Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Phân lập nấm men chịu nhiệt

Do đó,nắm men chịu nhiệt đã và đang được quan tâm nghiên cứu vì chúng có khả năng tăng trưởng và lên men ở nhiệt độ cao, ứng dụng cho quá trình lên men ethanol hoặc trong sản xuất đồ uốn

ĐẠI HOC QUOC GIA THÀNH PHO HO CHI MINH

TRUONG DAI HOC BACH KHOA

TRUONG NGOC HIEU

PHAN LAP NAM MEN CHIU NHIET

Chuyén nganh: THUC PHAM VA DO UONGMa nganh: 605402

TP HO CHI MINH, thang 07 nam 2014

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS Trần Thị Ngọc Yên

PGS TS Lê Văn Việt MẫnCán bộ cham nhận xét 1: TS Phan Thế Đồng

5.TS Lại Quốc ĐạtXác nhận của Chủ tịch hội đồng đánh giá luận văn và Trưởng khoa quản lý chuyên

ngành sau khi luận văn đã được sử chữa (nêu có).

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRƯỞNG KHOA

ĐẠI HOC QUOC GIA TP HO CHÍ MINH CONG HOA XÃ HỘI CHU NGHĨA VIET NAM

TRUONG DAI HOC BACH KHOA Độc lap — Tự do — Hanh phúc

NHIEM VU LUẬN VAN THẠC SĨHọ và tên học viên: Truong Ngoc Hiếu MSHV: 12110199

Ngày sinh: 20/07/1988 Nơi sinh: Bình Thuận

Chuyên ngành: Thực phẩm — D6 uống Mã số: 605402I Tén đề tai

PHAN LAP NAM MEN CHIU NHIET

II Nhiém vu va noi dung

e Phan lập nắm men chịu nhiệt.e Đinh danh sơ bộ nam men phân lập được

e Khảo sát khả năng lên men.e Xây dựng đường cong sinh trưởng.III Ngày giao nhiệm vụ: 20/01/2014

IV Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 14/07/2014

V Cán bộ hướng dẫnTS Trần Thị Ngọc YênPGS TS Lê Văn Việt Mẫn

Tp Hỗ Chí Minh, ngày tháng năm 2014

Cán bộ hướng dẫn Chủ nhiệm bộ môn

Trưởng khoa kỹ thuật hóa học

LỜI CÁM ƠN

Đầu tiên, em xin chân thành cám ơn cô Trần Thị Ngọc Yên đã tận tình hướngdẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Kê đền, con xin chân thành cam ơn gia đình đã hồ tro, động viên trong suôt qua

trình con học tập tại Trường Dai Hoc Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh

Ngoài ra, em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến tập thé thay cô bộ môn CôngNghệ Thực Phẩm, những người đã dẫn dắt, trang bị cho em những kiến thức cũng nhưkỹ năng cần thiết của người kỹ sư thực phẩm Em cũng chân thành cám on thay cô,

cán bộ phụ trách phòng thí nghiệm vi sinh, hóa sinh, sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ và

tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt luận văn này

Cuôi cùng, tôi xin cam ơn bạn be đã quan tam, chia sẽ, đóng góp ý kiên, giúp

đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2014

Tác giả luận án

Truong Ngọc Hiếu

LỜI CAM ĐOAN

Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả Các kếtquả nghiên cứu và kết luận trong luận án này là trung thực và không sao chép từ bất kỳnguôn nao, dưới bat kỳ hình thức nào Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được tríchdẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo theo đúng yêu cau

Tp Hồ Chi Minh, ngày tháng năm 2014

Tác giả luận án

Truong Ngọc Hiếu

ii

MỤC LỤC

0099.0000 i0899.60.0001 ii

TOM TAT LUẬN VAN woiceccecececcccccccccescessessessessessessessssessessessscsscsussvssucssssuesnesussussuesusssssuessessessesseeseess x

, S00 XI

01.07186005 10 585 -‹- |

Chương 2 TONG QUAN TÀI LIIỆU 2° 5° 2 2 £S££EEEEEEEEEE191111 211211211211 211 22111211 crk 2

2.1 Nắm men và quá trình lên menn - - © 5+2 SE S££E#EEEESEEEEE E21 1112102121211 21 0 2

ZV NAM MeN 2

2.1.1.1 Đặc điểm hình thai cece csesscseesssecscsscsessssessesessessssssssessesesseseeseeseaes 22.1.1.2 Diic dim sinh na ốc a7 2

2.1.1.2.1 Sinh sản vô tính - 5 1s 1H gọn 22.1.1.2.2 Sinh sản hữu tính - - 5G <1 1H HH ng nh 3

2.1.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa - 2 52252 SE S*23E E2 23 1131112212121 xe 4

2.1.1.3.1 Khả năng sử dụng các hợp chất cao phân tử: - 5c: 42.1.1.3.2 Khả năng tạo chất kháng sinh của các giống nắm men 5

"IV NN9) 8y 006.0 ằ .a 52.1.2.1 Lên men ethanOÌ - - G5 E1 1 HH ngờ 5

2.1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ethanol - 25-526

2.1.2.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ, ¿©5921 SE E29 2152121212121 1e xe 7

2.1.2.2.2 Anh hưởng của pH môi trường - 2 ¿5 2+E+£*+E2£s+xezxerred 72.1.2.2.3 Anh hưởng của hàm lượng đường - 2 - 5 ¿S522 +£*cE£xcxezxerred 7

2.1.2.2.4 Amb 0 00 in 8

2.1.2.2.5 Nồng độ rượu và khí CO; - ¿5+ <2 E923 1 1212112152121 21 211111 re 82.1.2.3 Cac giống nam men sử dụng trong lên men - 2-2 2 2 52 2+<+£++x+zxcse2 S2.1.2.3.1 Sản phẩm lên men ethanol công nghiệp 2-2 252552 2><+czsx2 S2.1.2.3.2 Sản phẩm lên men ethanol tự nhiên ¿5 2s 2+E+£££Ez£xzxezxeezced 9

"x00 10/0.) 8N na 9

2.2.1 Phương pháp phân loại nắm MeN - 2-2-2 2 SSE2E£ SE S2E£EzEeEEcEerervees 9

2.2.1.1 Phuong pháp phân loại cỗ điển - 2 5225 S*3 2x E22 re 102.2.1.2 Phương pháp phân loại dựa vào kỹ thuật di truyễn -5- 5555552 10

2.2.2 Khóa phân loại nắm men ¿5° 2 S622 SES£2E9E2ESEE2EEEE 2E 1122121212 II2.3 Nắm men chịu nhiỆ( - - G5 S219 SE E239 2121211111121 0111111012111 11 011111101 0 y0 13

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 2-2 52 52 <+52+sc>scced 15

3.1 V0 8 +1 15

3.2 Nguyên liệu và hóa chất - ¿+ 25< St E21 19121111 21112111115 1101111211 11111 1.11 101 0c 15

3.2.1 Nguyên liệu - - LG HH HH 15

3.2.1.1 Nguồn nguyên liệu ¿52 ©S£ SE+S S39 21212111 1511211210111 11.11 1.11 15

3.2.1.2 Xử lý nguyên liỆu - esse G22 E3 10H nh HH ng re 15

3.2.2 Hóa chất -cct.thnnhHHH HH hà gà nh ghe 173.3 So 0i 8n 183.4 Thiét Di VA 0 CU ‹<4- 19BAD 9 nh HH 19

3.4.2 Tiét trùng dung cụ và môi trường làm viỆcC - - - 5S S51 sseeeeesee 19

3.4.2.1 Bé mặt và môi trường làm Vi6C occ ecececccceccccesseseesesscsesscsesseseesesscsesseseeseseeees 19

3.4.2.2 Dụng cụ làm viỆC - - - c1 ng HH nh re 193.5 Cac loại môi trường nghiên CỨU - 5 G5 2 100991 191 201.2 1 ngà, 203.5.1 Môi trường Hansen đặc (MT1) - ee G S1 9n ng ng 203.5.2 Môi trường Hansen lông (MT 2) G G SH ng ng 20

