháng thể cho kết hợp với kháng nguyên (trực tiếp gián tiếp) phát phức hợp kháng nguyên kháng thể kính hiển vi huỳnh quang - Phản ứng miễn dịch đánh dấu enzyme hay gọi phản ứng ELISA 2.5.1 Phản ứng miễn dịch huỳnh quang (Immuno-fluorescent test) Dùng chất đánh dấu thuốc nhuộm huỳnh quang (khi hấp thụ ánh sáng có bước sóng định phát ánh sáng có bước sóng dài hơn) Nguyên lý: Khi kháng thể kháng kháng thể nhuộm màu thuốc nhuộm huỳnh quang cho kết hợp với kháng nguyên cần chuẩn đoán, phức hợp kháng nguyên-kháng thể soi kính hiển vi huỳnh quang phát sáng Các loại thuốc nhuộm huỳnh quang: - Fluorescent Isothiocyanat: cho màu xanh lục - Rodamin: màu đỏ gạch - Lixamin- Rodamin B (RB200): đỏ→ vàng da cam Thuốc nhuộm huỳnh quang phải đạt tiêu chuẩn: - Không làm tổn thương tới tính sinh miễn dịch kháng thể - Kết hợp với kháng thể cách bền vững - Với lượng có màu sắc rõ rệt - Thuốc dễ sử dụng dễ phân biệt với màu khác Có phương pháp: trực tiếp gián tiếp a Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp Trong phản ứng thường dùng kháng thể đặc hiệu nhuộm màu để phát kháng nguyên chưa biết Nguyên lý: Làm tiêu với bệnh phẩm cần chuẩn đoán, cố định để kháng nguyên gắn chặt lên phiến kính, sau cho giọt kháng thể đặc hiệu nhuộm thuốc 12 nhuộm huỳnh quang lên tiêu bản, để tác động thời gian (khoảng 30 phút), sau rửa nước, để khô quan sát kính hiển vi huỳnh quang (ánh sáng tia tử ngoại) Đọc kết quả: - Phản ứng dương tính: Có tượng phát sáng có kết hợp kháng nguyên kháng thể - Phản ứng âm tính: Không có tượng phát sáng kháng thể không tương ứng với kháng nguyên kết hợp kháng nguyên- kháng thể, rửa nước kháng thể bị trôi b Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp Dùng kháng kháng thể nhuộm chất phát huỳnh quang để phát kháng nguyên cần chẩn đoán Phương pháp gọi kỹ thuật lớp với thành phần tham gia: - Kháng nguyên cần chẩn đoán - Kháng thể đặc hiệu - Kháng kháng thể đặc hiệu nhuộm thuốc nhuộm huỳnh quang Trong kháng thể đặc hiệu có chức năng: - Là kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên cần chẩn đoán - Là kháng nguyên kháng kháng thể đánh dấu (kháng kháng thể kháng thể kháng globulin loài) Phương pháp thực hiện: - Làm tiêu với bệnh phẩm cần chẩn đoán, cố định để kháng nguyên gắn chặt tiêu - Nhỏ giọt kháng thể đặc hiệu lên tiêu mang bệnh phẩm cần chẩn đoán, để tác động 10-15 phút rửa nước - Nhỏ tiếp 1-2 giọt kháng kháng thể nhuộm huỳnh quang, để tác động thời gian, rửa nước, để khô quan sát kính hiển vi huỳnh quang - Đọc kết quả: + Phản ứng dương tính: Có tượng phát sáng tức có phức hợp kháng nguyên+ kháng thể + kháng kháng thể→ Gia súc có mang mầm bệnh + Phản ứng âm tính: Không có tượng phát sáng, tức tượng kết hợp kháng nguyên+ kháng thể+ kháng kháng thể Bởi kháng nguyên kháng thể không tương ứng, kết hợp kháng nguyên - kháng thể, kháng thể bị rửa trôi → Gia súc không mang mầm bệnh Phương pháp gián tiếp hay sử dụng vì: 13 - Chỉ cần lần gắn kháng kháng thể với chất huỳnh quang ta sử dụng để chẩn đoán nhiều kháng nguyên khác nhau, với điều kiện kháng thể