TẠO PHÁC đồ MIỄN DỊCH CHỦ ĐỘNG và ĐÁNH GIÁ MIỄN DỊCH TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG (mus musculus var albino) BẰNG VACCINE PHÓ THƯƠNG hàn

Trong cộng đồng sinh vật, đấu tranh sinh tồn là một trong các qui luật tự nhiên, cho nên mọi sinh vật đều ít nhiều có khả năng tự bảo vệ chống lại sự xâm nhập của bất kỳ vật lạ nào, nhằm bảo toàn tính toàn vẹn của chúng. Khả năng tự bảo vệ xuất hiện ngay ở cơ thể sống nhỏ bé chưa tiến hóa. Trước khi vắcxin ra đời, đã xuất hiện rất nhiều dịch bệnh làm cho số ca mắc bệnh liên quan đến virus, vi khuẩn, không ngừng tăng lên. Cùng với sự tiến hóa của sinh vật, các biện pháp bảo vệ ngày càng phong phú và hoàn thiện, trong đó đáp ứng miễn dịch là một biện pháp quan trọng và phức tạp nhất. Trong việc nghiên cứu về miễn dịch thì thí nghiệm gây đáp ứng miễn dịch nhân diện kháng nguyên kháng thể ở chuột là thí nghiệm tốt nhất giúp nhận diện và định lượng kháng thể trong huyết thanh chuột, giúp hiểu rõ hơn về miễn dịch và thực tế hơn. Vì vậy, để có được những thông tin chính xác nhất nên nhóm chúng tôi chọn đề tài:” Tạo phác đồ miễn dịch chủ động và đánh giá miễn dịch trên chuột nhắt trắng (mus musculus var. Albino) bằng vaccine phó thương hàn”.

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Đề tài: TẠO PHÁC ĐỒ MIỄN DỊCH CHỦ ĐỘNG VÀ ĐÁNH GIÁ MIỄN DỊCH TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG (Mus Musculus Var Albino) BẰNG VACCINE PHÓ THƯƠNG HÀN SVTH: Đàm Thị Đào 2008120156 Phạm Nguyễn Hải Bằng 2008120102 Trần Hoài Thương 2008120165 Khâu Đăng Quang 2008120178 Nguyễn Thị Lập 2008120139 GVHD: ThS Lại Đình Biên TP Hồ Chí Minh, Tháng 12 Năm 2015 LỜI CẢM ƠN Chúng em xin chân thành cám ơn đến: ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH ThS Lại Đình Biên – Giảng Viên Khoa Công Nghệ Sinh Học & Kỹ Thuật Môi Trường, Trường Đại học Công nghiệp Thực Phẩm Thành Hồ Chí Minh người trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ chúng em suốt thời gian thực đồ án Ban chủ nhiệm Khoa Công Nghệ Sinh Học & Kỹ Thuật Môi Trường, Trường Đại học Công nghiệp Thực Phẩm Thành Hồ Chí Minh tạo điều kiện vật chất: nơi làm việc, thiết bị, hóa chất, … để chúng em hoàn thành tốt đồ án Tp Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2015 Nhóm sinh viên thực LỜI CAM ĐOAN ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH Nhóm cam đoan báo cáo đề tài đồ án chuyên ngành nhóm thực Các số liệu thu thập kết phân tích báo cáo trung thực, không chép từ đề tài nghiên cứu khoa học Nhóm xin chịu hoàn toàn trách nhiệm nội dung Tp HCM, ngày 05 tháng 12 năm 2015 Nhóm sinhviên thực MỤC LỤC ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH ĐẶT VẤN ĐỀ Trong cộng đồng sinh vật, đấu tranh sinh tồn qui luật tự nhiên, sinh vật nhiều có khả tự bảo vệ chống lại xâm nhập vật lạ nào, nhằm bảo toàn tính toàn vẹn chúng Khả tự bảo vệ xuất thể sống nhỏ bé chưa tiến hóa Trước vắc-xin đời, xuất nhiều dịch bệnh làm cho số ca mắc bệnh liên quan đến virus, vi khuẩn, không ngừng tăng lên Cùng với tiến hóa sinh vật, biện pháp bảo vệ ngày phong phú hoàn thiện, đáp ứng miễn dịch biện pháp quan trọng phức tạp Trong việc nghiên cứu miễn dịch thí nghiệm