3.5.3 Môi trường nhân giống (MT3) + SE x3 2922151121111 21221 12210111 1x cy 6 20

3.5.4 Môi trường thạch — nước (MÏÏ'4) - - <2 ng ng 213.5.5 Môi trường OF -Glucose (MT Š) - <9 ng ng ng và 21

3.5.6 Môi trường thử khả năng lên men nguồn carbon (MT6) - 5-5-5: 21

3.5.7 Môi trường Christensen (MĨ ÏÏ7) - << 99.000 ng ng và 213.5.8 Môi trường thi kha năng phân giải tinh bột (M T8) - - 555 S+<< e2 223.5.9 Môi trường thử kha năng hóa lỏng gelatin (MT9) SH sen 223.5.10 Môi trường 50% glucose (MT ÍÍ) - - - 5G S300 ng ng gen 22

IV

3.5.11 Môi trường 5% glucose, 10% NaCl (MT Í1) ceeeseeeceeeneceecessseeesensneees 223.5.12 Môi trường lên men (MTI12) ccc ceececcessececceseneceesesaeecessesecceseaaeeceseeeeseeaaees 22

3.5.13 Môi trường pha loãng mẫu 5-5-5 S222 SE 2E SE 3233132121211 1 212111 treo 23

3.6 Các thí nghiệm - - - G G0 KH Họ HT HT k 23

3.6.1 Phan lập, tạo giống thuần khiết và giữ giống .- 55c 23

3.6.1.1 Nguyên (ắc -L-c SH TH TH HH 001111011111 101gr ru 23

3.6.1.2 Phân lập Ăn HH Họ tre 23

3.6.1.3 Giữ giống - SH HH HH HH 2 1121 21 run 23

3.6.2 Quan sát đặc điểm hình thái - 5< SE S21 S1 1111121511210 211 11c cxe 243.6.2.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào - - 5255 SSSE re srkcrrrreg 243.6.2.2 Quan sát quá trình nay chồi ¿G52 22122 S* v22 2 2112121112111 ke, 24

3.6.2.3 Quam n6 on na h 4a 243.6.3 Khảo sát các đặc tính sinh lý sinh hóa - - 55 5 S1, 25

3.6.3.1 Chuan bị giống - (5+ 21T 1 2111221111 11211 1121121111 1111211111 gen 25

3.6.3.2 Kha năng chịu nhiỆ( - G5 <1 2 nọ nh ke 253.6.3.3 Kha nang di hoa 16 iäẳảáiđíđ45Ó5Ö-ÝŸ 253.6.3.4 Kha năng lên men các loại ườnng - - 5 55-1 1n ng ng ke 263.6.3.5 Kha năng phân giải nÏ{ra€ - (0 ng ng 263.6.3.6 Kha năng phân @iai UF€A -GG Q0 99 ng re 263.6.3.7 Kha năng phân giải tỉnh bột - - (5 Q9 ng ng ng ke 273.6.3.8 Kha năng hóa lỏng øelafine - - - - G5 - s1 ng ng ke 273.6.3.9 Khả năng sinh trưởng trên môi trường có 50% ølucose 273.6.3.10 Khả năng sinh trưởng trên môi trường có 5% glucose, 10% NaCl 273.6.4 Khảo sát hoạt tính lên men - G11 991 93019911 He 28

3.6.5 Dinh danh sơ bộ nắm men ¿2-2 52+ 9SE+ESE£E2E£E2ESEE 2E 1212211221211 2x1 28

3.6.6 Dựng đường cong sinh fFườngg - cceeesssnnceceecesssnceceecessssneeeececesssaeeceeceses 283.7 Các phương pháp nghiÊn CỨU - - - G5 19301 9 901 nọ vớ 28

3.7.1 Phương pháp xác định mật độ tế bào ¿5-52 S222 2E E2eErrrerrrreee 283.7.2 Phương pháp xác định nồng độ chất khô 2-2-2 52252 zSz+x+£czvezxcree 29

3.7.3 Phuong pháp xác định pH - - - - 5 5 SE 3 9 ng gen 29

3.7.4 Phương pháp xác định nồng độ cồn .- 2© 5 2S 2E E2 rverkrree 293.7.5 Phuong pháp định danh nam men 2-2-2 2S 2 S£E£+E£EE£E£E£EzxeEzverxcreee 293.7.6 Phương pháp xử lý kết quả thí nghiệm 2-2 2252222 SzcEe2xeEzverxcree 29Chương 4 KET QUÁ VA BAN LUẬN - 5-5-5252 121 12211211211111 211211011011 111 11 xe 30

4.1 Phân lập và tao giống thuần khiẾt - G5 S121 S3 3 2321121111 0111 1111012110111 ty 30

4.2 Khả năng chịu nhiệt của các giỗng nắm men phân lập - 5 2 <+c++x+zscxee 324.3 Đặc điểm hình thái của các giống nắm men phân lập 2 2 2s 2+x+zs+xze 33

4.6 Khả năng lên men của 12 giống nắm men phân lập - 43

4.7 Đường cong sinh trưởng của giống Y ÏI - 525 SE S23 E212 1112112102121 0.c1ye 45

4.7.1 Giai doan tidm phat 8 4 46

4.7.2 Giai đoạn sinh trưởng Ï0ØFFÏÍ - - G5 5< 3 9 ng re 47

4.7.3 c6 ốc a4 47

4.7.4 Giai GOAN SUY VOIE Q GGQQ nọ re 47

Chương 5 KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ, 5© 2 2S SE 3 11111111111 111 0110111112112 111 xe, 48

SD c3 na DỤ 485.2 4 )0.))HỒỶỒỖŨ 48

VỊ

Y VIII, Y XI, Y XIÍÏ - 25 << E21 6833681831 11883 11185 11115 ng rrrva 38

Hình 4.5 Khả năng sinh trưởng 4 giống nam men YI, YI, YIX, YX trên môi trường

CÓ 2% ØÏUCOS€ Gọi vv 39

Hình 4.6 Khả năng sinh trưởng của 5 giống nắm men YI, YII, YV, YIX, YX trên môi

trường có 5% glucose, 1LO% Na Ï - - GG SH ng 39

Hình 4.7 Đường cong sinh trưởng của giỗng nắm men Y ÏI - 25-5552 5s55¿ 46

Vill

DANH MỤC BANG

Bảng 4.1 Các giống nam men đã phân lập 40°C - 2-2 2 2522222 ££+E+Eezezxerereở 31Bảng 4.2 Kha năng chịu nhiệt của các giống nam men phân lập 33Bảng 4.3 Kha năng lên men các loại đường của 12 giống nam men phân lập 37Bang 4.4 Đặc điểm các nhóm nam men phân lập - + +55 2 s+s+s+s+s+z+>s2 40Bang 4.5 Đặc điểm của các loài nam men trong khóa phân loại Lodder - Kreger —