đặc hiệu chúng phải chế loài vật - Độ nhạy phản ứng cao hơn, phân tử kháng nguyên bị nhiều kháng kháng thể bám vào → độ phát quang tăng lên, dễ phát 2.5.2 Phản ứng miễn dịch đánh dấu enzyme ( ELISA- Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) ELISA (Enzym Linked Immuno Sorbent Assay) kỹ thuật sinh hóa để phát kháng thể hay kháng nguyên mẫu cần phân tích Hiện ELISA sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực nghiên cứu y học, nông nghiệp đặc biệt quy trình kiểm tra an toàn chất lượng sản phẩm thực phẩm a Phản ứng ELISA trực tiếp tìm kháng nguyên - Cố định kháng thể đặc hiệu vào giếng khay nhựa, rửa nước để loại bỏ kháng thể không gắn Sau cho huyết huyễn dịch bệnh phẩm (nghi có chứa kháng nguyên) chiết xuất thành dung dịch vào Để khoảng giờ, có kháng nguyên tương ứng chúng gắn với kháng thể đặc hiệu Rửa nước để loại bỏ thành phần thừa - Tiếp tục cho kháng kháng thể gắn enzyme vào Kháng kháng thể gắn với kháng nguyên phức hợp kháng nguyên-kháng thể bước Rửa nước để loại bỏ thành phần thừa phản ứng - Tiếp tục cho chất enzyme vào để thời gian 20-30 phút - Đọc kết quả: + Phản ứng dương tính: Có xuất màu tức có kháng nguyên tương ứng với kháng thể đặc hiệu So màu quang phổ kế để định lượng mức độ phản ứng + Phản ứng âm tính: Không có xuất màu tức kháng nguyên tương ứng với kháng thể nên kết hợp kháng nguyên-kháng thể kháng kháng thể bị rửa trôi Phản ứng tạo tập hợp kháng thể-kháng nguyên-kháng kháng thể nên gọi phản ứng ELISA Phản ứng sử dụng rộng rãi, đặc biệt trường hợp lượng kháng nguyên không đủ để phát phương pháp gián tiếp 14 Rửa nước Rửa nước Hình Mô phản ứng ELISA trực tiếp b Phản ứng ELISA gián tiếp tìm kháng thể Nguyên lý: Các giếng khay nhựa phủ sẵn kháng nguyên Kháng nguyên phải gắn chặt vào khay nhựa cho sau rửa phải lớp kháng nguyên phủ giếng Nhỏ huyết (cần kiểm tra) vào giếng, huyết có kháng thể đặc hiệu kháng thể kết hợp với kháng nguyên pha sẵn giếng Sau ủ rửa để loại bỏ kháng thể không gắn với kháng nguyên, kháng thể kết hợp với kháng nguyên phát kháng thể gắn enzyme, nhỏ chất enzyme làm đổi màu thành phần phản ứng Độ đậm màu sắc tỉ lệ thuận với lượng kháng thể gắn enzyme gắn với kháng nguyên có giếng, tức tỉ lệ thuận với lượng kháng thể có huyết Kết phản ứng xác định mắt thường máy đo quang phổ 15 Hình Minh họa phản ứng ELISA gián tiếp tìm kháng thể 2.5.3 Phương pháp Immunoperoxidase Enzyme gắn vào kháng thể kháng kháng thể sử dụng để phát kháng nguyên có mô bào Horseradish peroxidase enzyme sử dụng rộng rãi Có phương pháp: trực tiếp gián tiếp a Phương pháp trực tiếp Tiêu mô bào xử lý kháng thể gắn enzyme Sau rửa, tiêu ủ với chất enzyme thích hợp Kháng thể phát nhờ có xuất màu có kết hợp kháng nguyên-kháng thể b Phương pháp gián tiếp Trong phản ứng kháng thể phát nhờ kháng kháng thể gắn enzyme 2.5.4 Phương pháp Western Blotting Đây phương pháp để xác định kháng nguyên hỗn hợp nhiều loại kháng nguyên Phương pháp gồm bước chính: - Bước 1: Điện di gel- acrylamit để tách peptit phân tử protein riêng biệt nhờ lực điện trường - Bước 2: Dùng màng nitroxenluloza thấm lên gel để tách đa peptit khỏi gel vào nitroxenluloza (giống dùng giấy thấm), tiếp tục điện di - Bước 3: Phát kháng nguyên nhờ phản ứng miễn dịch enzyme Màng ủ huyết có chứa kháng thể đặc hiệu kháng nguyên Sau rửa, kháng kháng thể gắn enzyme bổ sung vào màu xuất (tại 16 dãi có chứa kháng nguyên tương ứng với kháng thể) sau gặp chất enzyme thích hợp Hình Mô phương pháp Western blotting 2.6 Phương pháp điện di miễn dịch Đây phương pháp kiểm tra diện kháng thể đặc hiệu virus có bề mặt tích điện âm mạnh virus tích điện âm mạnh Nếu cho kháng nguyên huyết cần kiểm điện di song song gel agarose huyết có kháng thể đặc hiệu xuất vết kết tủa dãi hai điện di Phương pháp thường để kiểm tra bệnh cảm nhiễm virus Aleutian chồn mink 17 TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Ngọc Bích- Hồ Thị Việt Thu (2012) Giáo trình miễn dịch học đại cương NXB Đại học Cần Thơ Lê Huy Kim (1998) Bài giảng miễn dịch học thú y Khoa nông nghiệp- Đại học Cần Thơ Phạm Văn Ty (2001) Miễn dịch học NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Miễn dịch học Trường Đại học Y khoa Hà Nội-Hà Nội (1997) Đỗ Ngọc Liên (1999) Miễn dịch học sở Đại học Quốc Gia http//:www.benhhoc.com http://www.123doc.vn/document/1620393-giao-trinh-mien-dich-hoc-thu-y-chuong-7pdf.htm http://d.violet.vn/uploads/previews/49/1025650/preview.swf 18 [...]... 1 Trần Ngọc Bích- Hồ Thị Việt Thu (2012) Giáo trình miễn dịch học đại cương NXB Đại học Cần Thơ 2 Lê Huy Kim (1998) Bài giảng miễn dịch học thú y Khoa nông nghiệp- Đại học Cần Thơ 3 Phạm Văn Ty (2001) Miễn dịch học NXB Đại học Quốc gia Hà Nội 4 Miễn dịch học Trường Đại học Y khoa Hà Nội-Hà Nội (1997) 5 Đỗ Ngọc Liên (1999) Miễn dịch học cơ sở Đại học Quốc Gia 6 http//:www.benhhoc.com 7 http://www.123doc.vn/document/1620393-giao-trinh-mien-dich-hoc-thu-y-chuong-7pdf.htm... để nhuộm kháng thể rồi cho kết hợp với kháng nguyên (trực tiếp hoặc gián tiếp) và phát hiện phức hợp kháng nguyên kháng thể bằng kính hiển vi huỳnh quang - Phản ứng miễn dịch đánh dấu enzyme hay gọi là phản ứng ELISA 2.5.1 Phản ứng miễn dịch huỳnh quang (Immuno-fluorescent test) Dùng chất đánh dấu là thuốc nhuộm huỳnh quang (khi hấp thụ 1 ánh sáng có bước sóng nhất định sẽ phát ra 1 ánh sáng có bước... da cam Thuốc nhuộm huỳnh quang phải đạt các tiêu chuẩn: - Không làm tổn thương tới tính sinh miễn dịch của kháng thể - Kết hợp với kháng thể một cách bền vững - Với một lượng ít nhưng có màu sắc rõ rệt - Thuốc dễ sử dụng và dễ phân biệt với các màu khác Có 2 phương pháp: trực tiếp và gián tiếp a Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp Trong phản ứng này thường dùng kháng thể đặc hiệu nhuộm màu để phát... hiện kháng nguyên nhờ phản ứng miễn dịch enzyme Màng được ủ trong huyết thanh có chứa kháng thể đặc hiệu kháng nguyên Sau khi rửa, kháng kháng thể gắn enzyme được bổ sung vào và màu sẽ xuất hiện (tại những 16 dãi có chứa kháng nguyên tương ứng với kháng thể) sau khi được gặp cơ chất enzyme thích hợp Hình 8 Mô phỏng phương pháp Western blotting 2.6 Phương