gây đáp ứng miễn dịch nhân diện kháng nguyên - kháng thể chuột thí nghiệm tốt giúp nhận diện định lượng kháng thể huyết chuột, giúp hiểu rõ miễn dịch thực tế Vì vậy, để có thông tin xác nên nhóm chọn đề tài:” Tạo phác đồ miễn dịch chủ động đánh giá miễn dịch chuột nhắt trắng (mus musculus var Albino) vaccine phó thương hàn” 1.1 Mục tiêu nghiên cứu − − Xây dựng phác đồ gây miễn dịch Xác định chế đáp ứng miễn dịch vaccin Phó Thương Hàn chuột nhắt trắng khả đáp ứng miễn dịch chuột nhắt với vaccin Phó Thương Hàn 1.2 Ý nghĩa khoa học − Kết nghiên cứu đề tài sở khoa học phục vụ cho nghiên cứu tiếp theo, đồng thời đóng góp tư liệu tham khảo cho nhà nghiên cứu miễn dịch động vật ngành thú y miễn dịch người 1.3 Ý nghĩa thực tiễn - Sinh viên củng cố lại kiến thức miễn dịch, làm quen với phương pháp Outerlony Macini, đặc biệt nắm kiến thức thực tế miễn dịch ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu miễn dịch học 1.1 - Khái niệm miễn dịch học Trong cộng đồng sinh vật, đấu tranh sinh tồn quy luật tự nhiên, sinh vật có nhiều khả tự bảo vệ để chống lại xâm nhập bất - kỳ vật lạ Theo quan niệm ban đầu “miễn dịch thể không mắc bệnh truyền nhiễm thể khác lại mắc bệnh truyền nhiễm điều - kiện” Hiện miễn dịch định nghĩa: “Miễn dịch khả phòng vệ toàn thể yếu tố mang thông tin di truyền ngoại lai (thông tin lạ)”  Vậy Miễn dịch học (immunology) ngành khoa học nghiên cứu khả - phòng vệ thể sinh vật Những nội dung ngành học bao gồm: Nghiên cứu quy luật, chế bảo vệ thể trình sống Nghiên cứu trình hoạt động hệ miễn dịch thể, tương tác điều - hoà miễn dịch Nghiên cứu thay đổi hoạt động miễn dịch trường hợp miễn dịch bệnh - lý Ứng dụng quy luật hoạt động miễn dịch vào việc chẩn đoán, phòng trị bệnh Lý luận khoa học miễn dịch có liên quan chặt chẽ tới nhiều môn học như: sinh lý học, sinh hoá học, tế bào học, bệnh lý học, sinh học phân tử, vi sinh vật học, 1.1.1 - Đáp ứng miễn dịch tự nhiên ( Natural immunity) Hệ miễn dịch tự nhiên (còn gọi miễn dịch bẩm sinh) bao gồm chế đề kháng tồn thể chưa có nhiễm trùng sẵn sàng đáp ứng nhanh vi sinh vật xâm nhập Miễn dịch tự mang tính di truyền thể loài Nói cách khác khả tự bảo vệ cá thể có từ lúc sinh, không đòi hỏi phải có tiếp xúc trước thể với kháng nguyên vật lạ (tức không cần phải có giai đoạn mẫn cảm) - Cơ chế phát huy tác dụng dù kháng nguyên xâm nhập lần đầu hay lần sau, có vai trò quan trọng lần lúc đáp ứng miễn dịch thu chưa phát huy tác dụng Các chế chủ yếu phản ứng chống lại vi sinh vật ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH không phản ứng với vật lạ vi sinh vật; đồng thời chúng phản ứng theo chế giống hệt vi sinh vật xâm nhập tái tái lại  Các thành phần miễn dịch tự nhiên bao gồm: (1) Các hàng rào vật lý hoá học da, niêm mạc, chất kháng khuẩn tiết bề mặt này; (2) Các tế bào thực bào (tế bào trung tính, đại thực bào) tế bào NK (tế bào giết tự nhiên); (3) Các protein máu, bao gồm thành phần hệ thống bổ thể chất trung gian khác phản ứng viêm; (4) Các protein gọi cytokin có vai trò điều hoà phối hợp hoạt động tế bào hệ miễn dịch tự nhiên  Cơ chế hoạt động củaa hệ miễn dịch tự nhiên đặc hiệu cho cấu trúc chung nhóm vi sinh vật không