IX

TÓM TAT LUẬN VĂNNắm men là nguyên liệu quan trọng trong quá trình lên men nhưng sự sinhtrưởng của nắm men bị ức chế trong quá trình lên men do sự tăng nhiệt độ của dịch lênmen Nam men chịu nhiệt có thé được sử dụng để cải thiện sự hạn chế trên Nghiêncứu đã sử dụng các nguồn nắm men tự nhiên từ các loại dịch trái cây như nho, thơm,mía, man, đu đủ, chuối, dưa hau để phân lập ra nắm men chịu nhiệt Quá trình phânlập sơ bộ được thực hiện ở 40°C Kết quả đã phân lập được 12 giống nắm men chịunhiệt gồm có: 4 giống từ nho (YI, YII, YIH, YIV), 2 giống từ thơm (YV, YVD, 2giống từ mía (Y VII, Y VIII), 1 giống từ man (YIX), 1 giống từ đu đủ (YX), | giống từchuối (XI) và I giống từ dưa hau (YXII) 12 giống nắm men đã được định danh sơ bộbăng các khóa phân loại nắm men dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 12gidng nam men chịu nhiệt đã được khảo sát khả năng lên men, trong đó 5 giống nammen hình cầu (YII, YV, YIX), hình oval lớn (YI, YX) có khả năng sinh trưởng được ở43°C, lên men tạo được khoảng 6% v/v cồn Giống nam men YII có kha năng sinhtrưởng tốt và có hoạt tính lên men cao nhất, tao được 6.65% v/v côn Giống nắm menYII đã được chon dé xây dựng đường cong sinh trưởng trên môi trường dịch nho: 20°Brix, pH 4.0, (NHa)2HPO¿ 195 ppm, NaHSO; 112 ppm, với mật độ giống cay ban đầu

10° tế bao/ml

Yeast is one of materials effect to the winefermentation process Growth ofyeast is inhibited by the temperature increased in fermentation The thermotolerantyeast can be used to improve of temperature limited in process They can grow andferment under high temperature Base on original yeast from fluids (grape, pineapple,sugar cane, plum, papaya, bananas, and watermelon) which was used to isolate the

thermotolerant yeast The processing isolation was carried out at 40°C The results

were followed, 4 yeast strains (YI, YU, YUI, YIV), 2 yeast strains (YV, Y VI), 2 yeaststrains (Y VII, YVHI), 1 yeast strains (YIX), 1 yeast strains (YX), 1 yeast strains(Y XI), 1 yeast strains (Y XII) were isolated from grape, pineapple , sugar cane, plum,papaya, bananas and watermelon, respectively Based on the classification keys ofyeast (morphology, physiology, and biochemistry), 12 yeast strains were identifiedpreliminary 12 yeast strains were tested for potential of fermentation In which 5 yeast

strains YI, YII, YIH, YIV, YV were capabled to grow at 43°C, gererated about 6% v/v

alcohol in fermentation Yeast strain YII has highest potential of fermentation, wasgererated about 6.65% v/v alcohol Yeast strain YII has been chosen to build gowthcurve on the grape medium: 20° Brix, pH 4.0, (NH4)2HPO, 195 ppm, NaHSO3 112

ppm, initialyeast 10° cfu/ml

XI

Chương 1 MỞ ĐẦU

Đồ uống lên men đã được con người biết đến và sử dụng cách đây vài thế kỷ.Ngoài hương vị thơm ngon, nó còn giàu giá trị dinh dưỡng, chứa nhiều vitamin,khoáng chất, acid amin, đường Nước ta, với đặc điểm nông nghiệp nhiệt đới nên cónguồn nguyên liệu rất phong phú thuận lợi cho việc sản xuất các loại đồ uống lên men

Nắm men là vi sinh vật lên men chủ yếu trong sản xuất đồ uống lên men Bêncạnh nguyên liệu, giống nam men chính là một mau chốt công nghệ để tao ra nhữngsản phẩm có chất lượng khác nhau Sự sinh trưởng, phát triển, khả năng lên men củanắm men chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố môi trường như nguồn carbon, nito, pH môitrường, nồng độ đường đặc biệt là nhiệt độ và nồng độ cthanol Trong quá trình lênmen, lượng ethanol tích lũy và nhiệt độ lên men tăng, làm cho phan lớn nam men bị ứcchế hoặc chết Do đó các quá trình lên men công nghiệp thường sử dụng các hệ thốnggiải nhiệt, để điều khiển nhiệt độ lên men, dẫn đến làm tăng chi phí sản xuất Do đó,nắm men chịu nhiệt đã và đang được quan tâm nghiên cứu vì chúng có khả năng tăng

trưởng và lên men ở nhiệt độ cao, ứng dụng cho quá trình lên men ethanol hoặc trong

sản xuất đồ uống lên men

Mục tiêu của dé tài nhăm phân lập nguồn nam men có kha năng chịu nhiệt caohơn 42°C từ nhiễu nguồn nguyên liệu rau quả ở Việt Nam và khảo sát một số đặc tínhsinh hóa của các giống nắm men phân lập được Từ đó, làm cơ sở cho định hướng sử

dụng chúng trong các quá trình lên men.

Nội dung nghiên cứu của luận án gồm có 4 phan chính như sau:%* Phần 1: Phân lập nắm men chịu nhiệt Sử dụng các dịch trái cây khác

nhau như là nguôn vi sinh vật để phân lập.* Phần 2: Định danh sơ bộ giống nắm men phân lập được, dựa vào các đặc

điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, bằng các khóa phân loại nắm men.* Phan 3: Khảo sát sơ bộ khả năng lên men của giống nam men phân lập.* Phần 4: Dựng đường cong sinh trưởng của chủng nam men có khả năng

lên men tốt nhất

Chương 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Nam men và quá trình lên men2.1.1 Nắm men

2.1.1.1 Đặc điểm hình tháiTế bào nắm men có nhiều hình dạng khác nhau: hình tròn, hình trứng như

Saccharomyces cerevisiae, hình elip như Saccharomyces ellipsoideus, hình quả chanhnhư Saccharomyces apiculatus, đôi khi có hình chai như Saccharomyces ludwigu hoặc

hình ống dài như Pichia Hình dang của tế bào nam men ở các loài khác nhau thì khácnhau, trong cùng một loài hình dang của tế bào có thé thay đổi tùy thuộc vào điều kiệnmôi trường, điều kiện nuôi cay và tuổi tế bào Một số tế bào nam men có hình dai, nốitiếp nhau tạo thành dạng sợi gọi là khuẩn ty giả như Endomyces, Endomycopsi Nhiềuloài nằm men chỉ tạo khuẩn ty giả khi sống trong môi trường thiếu oxy [7]

Tế bào nắm men có kích thước tương đối lớn chiều dài từ 6 10 um, có khi 12 18 um, chiều ngang từ 4 - 8 um, kích thước của tế bào nam men thay đổi nhiều tùythuộc vào loài, giống và điều kiện của môi trường sống [2] Trong môi trường lỏngnhiều loài nắm men có khả năng sinh ra một lớp màng bao bọc như tắm voan mỏng

-như loài Saccharomyces hoặc dày -như loài Drojdiile micodermice Trên môi trường

đặc, khuẩn lạc nắm men có nhiều hình dạng khác nhau, màu trắng đục, vàng hoặchong nhạt Tế bào nắm men trong tự nhiên có thé đứng riêng lẻ hoặc sau khi nay chỗi

vẫn dính với nhau tạo thành chuỗi [4]