pháp điện di miễn dịch Đây là phương pháp kiểm...2.3.1 Nguyên lí chung Kết tủa chỉ có thể sử dung được khi kháng nguyên hòa tan phản ứng với kháng thể cũng hòa tan Hiện tượng kết tủa miễn dịch xảy ra in vitro Người ta không thể nói có miễn dịch in vitro với cái nghĩa mà nó được mô tả ở đây Hiện tượng tủa những phức hợp phân tử do liên kết KN-KT là do hình thành một mạng lưới ba chiều các kháng nguyên nối lại... vào hệ thống 2 làm tan hồng cầu, tạo nên huyễn dịch có màu đỏ Phản ứng âm tính (tức là trong huyết thanh không có kháng thể tương ứng) 2.5 Phản ứng KN- KT dùng kỹ thuật đánh dấu Trong nhiều trường hợp để phát hiện phức hợp kháng nguyên kháng thể cần phải sử dụng một số kỹ thuật mới nhìn thấy được Người ta thường dùng những kỹ thuật sau đây: - Phản ứng miễn dịch huỳnh quang: dùng thuốc nhuộm huỳnh quang... bám vào → độ phát quang tăng lên, dễ phát hiện 2.5.2 Phản ứng miễn dịch đánh dấu enzyme ( ELISA- Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) ELISA (Enzym Linked Immuno Sorbent Assay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu cần phân tích Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an... vừa đủ lượng cần thiết (thường dùng huyết thanh tươi chuột lang) ủ ở 37o C trong vòng 20-30 phút - Sau đó cho tiếp tục vào ống nghiệm hệ thống hai (hệ thống dung huyết) gồm có hồng cầu và huyết thanh miễn dịch chống hồng cầu cừu đã được đun 56 o C trong 30 phút để diệt bổ thể, ủ tiếp cả hai hệ thống ở 37o C trong 20-30 phút rồi đọc kết quả - Đọc kết quả: + Nếu ở hệ thống 1 (hệ thống dung khuẩn), kháng... ứng ELISA trực tiếp tìm kháng nguyên - Cố định kháng thể đặc hiệu vào các giếng của khay nhựa, rửa nước để loại bỏ kháng thể không gắn Sau đó cho huyết thanh hoặc huyễn dịch bệnh phẩm (nghi có chứa kháng nguyên) đã chiết xuất thành dung dịch vào Để khoảng một giờ, nếu có kháng nguyên tương ứng chúng sẽ gắn với kháng thể đặc hiệu Rửa nước để loại bỏ các thành phần thừa - Tiếp tục cho kháng kháng thể đã... gây kết tủa - Các kháng nguyên-kháng thể càng to thì càng dễ tủa 2.3.2 Kết tủa trong môi trường lỏng Phương pháp Heidelberger và Kendall Lần đầu tiên phương pháp này cho phép định lượng một phản ứng miễn dịch, đến nay vẫn còn được dùng để giải thích hiện tượng tủa tại sao khi xuất hiện khi không, đó là do thay đổi tỉ lệ nồng độ tương đối giữa kháng nguyên và kháng thể Trong một loạt ống thí nghiệm 2.4 ... trình miễn dịch học đại cương NXB Đại học Cần Thơ Lê Huy Kim (1998) Bài giảng miễn dịch học thú y Khoa nông nghiệp- Đại học Cần Thơ Phạm Văn Ty (2001) Miễn dịch học NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Miễn. .. đánh giá đáp ứng miễn dịch tập đoàn Do đó, ứng dụng phản ứng miễn dịch học sử dụng phổ biến Mục lục PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH HỌC Quy luật chung phản ứng 1.1 Khái niệm Phản ứng miễn dịch hay gọi phản... bị biến đổi Mặt có hại: phản ứng gây nên bệnh lý miễn dịch Đôi phản ứng miễn dịch mà thể từ chối yếu tố có lợi cho thân Các phản ứng miễn dịch học thường dùng chẩn đoán bệnh 2.1 Phản ứng ngưng