đặc hiệu cho khác biệt tinh tế nhóm Hệ miễn dịch tự nhiên tạo phản ứng chống lại xâm nhập vi sinh vật 1.1.2 Đáp ứng miễn dịch thu được: Ngược với hệ miễn dịch tự nhiên, có đáp ứng miễn dịch khác kích thích tiếp xúc với vi sinh vật tạo cường độ tăng dần tiếp xúc lặp lặp lại Bởi dạng đáp ứng xuất sau vi sinh vật xâm - nhập thể nên gọi miễn dịch thu Tính chất đặc biệt đáp ứng miễn dịch thu tính đặc hiệu phân tử khả “nhớ” phân tử xâm nhập trở lại thể để tạo đáp ứng mạnh nhiều so với lần xâm nhập Hệ miễn dịch thu có khả nhận diện phản ứng lại với nhiều vật lạ có chất nhiễm trùng không nhiễm trùng Ngoài ra, có khả tuyệt vời việc phân biệt khác nhỏ vật lạ mà gọi miễn dịch đặc hiệu Các thành phần miễn dịch thu tế bào lymphô sản phẩm chúng Những chất lạ tạo đáp ứng miễn dịch đặc hiệu chịu tác động hệ miễn dịch gọi kháng nguyên Theo thói quen, thuật ngữ “đáp ứng miễn dịch” “hệ ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH thống miễn dịch” thường dùng cho đáp ứng miễn dịch thu được, trừ có nhấn mạnh riêng khác đến miễn dịch tự nhiên Có hai kiểu đáp ứng miễn dịch thu được, đáp ứng thể dịch đáp ứng qua trung gian tế bào Cả hai kiểu có tham gia nhiều thành phần hệ thống miễn dịch với mục đích loại trừ nhiều loại vi sinh vật khác khỏi thể • Miễn dịch dịch thể Miễn dịch dịch thể thực qua trung gian phân tử diện máu dịch niêm mạc có tên kháng thể, sản xuất tế bào lymphô B (còn gọi tế bào B) Kháng thể có khả nhận diện kháng nguyên vi sinh vật, trung hoà tính gây bệnh tác động lên vi sinh vật để loại trừ qua nhiều chế hiệu khác Miễn dịch dịch thể chế đề kháng chủ yếu chống lại vi sinh vật ngoại bào độc tố chúng theo chế kháng thể liên kết với vi sinh vật độc tố để xúc tiến việc loại trừ Bản thân kháng thể phân tử chuyên môn hoá, tuýp kháng thể khác tạo nhiều chế loại bỏ kháng nguyên khác Một số tuýp kháng thể có khả xúc tiến hoạt động thực bào, số khác lại kích thích tế bào bạch cầu sản xuất chất trung gian phản ứng viêm • Miễn dịch qua trung gian tế bào Miễn dịch qua trung gian tế bào (còn gọi miễn dịch tế bào) kiểu đáp ứng thực qua trung gian tế bào lymphô T (còn gọi tế bào T) Các vi sinh vật nội bào virus số vi khuẩn có khả sống nhân lên đại thực bào số tế bào chủ khác, chúng không chịu tác động trực tiếp kháng thể lưu động máu Sự đề kháng chống lại vi sinh vật kiểu chức miễn dịch tế bào ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH Hình Miễn dịch qua trung gian tế bào • Các thành phần tế bào hệ thống miễn dịch thu Các tế bào hệ miễn dịch tế bào lymphô, tế bào trình diện kháng nguyên, tế bào hiệu Tế bào lymphô tế bào có khả nhận diện cách đặc hiệu kháng nguyên lạ tạo phản ứng chống lại chúng Do vậy, lymphô bào tế bào trung gian miễn dịch dịch thể miễn dịch tế bào o Tế bào lymphô B tế bào sản xuất kháng thể Chúng nhận diện kháng nguyên ngoại bào (kể kháng nguyên bề mặt tế bào) biệt hoá thành tế o bào tiết kháng thể, chúng tác dụng tế bào trung gian miễn dịch dịch thể Tế bào lymphô T nhận diện kháng nguyên vi sinh vật nội bào có chức tiêu diệt vi sinh vật tế bào bị nhiễm trùng Thụ thể kháng nguyên chúng phân tử màng khác với kháng thể có cấu trúc liên quan Tế bào T có tính đặc hiệu