2.1.1.2 Đặc điểm sinh san [7]

2.1.1.2.1 Sinh san vô tính

Nay chi là hình thức sinh sản đơn giản nhất của nắm men, khi đó thành tế bàomở ra dé tao ra một chôi Chéi phát triển thành tế bào con và có thé tách khỏi tế bàomẹ ngay từ khi còn nhỏ hoặc cũng có thé vẫn không tách ra ngay cả khi lớn bằng tếbào mẹ Nhiều khi, nhiễu thế hệ vẫn dính vào một tế bao dau tiên dé nảy chdi và taothành một cành nhiều nhánh tế bào trông giống như cây xương rong Choi có thé mocra theo bất kỳ hướng nào (nảy chổi đa cực) hoặc chỉ nảy chổi ở hai cực (nảy chéilưỡng cực) hoặc chỉ nay chổi ở một cực nhất định (nảy chổi theo một cực) Nam mencòn có hình thức sinh sản phân cắt như vi khuẩn Có thé hình thành một hay vài vách

2

ngăn dé phân cắt tế bào mẹ thành những tế bào phân cat Điển hình cho kiểu phân cắtnày là các nắm men thuộc chỉ Schizosaccharomyces Ở một số nam men thuộc ngànhNam đảm, có thé sinh ra dạng bao tử có cuống nhỏ hoặc bào tử băn Bào tử có cuốngnhỏ thường gặp ở các chi nam men Fellomyces, Kockovaella và Sterigmatomyces, khiđó chổi sinh ra trên một nhánh nhỏ và tách ra khi nhánh bị gay Bao tử ban được sinhra trén mot gai nhon cua tế bào nắm men va bị ban ra phia đối diện khi thành thục.Nếu cay các tế bào nắm men sinh bào tử bắn thành hình zich zac trên thạch nghiênghoặc trên đĩa petri thì sau một thời gian nuôi cay sẽ thấy xuất hiện trên thành ốngnghiệm hoặc nắp đĩa petri một hình zich zac khác được hình thành bởi các bào tử bắnlên Bào tử băn là đặc điểm của nim men thuộc các chi Bensingtonia, Bullera,Deoszegia, Kockovaella, Sporobolomyces Một số nam men còn có một hình thứcsinh sản vô tính nữa, đó là việc hình thành các bào tử đốt Khi đó sẽ hình thành cácvách ngăn ở đầu các nam men dạng sợi, sau đó tách ra thành các bào tử đốt Loại nàygặp ở các nam men thuộc cả hai ngành: Nam túi và Nam đảm Thường gặp nhất là ởcác chi nam men Galactomyces, Dipodascus (dạng v6 tinh là Geotrichum)va Trichosporon Nắm men còn có thé tạo thành dạng tản dưới dạng khuẩn ty (soinắm) hay khuẩn ty giả (giả sợi nắm).

2.1.1.2.2 Sinh sản hữu tinh

Dạng sinh sản hữu tính ở nắm men là dạng các bào tử túi được sinh ra từ cáctúi Có thé xảy ra sự tiếp hợp giữa hai tế bào nắm men tách rời hoặc giữa tế bào mẹ vàchổi Còn có cả sự biến nạp trực tiếp trong | tế bao sinh dưỡng, tế bào này biến thànhtúi không qua tiếp hợp Thường trong mỗi túi có 4 hay đôi khi có 8 bào tử túi Trongmột số trường hop lại chỉ có 1-2 bào tử túi Bào tử túi ở chi Saccharomyces có dạnghình cầu, hình bau dục, ở chi Hanseniaspora và loài Hansenula anomala có dạng hình

mũ, ở loài Hansenula saturnus bao tu túi có dang quả xoài giữa có vành dai như dạng

Sao Thổ Một số bào tử túi có dạng kéo dai hay hình xoăn Bê mặt bào tử túi có thénhẫn nhui, có thé xù xì hoặc có gai Bào tử màng day (hay bào tử áo) là dạng bào tửgiúp nắm men vượt qua được điều kiện khó khăn của ngoại cảnh, chứ không phải là

hình thức sinh sản Một so nâm men còn có thê sinh vỏ nhây.

2.1.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa2.1.1.3.1 Khả năng sử dụng các hợp chất cao phân tử [4]

“+ Carbonhydrate

Đối với nam men, nguén carbon thích hợp nhất là các loại đường như glucose,fructose, saccharose, maltose, rafinose, lactose, dextrin Các giống thuộc loàiSaccharomyces có khả năng đồng hóa được các loại đường hexose và nói chung khôngđồng hóa được đường pentose

Các giống nắm men riêng biệt sử dụng các nguồn đường rất khác nhau Ví dụ:các giống nam men rượu sử dụng đường glucose, các giống nam men bia sử dụng

đường maltose.

Các tế bào nắm men trước khi sử dụng các loại đường trong môi trường đều

phải thực hiện một trong hai quá trình sau:

- Hap thụ hoàn toàn các loại đường đó như maltose và maltotriose có khả năngkhuếch tán trực tiếp qua màng tế bào

- Thuy phân trong môi trường rồi mới hap thụ như saccharose cần phải thủy phântrước bởi enzyme ngoại bào rồi sau đó các sản phẩm thủy phân này mới đượchấp thụ

Như vậy, đối với các giống nam men chỉ sử dụng các loại đường có trong môitrường mà không có khả năng phân giải nguồn nguyên liệu tinh bột bằng enzyme, cầnphải đường hóa các nguyên liệu trước khi tiến hành lên men

“+ Protein

Sự phát triển của nấm men liên quan đến kha năng hap thụ nito, chủ yếu là cácloại acid amin Chúng được nắm men sử dụng để tổng hợp protein các hợp chất chứanitơ khác Nam men tiêu thụ tốt các acid amine, kém hơn là các peptone va hoàn toàn

không tiêu thụ được các protein tự nhiên.

Đối với nam men rượu, không phải tất cả các acid amine đều sử dung được

Người ta chia acid amine thành các nhóm:

- Nhóm hấp thu nhanh: isoleucine, triptophane, arginine, valine, histidine,

asparatic acid.

- Nhóm hap thu cham: trionine, phenylalanine, tyrosine, methionine, serine,

glysine, lecine, glutamic acid.