chặt chẽ kháng nguyên Chúng nhận diện phân tử peptid gắn với protein thân mã hoá gen phức hệ hòa hợp mô chủ yếu (MHC) thể bề mặt tế bào khác Như vậy, tế bào T nhận diện phản ứng với kháng nguyên gắn bề mặt ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH tế bào kháng nguyên hoà tan Tế bào T có nhiều nhóm mang chức khác Được biết nhiều tế bào T giúp đỡ, T gây độc  Khi đáp ứng với kháng nguyên, tế bào T giúp đỡ tiết protein gọi cytokin có chức kích thích tăng sinh biệt hoá tế bào T số tế bào có tế bào B, đại thực bào bạch cầu khác Tế bào T gây độc giết tế bào sản xuất kháng nguyên lạ tế bào bị nhiễm virus hay vi khuẩn nội bào khác Một số tế bào T gọi T điều hoà có chức ức chế đáp ứng miễn dịch Bản chất vai trò sinh lý tế bào T điều hoà chưa biết đầy đủ Có nhóm tế bào lymphô thứ ba tế bào giết (NK), tế bào tham gia vào hệ thống miễn dịch bẩm sinh chống lại nhiễm trùng virus vi sinh vật nội bào khác Sự khởi động phát triển đáp ứng miễn dịch thu đòi hỏi kháng nguyên phải bắt giữ trình diện cho tế bào lymphô Tế bào chịu trách nhiệm làm việc gọi tế bào trình diện kháng nguyên (APC) Tế bào trình diện kháng nguyên chuyên môn hoá cao tế bào hình (dendritic), chúng bắt giữ vi sinh vật từ bên xâm nhập vào, vận chuyển kháng nguyên đến quan lymphô trình diện kháng nguyên cho tế bào T để khởi động đáp ứng miễn dịch  Các giai đoạn đáp ứng miễn dịch thu Quá trình đáp ứng miễn dịch thu chia thành nhiều giai đoạn khác nhau: - Nhận diện kháng nguyên - Hoạt hoá tế bào lymphô - Giai đoạn hiệu (loại trừ kháng nguyên) Sau trở lại định nội môi trì tính nhớ miễn dịch (Hình 1.6) ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH Hình Các giai đoạn đáp ứng miễn dịch thu 1.2 Hệ Thống Các Cơ Quan Và Tế Bào Tham Gia Vào Đáp Ứng Miễn Dịch Hệ thống miễn dịch gồm nhiều quan nhiều loại tế bào nằm rãi rác khắp thể, tác động qua lại để dẫn đến đáp ứng miễn dịch cuối Ngay trước khái niệm miễn dịch hình thành, nhiều thầy thuốc cổ đại mô tả quan mà sau người ta chứng minh thuộc hệ miễn dịch Các quan hệ miễn dịch gồm tuyến ức, lách, tủy xương, mạch lympho, hạch lympho mô lympho thứ cấp (như hạch amiđan, V.A.) da Các quan chính, tuyến ức lách, nghiên cứu đơn mặt mô học qua tử thiết Ngoài ra, dùng phẫu thuật lấy hạch lympho số mô lympho thứ cấp để nghiên cứu bệnh nhân sống (sinh thiết) Nhiều tế bào thuộc hệ miễn dịch không liên kết với quan đặc biệt nào, mà tập trung lưu chuyển nhiều mô khắp thể Tất tế bào tham gia vào đáp ứng miễn dịch (ĐƯMĐ) có nguồn gốc chung tế bào gốc tủy xương; chúng biệt hóa để tạo thành dòng tế bào khác 10 ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH Thạch bổ xung vaccine Phó thương hàn Máu gây miễn dịch vaccine phó thương hàn Hình 11: Cách bố trí lỗ thạch lame 2.2.7 Làm tiêu Là bước bao gồm thao tác công việc: Ngâm tiêu thuốc nhuộm Commasive brilliant blue 10 phút, rửa thuốc nhuộm cách ngâm lame tiêu vào dung dịch tẩy màu Lưu ý trình ngâm phiến thạch cần thay dung dịch tẩy màu thường xuyên Tránh làm biến dạng bong agarose 2.2.8 Kết - Phương pháp Outerlony: Kết sau đạt ta thấy vạch kết tủa kháng - nguyên kháng thể Phương pháp Mancini: Kết đạt ta thấy thạch tao nên vòng kết tủa có