- _ Nhóm không hap thu: proline

2.1.1.3.2 Khả năng tạo chất kháng sinh của các giống nam men [23]Killer toxin hay còn gọi là zymocine: là các chất kháng sinh được một số giốngnắm men và vi nam tiết ra nhằm chống lại sự cạnh tranh giữa các giống cùng loài hoặcgiống thuộc ho gan Hiện tượng này lần đầu tiên được Bevan và Macower phát hiệnnăm 1963 trên các giống nam men Saccharomyces Cho đến nay khả năng sinhzymocine đã được tìm thay ở nhiều giống nắm men thuộc các họ khác nhau như:

Pichia, Kluyveromyces, Debaryomyces, Hanseniaspora, Zygosaccharomyces,

Candida, Sporidiobolus Tat cả các zymocine đều được biết đến là các polypeptidehoặc glycoprotein Đặc tính sinh học có thé được mã hóa trên ARN mạch kép, DNAplasmid và mạch thắng trên chromosome Do tính chất chọn lọc rất cao, zymocine cótiềm năng như những chất kháng sinh hữu hiệu chống lại một số bệnh nan y

2.1.2 Quá trình lên men [7]

2.1.2.1 Lên men ethanol

Nam men là vi sinh vật hiếu khí tùy tiện Khi thiếu O>, chúng lên men chuyềnhóa đường thành rượu, CO, các sản phẩm phụ và các sản phẩm trung gian khác như

các rượu bậc cao, acid hữu cơ, ester, aldehyde Lên men là một quá trình sinh hóa

phức tạp, bao gồm một chuỗi phan ứng theo các con đường khác nhau Có thé chia quá

trình lên men rượu thành 2 giai đoạn:

- _ Giai đoạn tăng sinh khối nắm men: giai đoạn này nam men nảy chdi và pháttriển mạnh để tăng sinh khối vì trong môi trường đây đủ dinh dưỡng và oxi.- _ Giai đoạn lên men: có thé chia thành 5 giai đoạn với các sản phẩm như sau:

e Giai đoạn phosphoryl hóa:

D — Glucose Mg, hexokinase _ D - Glucose 6 phosphate

5

D — Glucose 6 phosphate_phosphohexoizomerase, D— Fructose 6 phosphate

Dioxyacetophosphate < » D- glyceraldehyde 3 phosphate

e Giai đoạn oxy hóa:D — glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase, | ,3 — diphosphoglycerate

1,3 —- diphosphoglycerate 4 > 3 — phosphoglycerate

3 — phosphoglycerate < > 2 - phosphoglycerate2- phosphoglycerate ¥ > Phosphoenol pyruvate + H,Oe Giai đoạn tao pyruvate:

Phosphoennol pyruvat pyruvatekinase , Pyruvate

e Giai đoạn chuyển pyruvate thành ethanol:

Pyruvate _pyruvatdecarboxylase_, Acetaldehyde + CO,Acetaldehyde _alcoholdehydrogenase_, Ethanol

San phẩm chính của quá trình lên men là ethanol và CO Tuy nhiên, thực tế chothay răng, sản phẩm sau quá trình lên men là hỗn hợp các acid, rượu, amin, este Đólà do sản phẩm sinh ra trong các giai đoạn có thé được chuyền hóa theo các con đườngkhác nhau Tùy vào enzyme tham gia phản ứng mà sản phẩm tạo thành sẽ khác nhau.Chang hạn, ở giai đoạn tao pyruvate, nếu enzyme tham gia phản ứng là lactasedehydrogenase thì sản phẩm tạo thành sẽ là acid lactic Hoặc trong trường hợppyruvate bị khử thành diacetyl thì sản phẩm tạo thành sẽ là butanediol

2.1.2.2 Các yếu tô anh hưởng đến quá trình lên men ethanolNắm men đòi hỏi phải có những điều kiện nhất định mới có thể lên men Trongsản xuất ethanol, ngoài việc lựa chọn giống nam men còn phải nghiên cứu tạo điềukiện thích hợp để đạt hiệu suất lên men cao Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên

men ethanol như:

2.1.2.2.1 Anh hưởng của nhiệt độNhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng, hoạt tính trao đối chatcủa vi sinh vật và chất lượng sản phẩm lên men Mỗi vi sinh vật đều có một yêu cầunhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của mình Các nhà sản xuất cần phải chọn nhiệt độlên men thích hợp để năng suất và chất lượng sản phẩm cao nhất, đồng thời tiết kiệmđược chi phí sản xuất [3].

Nhiệt độ càng cao, lên men càng sớm bắt đầu, tốc độ nhanh và kết thúc sớmnhưng hàm lượng đường sót còn khá lớn Điều này có thể là nguy hiểm vì vi khuẩnlactic có thể sử dụng đường sót để lên men lactic làm ảnh hưởng nhiều đến chất lượngsản phẩm

Ngoài ra nhiệt độ còn ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp các sản pham thứcấp và sản phẩm phụ Nhiệt độ càng cao càng dễ sinh và tích tụ các sản phẩm phụngày càng nhiều Điều này gây bất lợi cho sản phẩm chính

2.1.2.2.2 Anh hướng của pH môi trường [4]pH môi trường có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nam men pH môi trườngcó khả năng ảnh hưởng đến pH nội bào, làm tăng hoặc giảm khả năng khuếch tán cácchất dinh dưỡng cũng như chiều hướng quá trình lên men Đối với quá trình lên menethanol, pH thích hop để tao ethanol trong khoảng 4.0 — 5.0 Nếu pH thấp trongkhoảng 3.0 — 4.0, nắm men còn hoạt động được, vi khuẩn bị ức chế Nếu pH hơi caohơn thì sản phẩm tạo ra có độ chua thấp, dễ bị nhiễm khuẩn, tạo nhiều sản phẩm phụ.hiệu suất lên men thấp Trong quá trình lên men, pH canh trường luôn luôn thay đổi,do đó cần giữ pH trong giới hạn thích hợp dé ức chế hoạt động của vi khuẩn

2.1.2.2.3 Anh hưởng của hàm lượng đườngĐường là cơ chất chính trong môi trường được nắm men sử dụng để sinh tổnghop năng lượng cho tế bào, đồng thời chuyền hóa thành ethanol, CO; cũng như các sảnphẩm phụ khác Hàm lượng đường có ảnh hưởng rất lớn đến năng lực lên men củanam men Hàm lượng đường thích hợp nhất là 13 — 15% tương đương nông độ chấtkhô từ 16 — 18% Nếu hàm lượng đường quá cao sẽ làm tăng áp suất thâm thấu và làmmat cân bằng trạng thái sinh lý của nắm men Nếu hàm lượng đường thấp sẽ khôngthuận lợi cho quá trình lên men [4] Trong thực tế, ở hàm lượng đường 30 — 35% thì sự

lên men bị đình chỉ cho dù có loại nắm men có khả năng sinh trưởng được ở hàmlượng đường lên đến 60%.

2.1.2.2.4 Anh hưởng của OxiNắm men là loài vi sinh vật hiếu khí tùy tiện và chỉ trong điều kiện ky khí nómới tiến hành lên men rượu Tuy nhiên, nam men vẫn can oxi dé tăng sinh khối Do đócần tạo điều kiện ky khí một cách phù hợp đề thuận lợi cho quá trình lên men

2.1.2.2.5 Nông độ rượu và khí CO;Đa số nam men chỉ lên men được tới nồng độ rượu 13 — 14% v/v, chỉ một số ítcó thê lên men đến nông độ rượu 17 — 20% v/v [4] CO, được hình thành trong quátrình lên men, một phân thoát ra khỏi môi trường, một phan tích tụ trong môi trườnglàm giảm kha năng lên men của nam men Tuy khí CO; ức chế sự lên men nhưng việcthoát khí CO; lại có tác dụng tốt đến quá trình lên men Sự thoát khí CO, sẽ làm chomôi trường luôn bị khuấy động, kéo dài trạng thái lơ lửng của nam men, do đó làm

tăng nhanh quá trình lên men.