đường kính tỉ lệ thuận với nồng độ kháng nguyên 2.3 Các thí nghiệm 2.3.1 Thí nghiệm 1: Gây phác đồ miễn dịch chủ động chuột trắng nhắt vacxin phó thương hàn a) Mục đích Lấy máu chuột nhắt trắng sau gây miễn dịch vaccine Phó thương hàn b) Phương thức thực Thực tiêm vaccine Phó thương hàn chuột nhắt trắng c) Tạo phác đồ miễn dịch: 33 ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH Tiêm chuột vacxin phó thương hàn ngày vào lúc sáng, đặn ngày liên tiếp - Tiến hành tiêm chuột vào lúc 09h00 ngày - Gồm giai đoạn: Tiền phát : nhắc lại : Cao độ = 1:5:1 - Liều tiêm - Heo: 2ml  15000g Chuột: 0,005 ml  40g Dung dịch Stock (1ml)  100UI => 0,1 ml  10UI => 0,15 ml  15UI + Miễn dịch tiền phát: Ngày 1: 0,15ml ~ 15UI vaccine + Miễn dịch nhắc lại: Ngày 2: 0,15ml ~ 15UI vaccine Ngày 3: 0,15ml ~ 15UI vaccine Ngày 4: 0,15ml ~ 15UI vaccine Ngày 5: 0,15ml ~ 15UI vaccine Ngày 6: 0,15ml ~ 15UI vaccine + Miễn dịch cao độ: Ngày 7: 0,2ml ~ 20UI vaccine Ngày 8: Nghỉ Ngày 9: Lấy máu 2.3.2 Thí nghiệm 2: Dùng phương pháp Outerlony kiểm tra có mặt kháng thể máu chuột gây miễn dịch a) Mục đích 34 ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH Đánh giá nồng độ kháng thể có máu chuột nhắt trắng đáp ứng miễn dịch với vaccine phó thương hàn nói kỹ thuật khuếch tán vòng b) Phương thức thực Hình 12 Thí nghiệm phản ứng Outerlony Agar 1%+DD đệm PBS Đun cách thủy Đợi nguôi 50-600C Đổ lamen Đục lỗ thạch Thêm máu hàng Thêm vaccine hàng bên Ủ 24 Nhuộm Commassive brilliant blue Ngâm với dd tẩy màu 35 ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH Hình 13: Sơ đồ phương thức thực phương pháp Outerlony c) Đánh giá kết quả: Sau 24h phản ứng tủ ấm ta nhuộm tiêu để quan sát kết tủa bắt màu xác định có kháng thể thành phần máu chuột không 2.3.3 Thí nghiệm 3: Dùng phương pháp Mancini kiểm tra có mặt kháng thể máu chuột gây miễn dịch a) Mục đích: Đánh giá nồng độ kháng thể có huyết chuột nhắt trắng đáp ứng miễn dịch với vaccine phó thương hàn nói kỹ thuật khuếch tán vòng b) Phương thức thực Hình 14 Thí nghiêm phản ứng Mancini 36 ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH Agarose 1% Đung cách thủy Đợi nguôi 50-600C Bổ xung vaccine hòa tan Đổ lamen Đục lỗ thạch Thêm máu hàng Ủ 24 Nhuộm Commassive brilliant blue Ngâm với dd tẩy màu Rửa với cồn Hình 15 Sơ đồ phương thức thực phản ứng Mancini c) Đánh giá kết quả: Sau 24h phản ứng tủ ấm ta nhuộm tiêu để quan sát vòng kết tủa bắt màu xác định có kháng thể thành phần máu chuột không CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT Dùng phương pháp Outerlony kiểm tra có mặt kháng thể máu chuột gây miễn dịch 37 ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH Hình16: Phản ứng Outerlony trước nhuộm 38 ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH Hình17: Phản ứng Outerlony sau nhuộm Dùng phương pháp Mancini kiểm tra có mặt kháng thể máu chuột gây miễn dịch Hình18: Phản ứng Mancini trước nhuộm 39 ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH Hình19: Phản ứng Mancini sau nhuộm Nhận xét: 3.1 Thí nghiệm Tạo miễn dịch cho chuột nhắt trắng với phác đồ vaccine phó thương hàn, kiểm tra phương pháp Mancini 3.2 Thí nghiệm Phương pháp Outerlony: • Sau nhuộm với thuốc nhuộm Commassive brilliant blue 15-30 phút rửa dung dịch tẩy màu ta quan sát vạch chưa bắt màu thuốc nhuộm o Thao tác thực chưa chuẩn xác o Yếu tố môi trường tác động o Thiết bị-dụng cụ-hóa chất không 3.3 Thí nghiệm 40 ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH • Phương pháp mancini Kết đạt thấy thạch tạo nên vòng kết tủa có đường kính tỉ lệ thuận với nồng độ kháng nguyên CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH TIẾN ĐỘ LÀM VIỆC Bảng Tiến độ làm việc Thời gian Quá trình 14/10/2015 Pha môi trường + hóa chất (Lần 1) + vaccine + hấp môi trường 19/10/2015 Tiến hành gây phác đồ Tiêm vaccine: Miễn dịch 20 22/10/2015 Miễn dịch cao độ 22/10/2015 Pha môi trường thử nghiệm: Phương pháp Outerlony + Mancini 23  24/10/2015 Miễn dịch nhắc lại 24/10/2015 Đánh giá Miễn dịch mô trường thử nghiệm 26/10/2015 Lấy máu, đánh giá miễn dịch Quan sát kết KHÔNG CÓ KẾT QUẢ 27  28/10/2015 Mua lại chuột nuôi ổn định tiến hành làm lại thí nghiệm 12/11/2015 Gây lại phác đồ Miễn dịch tiền phát 0.15 ml/liều/con (15 UI) 13  17/11/2015 17/11/2015 18/11/2015 20/11/2015 21/11/2015 24/11/2015 25/11/2015 27/11/2015 Tiêm chuột liều nhắc lại 0.15 ml/liều/con (15 UI) Pha hóa chất môi trường lần Tiêm liều cao độ 0.2 ml/liều/con (20 UI) + Hấp khử tùng hóa chất môi tường Lấy máu làm mẫu Nhuộm mẫu kiểm tra + Phương pháp Ouchterlony không tạo ngưng kết vạch vaccine máu + Phương pháp Mancini có vòng ngưng kết vaccine máu Lấy máu, làm lại mẫu Nhuộm mẫu kiểm tra kết quả: + Phương pháp Ouchterlony không tạo ngưng kết vạch vaccine máu Lấy máu, làm lại mẫu 42 ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH 28/11/2015 1/12/2015 2─3/12/2015 Nhuộm mẫu kiểm tra kết + Phương pháp Ouchterlony không tạo ngưng kết vạch vaccine máu Pha môi trường, lấy máu làm lại mẫu Nhuộm mẫu kiểm tra kết DANH MỤC HÌNH Hình Miễn dịch qua trung gian tế bào Hình Các giai đoạn đáp ứng miễn dịch thu Hình Các tế bào tham gia vào ĐƯMĐ Hình Cơ chế opsonin hóa ĐTB với chất opsonin là: a) thụ thể không đặc hiệu, b) KT, c) C3b, d) phối hợp KT C3b Hình Cấu trúc phân tử kháng thể Hình Hoạt hóa tế bào miễn dịch Hình 7: Đường chuẩn dùng định lượng protein đặc hiệu khuyếch tán đơn, kỹ thuật Mancini Hình Vaccine phó thương hàn Hình Sơ đồ thí nghiệm tổng quát Hình 10 Cách bố trí lỗ thạch lame 43 ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH Hình 11: Cách bố trí lỗ thạch lame Hình 12 Thí nghiệm phản ứng Outerlony Hình 13 Sơ đồ phương thức thực phương pháp Outerlony Hình 14 Thí nghiêm phản ứng Mancini Hình 15 Sơ đồ phương thức thực phản ứng Mancini Hình16: Phản ứng Outerlony trước nhuộm Hình 17 Phản ứng Outerlony sau nhuộm Hình18: Phản ứng Mancini trước nhuộm Hình19: Phản ứng Mancini sau nhuộm 44 ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH DANH MỤC BẢNG Bảng Đặc điểm chuột nhắt trắng 24 Bảng Tiến độ làm việc 44 45 ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH BẢNG DỰ TRÙ HÓA CHẤT-THIẾT BỊ-DỤNG CỤ A HÓA CHẤT: STT QUY CÁCH TÊN HÓA CHẤT SL/ĐVT GHI CHÚ (GHI RÕ NỒNG Agarose Dung dịch nhuộm màu Commassive brilliant blue Dung dịch tẩy màu (cồn 70o) Vaccine Phó thương hàn ĐỘ) Tinh khiết 25 g Rắn 1g Lỏng 