2.1.2.3 Các giống nam men sử dụng trong lên men2.1.2.3.1 Sản phẩm lên men ethanol công nghiệp [4]Thường dùng các giống nam men thuan thuộc loài Saccharomyces bởi chúng cócác ưu điểm như: chất lượng lên men cao, hàm lượng đường sót ít, khả năng kết langtốt, làm trong dịch lên men nhanh, chịu được độ rượu cao, độ acid của môi trường vàtạo được hương vị thơm ngon tỉnh khiết Một số giống nắm men Saccharomycethường dùng trong sản xuất công nghiệp là:

e Saccharomyces cerevisae: là loài pho bién trong quá trình lên men Cácgiống của loài này có khả năng chịu được độ cồn từ 18 — 20% v/v, có khảnăng lên men tốt, chịu sunfite, tổng hợp các cau tử bay hơi và các sản phẩmthứ cấp làm cho sản phẩm lên men có mùi vị đặc trưng riêng biệt Ở giaiđoạn cuối, nắm men Saccharomyces cerevisae kết lang nhanh và làm trongsản phẩm

e Saccharomyces vini: có khả năng kết lang nhanh, sinh sản theo lỗi nảy chdi,

tạo thành bao tử, có khả năng thủy phan đường saccharose thành glucose va

fructose Tuy nhiên giai đoạn cuối quá trình lên men các tế bào

Saccharomyces vini bi già và chét nhanh.

8

e Saccharomyces uvarum: giỗng này được tách từ nước quả lên men tự nhiên.Vẻ hình thức nó không khác với các loài khác Khả năng sinh bào tử mạnhtrên môi trường thạch — malt Chịu được độ côn 12 — 13% v/v trong dịch lênmen Một số loài được dùng trong sản xuất rượu vang.

e Saccharomyces oviformis: chịu đường cao, cồn cao, lên men kiệt đường vàtạo tới 18 độ cồn, có khả năng lên men nhiều loại đường khác nhau

e Saccharomyces chevalieri: có khả năng lên men tạo đến 16% v/v côn.2.1.2.3.2 Sản phẩm lên men ethanol tự nhiên

Hệ vi sinh vật trong lên men tự nhiên tương đối phức tạp và không đồng nhất

trong quá trình lên men Trong nước nho tươi có những nhóm vi sinh vật khác nhau

như nam mốc (79 — 90%), nam men (9 — 22%), số còn lại chiếm tỷ lệ thấp là vi khuẩn,xạ khuẩn Trong đó nắm men chủ yếu là Hanseniaspora, Klocekera, Pichia,

Kluyveromyces, Candida, Cryptococus va một lượng nhỏ Saccharomyces [21] Khi

phân lập nam men trong nước quả lên men tự nhiên, người ta thay có rất nhiều loài Hệnam men phát triển trong giai đoạn đầu quá trình lên men thường là Hanseniaspora,Klocekera, Candida Cac giống nắm men khởi đầu hoạt động sản sinh được vài độcồn rồi ngừng và chết dần Đồng thời cũng tao ra nhiều ester va acid bay hơi, tao racác hương thơm đặc trưng của sản phẩm Sau đó, nam men Saccharomyces phát triển

nhanh chóng, lên men mạnh, lượng đường tiêu hao nhanh và tích lũy ethanol trong

dung dịch Khi độ côn tương đối cao (8 -12% v/v), nam men S ellipsoideus hay S viningừng phát triển Khi ay nam men S ovifornis tiếp tục lên men cho đến khi kết thúc.Ngoài ra , trên các sản phẩm lên men tự nhiên còn có các giỗng nam men sinh ra nhiềuacid acetic, acetaldehyde, glycerol Một số giống như Zygosaccharomyces,Torulopsis, Hansenula, Pichia | 13], sinh trưởng trên bề mặt canh trường, tạo thànhlớp màng mỏng, làm cho sản phẩm có mùi tạp, gây hư hỏng ảnh hưởng xấu đến chấtlượng sản phẩm

2.2 Phân loại nắm men2.2.1 Phương pháp phân loại nam men [7]Đề phân loại nam men, người ta sử dụng phương pháp phân loại cô điển (dựavào đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa) và phương pháp phân loại dựa vào kết quảcủa kỹ thuật di truyền

`Sd

2.2.1.1 Phương pháp phan loại cổ điểnDé phân loại nam men, người ta phải tiễn hành nghiên cứu các đặc điểm sau:Đặc điểm hình thái: tế bào, khuan lạc, kiểu nảy chéi, các dạng bào tử vô tính vàhữu tính, khuẩn ty và khuẩn ty giả

Đặc điểm sinh lý và sinh hoá:

Lên men 13 loại đường

Đồng hóa 46 nguồn carbon Có thé dùng bộ kit chan đoán nhanh ID 32C (BioMérieux SA, Marchy-l Êtoile )

Tính chống chịu với 0,01% hoặc 0,1% cycloheximide (có thé bao gồm trong

bộ kit ID 32C).

Đồng hoá 6 nguồn nito: nitrate, nitrite, ethylnamine hydrochloride, L-lyzine,

cadaverine dihydrochloride, creatine.

Sinh trưởng khi thiếu hụt một số vitamin (myo-Inositol, calcium pantothenate,

biotin, thiamine hydrochloride, pyridoxin hydrochloride, niacin, folic acid, aminobenzoic acid.

p-Sinh trưởng tại các nhiệt độ khác nhau: 25, 30, 35, 37, 42°C.Tạo thành tinh bột.

Sản sinh acid từ glucose.Thủy phân urea.

Phân giải Arbutin.Phân giải lipid.

Năng lực sản sinh sắc tô

Sinh trưởng trên môi trường chứa 50% và 60% glucose.Hóa lỏng gelatine.

Phản ứng với Diazonium Blue B.

Phát triển trên môi trường chứa acid acetic 1%.2.2.1.2 Phương pháp phân loại dựa vào kỹ thuật di truyềnPhương pháp phân loại cổ điển có tính chính xác không cao và bị hạn chế khixác định các giống có đặc điểm gần giống nhau Mặc khác thời gian kiểm tra thường

bị kéo dai.

10

Ngày nay cùng với sự tiến bộ của sinh học phân tử, nhiều phương pháp phân

loại mới có độ chính xác cao đã được nghiên cứu và ứng dụng Trong đó phương pháp

phân tích trình tự chuỗi RNA ribosome của tế bao nam men đã được biết đến như một

phương pháp phân loại hiện đại, nhanh chóng và có độ tin cậy cao Phương pháp phân

loại này dựa vào trình tự chuỗi RNA của các gen rl8S, 26S và ITS

2.2.2 Khóa phân loại nam menPhân loại nam men là công việc không hé đơn giản Từ trước đến nay có rấtnhiều khóa phân loại của các tác giả khác nhau

> Hansen là người đưa ra khóa phân loại nam men dau tiên Ong chia nam menthành § giống Saccharomyces, Saccharomycopsis Monospora,

Zygosaccharomyces, Pichia, Nematospora, Saccharomycodes va Willia [ L].

> Năm 1907, Klocker chia nắm men thành 12 giống với 3 giống phụ:Saccharomyces (giỗng phụ là Zygosaccharomyces), Hanseniaspora, Nadsodia,Torulaspora, Pichia (giỗng phụ là Pichia và Zygopichia), Monospora, Atichia,

Debaryomyces, Schwanniomyces, Nematospora và Saccharomycodes [T].

> Năm 1920, Guilliermond chia nam men thành 2 nhóm với 18 giống:e Nhóm nắm men thật: Schizosaccharomyces, Nadsodia, Saccharomycodes,

Hanseniaspora, Monospora, Zygosaccharomyces, Schwanniomyces,Saccharomycopsis, Pichia, Nematospora, Debaryomyces, Torulaspora,Saccharomyces va Willia [1].

e Nhóm nam men giả: Torula, Mycoderma, Pseudosaccharomyces và

Cryptococcus [1].