1000 ml Lỏng 20 ml Nước muối sinh lý Lỏng 250 ml Dung dịch đệm PBS(-) Lỏng 400 ml STT TÊN DỤNG CỤ QUY CÁCH SL/ĐVT Lame x 8,5 cm Hộp Ống tiêm ml Hộp Dụng cụ đục lỗ thạch Bộ Cốc 1000 ml/cái; 500 Bình tam giác ml/cái 250ml/Cái B DỤNG CỤ: GHI CHÚ C THIẾT BỊ: STT TÊN THIẾT BỊ SL/Đ QUY CÁCH GHI CHÚ VT Tủ ấm Cái Buồng ẩm Cái Tủ lạnh Cái Bếp điện Cái 46 ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Phan Kim Ngọc (chủ biên), Giáo Trình Thực Tập Cơ Sở Công Nghệ Sinh Học Động Vật, NXB Đại học quốc gia Tp Hồ Chí Minh, 2002 [2] Pascale CHRÉTIEN, Les methods de double immunodiffusion en milieu gélifié, tạp chí GEAL l’ info, pp 6-7, 2005 [3] Lê Thanh Hòa, 2004, Bài giảng miễn dịch học ứng dụng Viện Công nghệ Sinh học Hà Nội [4] Lê Văn Hiệp (2006), Vacxin học vấn đề bản, NXB Y Học, Hà Nội [5] Đỗ Ngọc Liên (2004), Thực hành hoá sinh miễn dịch, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội [6] Phạm Văn Ty (2004), Miễn dịch học phân tử, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội [7] M Gautama, S.S Diwanay, S Gairolac, Y.S Shindec,S.S Jadhavc, B.K.Patwardhana, Immune response modulation to DPT vaccine by aqueous extract of Withania somnifera in experimental system, International Immunopharmacology (2004) 841 – 849 [8] http://miendich.com.vn/ [9] http://vi.wikipedia.org/wiki/ [10] http://medicare.health.vn/ [11] http://www.pasteur-hcm.org.vn/ 47 [...]... nghiệm 2.3.1 Thí nghiệm 1: Gây phác đồ miễn dịch chủ động chuột trắng nhắt bằng vacxin phó thương hàn a) Mục đích Lấy máu của chuột nhắt trắng sau khi đã gây miễn dịch bằng vaccine Phó thương hàn b) Phương thức thực hiện Thực hiện tiêm vaccine Phó thương hàn trên chuột nhắt trắng c) Tạo phác đồ miễn dịch: 33 ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH Tiêm chuột bằng vacxin phó thương hàn hằng ngày vào lúc 9 giờ sáng, đều đặn... lỗ thạch cho phương pháp Outerlony Vaccine phó thương hàn Máu đã được gây miễn dịch bằng vaccine phó thương hàn Hình10: Cách bố trí các lỗ thạch trên lame b Đục lỗ thạch cho phương pháp Mancini 32 ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH Thạch đã được bổ xung vaccine Phó thương hàn Máu đã được gây miễn dịch bằng vaccine phó thương hàn Hình 11: Cách bố trí các lỗ thạch trên lame 2.2.7 Làm tiêu bản Là bước bao gồm các thao... 0,15ml ~ 15UI vaccine Ngày 6: 0,15ml ~ 15UI vaccine + Miễn dịch cao độ: Ngày 7: 0,2ml ~ 20UI vaccine Ngày 8: Nghỉ Ngày 9: Lấy máu 2.3.2 Thí nghiệm 2: Dùng phương pháp Outerlony kiểm tra sự có mặt của kháng thể trong máu chuột đã gây miễn dịch a) Mục đích 34 ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH Đánh giá nồng độ kháng thể có trong máu chuột nhắt trắng đáp ứng miễn dịch với vaccine phó thương hàn nói trên bằng kỹ thuật... thương hàn Hình 8: Vaccine phó thương hàn - Là vaccine giảm độc lực Loại thuốc: Vaccine tạo miễn dịch (chủ động) 28 ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH Vaccine được sản xuất từ vi khuẩn Salmonella cholerae suis chủng S1,S2,S3 và S4 lên men trên Fermentor theo công nghệ lên men hiện đại, là vacxin vô hoạt được bổ sung chất bổ trợ keo phèn Hydroxide aluminium nhằm tăng cường và kéo dài khả năng miễn dịch Vaccine là chế... nguyên và kháng thể gặp nhau từ những giếng trên thạch 2.2.5 Định lượng kháng thể bằng phương pháp Macini Là phương pháp đánh giá nồng độ kháng thể kháng lại độc tố của vi khuẩn Salmonella có trong huyết thanh chuột nhắt trắng đáp ứng miễn dịch với vaccine Phó thương hàn nói trên bằng kỹ thuật khuếch tán vòng do Mancini đề xuất 2.2.6 Đục lỗ thạch a Đục lỗ thạch cho phương pháp Outerlony Vaccine phó thương. .. tam giác 2 Phương pháp 30 ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH 2.1 Quy trình tiến hành Chuột nhắt trắng Gây phác đồ miễn dịch Lấy máu Tạo tiêu bản Chưng thạch Nhận diện kháng thể bằng phương pháp Outerlony Nhận diện kháng thể bằng phương pháp Macini Đục lỗ thạch Đục lỗ thạch Làm tiêu bản Làm tiêu bản Kết quả Hình 9 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 2.2 Giải thích quy trình 2.2.1 Gây miễn dịch chuột Là thao tác làm cho chuột tạo. .. để tạo miễn dịch đặc hiệu chủ động, nhằm tăng sức đề kháng của cơ thể đối với một tác nhân gây bệnh cụ thể Vaccine Phó thương hàn được sản xuất từ vi khuẩn Salmonella cholerae suis chủng S1,S2,S3 và S4 theo công nghệ lên men hiện đại, là vaccine vô hoạt được bổ sung chất bổ trợ keo phèn Hydroxide aluminium nhằm tăng cường và kéo dài khả năng miễn dịch Một số đặc tính của vaccine - Tác dụng của vaccine. .. Cơ chế hoạt động: Hệ miễn dịch nhận diện vaccine là vật lạ nên hủy diệt chúng và "ghi nhớ" chúng Về sau, khi tác nhân gây bệnh thực thụ xâm nhập cơ thể, hệ miễn dịch đã ở tư thế sẵn sàng để tấn công tác nhân gây bệnh nhanh chóng hơn và hữu hiệu hơn (bằng cách huy động nhiều thành phần của hệ miễn dịch, đặc biệt là đánh thức các tế bào lympho nhớ) Đây chính là các ưu điểm của đáp ứng miễn dịch đặc hiệu... Khoảng 6pg Khoảng 105 Chuột nhắt trắng (Mus Musculus Var Albino) được nuôi trong điều kiện tiêu chuẩn ở khu chăn nuôi của Viện Công nghệ sinh học 3 Vaccine Vaccine là chế phẩm có tính kháng nguyên dùng để tạo miễn dịch đặc hiệu chủ động, nhằm tăng sức đề kháng của cơ thể đối với một (số) tác nhân gây bệnh cụ thể Các nghiên cứu mới còn mở ra hướng dùng vaccine để điều trị một số bệnh (vaccine liệu pháp,... thể trong thành phần máu chuột không 2.3.3 Thí nghiệm 3: Dùng phương pháp Mancini kiểm tra sự có mặt của kháng thể trong máu chuột đã gây miễn dịch a) Mục đích: Đánh giá nồng độ kháng thể có trong huyết thanh chuột nhắt trắng đáp ứng miễn dịch với vaccine phó thương hàn nói trên bằng kỹ thuật khuếch tán vòng b) Phương thức thực hiện Hình 14 Thí nghiêm phản ứng Mancini 36 ... chọn đề tài:” Tạo phác đồ miễn dịch chủ động đánh giá miễn dịch chuột nhắt trắng (mus musculus var Albino) vaccine phó thương hàn 1.1 Mục tiêu nghiên cứu − − Xây dựng phác đồ gây miễn dịch Xác định... Gây phác đồ miễn dịch chủ động chuột trắng nhắt vacxin phó thương hàn a) Mục đích Lấy máu chuột nhắt trắng sau gây miễn dịch vaccine Phó thương hàn b) Phương thức thực Thực tiêm vaccine Phó thương. .. vaccine Phó thương hàn chuột nhắt trắng c) Tạo phác đồ miễn dịch: 33 ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH Tiêm chuột vacxin phó thương hàn ngày vào lúc sáng, đặn ngày liên tiếp - Tiến hành tiêm chuột vào lúc 09h00