> Nam 1952, Lodder cùng với Van Rij tổng kết lại một cách khá hoàn thiện vềvấn đề phân loại nắm men Năm 1971, Lodder bé sung và sửa chữa lại tài liệuphân loại nắm men đây đủ nhất và có uy tín nhất hiện nay [1]

> Năm 1954, Kudriavtxev đã xếp nam men vào bộ Unicellomycetables gồm 3 ho:

Saccharomycetaceae, Schizosaccharomycetaceae và Saccharomycodaceae [LH].

> Năm 1962, Phương Phương Tâm đã chia nam men thành 31 giống va 11 giốngphụ Mặc dù hệ thông phân loại của Kudriavtxev và Phương Phương Tâm đángđược chú ý nhưng đến nay vẫn không được sử dụng rộng rãi và thông dụng nhưhệ thống phân loại của Lodder cùng với Van Rij [1]

II

> Theo khóa phân loại của Lodder (1971), nắm men được chia thành 39 giống và

4 nhóm:

e Nhóm 1: nhóm nam men hình thành nang thuộc lớp nam túi gdm 22 giống:

Citeromyces, Coccidiascus, Debaromyces, Dekkera Endomycopsis,Hanseniaspora, Hansenula, Kluyveromyces, Lipomyces, Lodderomyces,

Metschnikowia, Nadsonia, Nematospora, Pachysolen, Pichia,Saccharomyces, Saccharomycodes, Saccharomycopsis,

Schizosaccharomyces, Schwanniomyces, Wikerhamia, Wingea [1].

e Nhóm 2: nhóm nam men giả thuộc bộ Ustilaginales gồm 2 giỗng:

Leucosporidium, Rhodosporidium [1].

e Nhóm 3: nhóm nắm men giả thuộc bộ Sporobolomycetaceae gồm 3 giỗng:

Bullera, Sporidiobolus, Sporobolomyces []]:

e Nhóm 4 nhóm nam men không sinh bào tử không thuộc hoSporobolomycetaceae gồm 12 giỗng Bretlanomyces Candida,

Cryptococcus, Kloeckera, (osportlium, Pityrosporum, Phodotorula,Schizoblastosporion, Sterigmatomyces, Torulopsis, Trichosporon, Triginopsis[1].

> Năm 1984, Kurtzman va Fell đã chia nắm men thành 2 ngành: ngành nam túi vangành nắm đảm Bào tử túi là bào tử hữu tính đặc trưng cho ngành nắm túi, bàotử đảm là bào tử hữu tính đặc trưng cho ngành nắm đảm [7, 23]

% Các chi nắm men thuộc ngành nam túi:e Dang sinh sản hữu tính: gồm có 42 chi: Ambrosiozyma, Arxyozyma,

Ascoidea, Babjevia, Cephaloascus, Citeromyces, Clavispora, Coccidiascus,Cyniclomyces, Debaromyces, Dekkera Dipodascopsis, Dipodascus,

Endomyces, các chi nam ky sinh giỗng Endomyces (Helicogonium White,

Myriogonium Cain, Phialoascus Redhead & Malloch, TrichomonacusJackson), Eremothecium, Galactomyces, Hanseniaspora, Issatchenkia,Kluyveromyces, Lipomyces, Lodderomyces, Metschnikowia, Nadsonia,Pachysolen, Pichia, Protomyces, Saccharomyces, Saccharomycodes,Saccharomycopsis, Saturnispora, Schizosaccharomyces, Sporopachydermia,

12

Stephanoascus, Torulaspora, Wickerhamia, Wickerhamiella, Williopsis,Yarrowia, Zygoascus, Zygosaccharomyces va Zygozyma.

e Dang sinh sản vô tinh: gồm có 15 chi: Aciculoconidium, Arxula,

Blastobotrys, Botryozyma, Brettanomyces, Candida, Geotrichum, Kloeckera,Lalaria, Myxozyma, Oosporidium, Saitoella, Schizoblastosporion,Sympodiomyces va Trigonopsis

s* Các chi nắm men thuộc ngành nam dam:e Dang sinh sản hữu tính: gom có 19 chi: Agaricostibum, Bulleromyces,

Chionosphaera, Cystofilobasidium, — Erythrobasidium, Fibulobasidium,Filobasidiella, Filobasidium, Holtermannia, Leucosporidium, Mrakia,Rhodosporidium, _Sirobasidium, | Sporidiobolus, | Sterigmatosporidium,Tilletiaria, Tremella, Trimorphomyces va Xanthophyllomyces.

e Dang sinh san v6 tinh: gom c6 21 chi: Bensingtonia, Bullera, Cryptococcus,

Fellomyces, Hyalodendron, Itersonilia, Kockovaella, Kurtzmanomyces,Malassezia, Moniliella, Phaffia, Pseudozyma, Reniforma, Rhodotorula,Sporobolomyces, Sferigmatomyces, | Sympodiomycopsis, _ Tilletiopsis,Trichosporon, Trichosporonoides va Tsuchiyaea.

2.3 Nam men chiu nhiétQuá trình lên men ở nhiệt độ cao có nhiều ưu thế như tốc độ lên men nhanh,giảm chi phí hệ thong làm mát, giảm vi khuẩn tạp nhiễm, có thé ứng dụng quá trìnhđường hóa và lên men đồng thời [20] Do đó, nắm men chịu nhiệt đang được nghiêncứu, khảo sát khả năng ứng dụng ở nhiều nước trên thế giới, trong đó có nước ta Tuynhiên, các báo cáo về nam men chịu nhiệt vẫn còn trên qui mô phòng thí nghiệm Chicó một số lượng hạn chế các nghiên cứu thành công về việc lựa chọn và phân lập cácgidng nam men có khả năng tăng trưởng, lên men ở 40°C hoặc cao hơn Vì vậy, việcứng dụng nam men chịu nhiệt vào qui mô công nghiệp van còn hạn chế Một số giốngnam men chịu nhiệt đã và đang được nghiên cứu như: S cerevisae, K maxcianus,

Pichia kudriavzevii, Hansenula polymorpha, Debaromyces hansenii, I orientalis,

C.glabrata Trong đó nổi bật nhất là S cerevisae, K maxcianus và Pichia

kudriavzevit.

13

S cerevisae là giỗng được sử dụng nhiều nhất trong qui mô công nghiệp So vớicác giống khác thì S cerevisae có nhiều ưu thé hơn như: có khả năng lên men cao, tiêuthụ đường nhanh hơn, ít sản phẩm phụ sản lượng ethanol cao hơn và chịu được nôngđộ ethanol cao hơn Ngoài ra S cerevisae còn an toàn trong công nghiệp thực phẩm va

nước giải khát Tuy nhiên khả năng chịu nhiệt của S cerevisae lại kém Ngay cả các

giống S cerevisae được phân lập từ các vùng nhiệt đới chỉ có thé lên men được ở nhiệtđộ cao nhất là 41°C [11] Do đó, dé làm tăng khả năng chịu nhiệt của S cerevisaethường sử dụng các phương pháp gây đột biến hoặc tái tổ hợp gene

Hiện nay, K marxianus dang được quan tâm nghiên cứu, có nhiều triển vọngthay thế cho S.cerevisae Nhiều giỗng K marxianus có thé phát triển ở nhiệt độ cao 45— 52°C, và lên men ethanol ở 38 — 45°C Hơn nữa, K marxianus còn có tốc độ tăngtrưởng cao và lên men nhiều loại đường (arabinose, galactose, mannose, xylose) Tuynhiên, các so sánh về hệ thống trao đổi chất giữa K marxianus và S cerevisae cònchưa day đủ Vì thé K marxianus vẫn chỉ được sử dung trong các nghiên cứu về lênmen phụ phẩm công nghiệp như bã mía, ngô, trái cây, mật rỉ đường [29]

Gần đây, thêm một SỐ giống nắm men chịu nhiệt mới được phân lập và đang

được nghiên cứu như Debaryomyces hansenii [30], Pichia kudriavzevii [16],

Issatchenkia orientalis [24] Trong đó giỗng Pichia kudriavzevii có tiềm năng lớn chocác ứng dụng vào qui mô công nghiệp Giống này, có khả năng lên men ở 42°C, vớisản lượng ethanol có thé lên tới 85% trên mỗi g glucose Ngoài ra, Pichia kudriavzeviicòn có thé lên men đường pentose, các tế bào Pichia kudriavzevii có thê tái sử dụngcho 4 lần lên men mà không giảm đáng kế hoạt tính lên men [28]

14

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU3.1 Nội dung của đề tài

e Phân lập nam men có khả năng chịu nhiệt để bồ sung vào nguồn giống cho

các quá trình lên men.

e Định danh sơ bộ nam men phân lập.e Khảo sát hoạt tính lên men của các giỗng nam men phân lập.e Xây dựng đường cong sinh trưởng của giống nam men có hoạt tính lên

men cao nhất.3.2 Nguyên liệu và hóa chất

ppm.

3.2.1.2 Xứ lý nguyên liệu

e Nguồn vi sinh vật tự nhiênCác nguyên liệu sau khi thu mua về được Xử lý sơ bộ: rửa sạch, để ráo Sau đóxay bằng máy xay sinh tố Nguyên liệu sau khi xay được cho vào các erlen loại 250ml, đậy kín bằng nút bông không thắm nước Cho các erlen có chứa nguyên liệu vào tủâm, ủ ở 40°C trong khoảng 3 ngày Dung dịch này được sử dụng để phân lập nắm menchịu nhiệt bằng phương pháp dàn đều và cấy ria trên dia petri

e Môi trường lên men

Giống nho sử dung là nho Syrah Ninh Thuận Nho sau khi thu mua về, được xửlý sơ bộ, sau đó ép lay dịch rồi trữ đông dé dùng trong suốt quá trình thí nghiệm Dich

15

nho trước khi sử dụng được rã đông và thanh trùng bằng NaHSO; 112 ppm Qui trìnhép nho được tiền hành như sau:

Nho

Vv

Tach cuông

APectinase Xu ly enzyme

0.1% Vv 45 — 50°C, 120 phút

Vv

Gia nhiệt70°C, 5 phút

NaOHNaHSO;(NH4).SO4

AgarPepton Trung QuốcCao nam men

Cao maltNatri Acetate

Kali NitrateUreaAcid citricXanh methyleneBromthymol blue

Phenol red

17

3.3 Sơ đồ nghiên cứuCác giai đoạn nghiên cứu được trình bày theo sơ đồ sau:

men

Khảo sát quá trình lên men

Hoạttính

men

Lén

men

cacloạiđường

Hình 3.2 Sơ đỗ nghiên cứu

18

3.4 Thiết bị và dụng cụ3.4.1 Chuẩn bị

e Máy đo pH để bàn

e May ép trái cây

e Máy xay sinh tôe Nồi hấp

e Nồi tiệt trùnge Máy lắc Vortexe Tủ sấy

e Bé điều nhiệt

e Cân điện tử

e Tuame Kính hién vi quang họce Tủ cấy

e Brix kế cầm taye Ông nghiệm, petri, erlen, becher, pipet

3.4.2 Tiệt trùng dụng cụ va môi trường làm việc [2]

3.4.2.1 Bề mặt và môi trường làm việc- Cửa số ra vào phải được đóng trước thời điểm làm việc.- Khử trùng bề mặt bang côn 70°

- Đối với tủ cấy, sau khi lau bang cồn 70°, bật đèn UV trong khoảng 15 phút

3.4.2.2 Dụng cụ làm việc

- Trước khi tiệt trùng, các dụng cụ cần được làm sạch và say khô.- Các dụng cụ can được gói kín trong giấy bạc hoặc đậy kín hộp dé đảm bảo sau

khi tiệt trùng, dụng cụ không bị nhiễm lại từ môi trường bên ngoài

- Ông nghiệm thủy tinh cần phải đậy bằng bông không thắm nước.- Hộp petri cần được gói trong giấy

- Pipet, que trang, đũa thủy tinh nếu can tiệt trùng can phải gói vào giấy bạc.- Đầu micropipet bang nhựa chịu nhiệt phải được đậy trong hộp kin

- Tiệt trùng dụng cụ băng nỗi autoclave ở 121°C trong khoảng 20 — 30 phút

19

3.5 Các loại môi trường nghiên cứu [2, 7, 23]

3.5.1 Môi trường Hansen đặc (MT1)

- Thanh phan môi trường: glucose 50 g, pepton 10 g, agar 20 g, KH»PO, 3 g,nước cất vừa đủ 1000 ml

- Hòa tan các thành phần môi trường vảo erlen, định mức nước cất vừa đủ 1000

ml.

- Cho vào bề điều nhiệt ở 80°C cho đến khi môi trường trong suốt (khoảng 1h).- Hấp tiệt trùng môi trường ở 121°C trong vòng 15 — 20 phút Đỗ môi trường

vào các đĩa petri đã được tiệt trùng.

- Sau khi môi trường đông đặc, úp ngược các đĩa petri, gói kín bằng giấy.- Cho các đĩa petri vào tủ 4m, ủ ở nhiệt độ phòng trong khoảng | tuần.- Để làm các ông thạch nghiêng: phân bố môi trường vào các ống nghiệm,

khoảng 1/4 chiều cao ông nghiệm Hap tiệt trùng ống nghiệm có môi trường ở121°C trong vòng 15 — 20 phút Sau đó đặt nghiêng các ống thạch Các ốngthạch nghiêng sau khi đông đặc được cho vào tủ ấm, ủ ở nhiệt độ phòng trongkhoảng | tuân

- Kiếm tra các đĩa petri, các ông thạch nghiêng sau khi ủ Tiệt trùng bỏ các đĩapetri, ống thạch nghiêng bị nhiễm vi sinh vật, chỉ sử dụng các đĩa petri, Ống

thạch nghiêng không bị nhiễm

3.5.2 Môi trường Hansen long (MT2)

- Thành phan môi trường: giống môi trường MT1 nhưng không có agar.- Hòa tan các thành phan môi trường vào erlen, định mức nước cất vừa đủ 1000

ml.

- Cho vào bề điều nhiệt ở 80°C khoảng 15 phút.- Phân bố 10 ml môi trường vào các ống nghiệm.- Pay kín băng nút bông không thâm nước.- Hấp tiệt trùng ống môi trường ở 121°C trong vòng 15 — 20 phút

3.5.3 Môi trường nhân giống (MT3)- Thành phan môi trường: cao nam men 1 g, glucose 50 g, pepton 10 g, KH»PO,

3 g, nước cất vừa đủ 1000 ml.- Chuẩn bị các ống môi trường tương tự như môi trường MT2

20