Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu sự biểu hiện oxa B-lactamase ở Acinetobacter baumannii

baumannii có mức đề kháng rất cao, hơn 80% với hầu hết các loại kháng sinh trong bệnh viện [3,4].. Tiếp nối công trình trên, đề tài của chúng tôi sẽ đi sâu vào việc tìm hiểu những nhóm

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

VẬT LIỆU

Bảng 3.1: Danh sách thiết bị máy móc

Máy real-time PCR iQ2 (Bio-Rad) Máy đo pH

Máy PCR (Bio-Rad) Tủ cấy

Máy ly tâm (Hermle) Tủ ủ

Máy nanodrop (Implen) Ống nghiệm

Máy lắc Eppendorf, đầu týp, pipet…

Máy đo độ đục (Den-1)

Bảng 3.2: Danh sách hóa chất sử dụng

Kit tách chiết RNA (kt-biotech) Bacto - trypton RQ1 RNase-free DNase (Promega) Bacto - yeast extract RQ1 RNase-free DNase Buffer (Promega) NaCl

Hỗn hợp phản ứng phiên mã ngƣợc (kt-biotech) Kháng sinh: Oxacillin, Penicillin G,

Meropenem (Sigma Aldrich) Hỗn hợp phản ứng real-time PCR (kt-biotech) Kit tách chiết DNA (kt-biotech)

Môi trường nuôi cấy Acinetobacter spp (LB): Trong 1 lit nước đã khử ion có

Bacto-trypton (10,0g), Bacto-yeast extract (5,0g), NaCl (10,0g), pH cuối = 7,0 ± 0,2

Môi trường giữ chủng Acinetobacter spp.: Giữ trong glycerol 30% Cách thực hiện: 0,5ml glycerol trong ống 1,5ml đã đƣợc khử trùng ƣớt (121 0 C trong 20 phút)

Thêm vào 0,5ml sinh khối tế bào vi khuẩn đã tăng sinh trong môi trường LB sau 24h ở 37 0 C Lắc đều, ghi tên chủng, ngày lưu mẫu và giữ ở -80 0 C

Mẫu lâm sàng đƣợc thu tại bệnh viện Đại học Y dƣợc Tp HCM, Bệnh viện Đa Khoa Đồng Nai và Bệnh viện Thống Nhất Đồng Nai từ tháng 6/2013 đến tháng 2/2014 Mẫu được phân lập từ các mẫu máu, đàm, mủ vết thương, dịch vết mổ… và đƣợc định danh là Acinetobacter baumannii

Chủng chuẩn sử dụng: Acinetobacter baumannii ATCC 19606

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2.1 Phương pháp thu thập mẫu lâm sàng

Mẫu lâm sàng được phân lập từ các mẫu máu, đàm, mủ vết thương, dịch vết mổ…, đƣợc định danh Acinetobacter baumannii bằng máy định danh tự động Phoenix tại Bệnh viện Đa Khoa Đồng Nai, Bệnh viện Thống Nhất Đồng Nai và phân lập theo phương pháp API tại bệnh viện Đại học Y dược Tp HCM

Mẫu sau khi phõn lập sẽ được tăng sinh trong mụi trường LB Dựng 200àl dịch sau tăng sinh tách chiết thu DNA bằng phương pháp tách chiết cột Phần còn lại đƣợc bảo quản trong glycerol 30% ở -80 0 C

3.2.2 Phương pháp tách chiết cột thu DNA

Sử dụng bộ kit tách chiết DNA theo phương pháp tách chiết cột Bộ kit tách

19 chiết DNA gồm các dung dịch: dung dịch LB (lysis buffer), proteinase K, dung dịch DS, dung dịch WB1, dung dịch WB2, dung dịch DEPC

LB (lysis buffer) dùng ly giải màng tế bào vi khuẩn, proteinase K có tác dụng phá hủy protein

DS đƣợc dùng nhằm tăng khả năng gắn kết giữa DNA và màng lọc của cột

WB1, WB2 dùng rửa cột, nhằm loại bỏ tất cả các chất bẩn có thể hiện diện

Qui trình thực hiện kit tách chiết cột thu DNA: (Xem Phụ Lục 1.2)

Qui trình này đƣợc sử dụng để tách chiết thu DNA phục vụ cho giai đoạn xác định nhóm gen bla OXA bằng phương pháp monoplex real-time PCR sử dụng mẫu dò Taq-Man

Hình 3.1: Quá trình tách chiết DNA

3.2.3 Phương pháp monoplex real-time PCR sử dụng mẫu dò Taq-Man

Nguyên tắc: Dựa vào tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu là Taq-Man (còn gọi là thử nghiệm 5’ nuclease) Mẫu dò đƣợc đánh dấu đầu 5’ bằng nhóm phát

20 huỳnh quang (reporter dye) và đầu 3’ bằng nhóm dập tắt huỳnh quang (quencher dye) Nhóm dập sẽ ngăn sự phát huỳnh quang của nhóm phát khi mẫu dò ở trạng thái nguyên vẹn Trong quá trình tổng hợp mạch mới, hoạt tính 5’ exonuclease của

Taq polymerase sẽ cắt rời nhóm phát khỏi mẫu dò, khiến nó không còn chịu tác động của nhóm dập Lúc đó nhóm phát sẽ phát tín hiệu huỳnh quang và đƣợc ghi nhận

Qui trình real-time PCR phát hiện các nhóm gen bla OXA của A baumannii được xây dựng từ các bước cơ bản như (1) chọn lựa và thiết kế mồi/mẫu dò đặc hiệu cũng nhƣ mồi/mẫu dò chứng nội cho phản ứng real-time PCR; (2) tối ƣu hóa điều kiện phản ứng real-time PCR với các điều kiện nồng độ của mồi tối ƣu, nhiệt độ lai; (3) Phân tích các nhóm gen bla OXA bằng qui trình vừa xây dựng

Mồi/mẫu dò đƣợc thiết kế dựa trên thông tin về các trình tự gen bla OXA đƣợc công bố trên ngân hàng gen NCBI, bằng các phần mềm AlleleID 7.0 Phần mềm ClustalX đƣợc dùng để kiểm tra tính bảo tồn của các týp gen bla OXA Tính đặc hiệu của các mồi đã thiết kế đƣợc kiểm tra bằng phần mềm Annhyb 4.9 và Primer- BLAST (NCBI)

Hình 3.2: Phương pháp real-time PCR với mẫu dò Taq-Man

Hình 3.3: Thành phần phản ứng real-time PCR Hình 3.4: Máy real-time PCR iQ2 Để có thể thực hiện đƣợc phản ứng real-time PCR cần phải có máy real-time PCR Máy này cũng có một buồng ủ nhiệt chạy được chương trình luân nhiệt như máy PCR bình thường, đồng thời có thêm một thiết bị được gọi là thiết bị real-time Đây là một thiết bị quang học có hai chức năng: (1) Có các nguồn sáng phát ra đƣợc các tia sáng kích thích có bước sóng xác định lên các ống phản ứng real-time PCR;

(2) Có đƣợc camera hay cảm biến quang ghi nhận đƣợc ánh sáng huỳnh quang phát ra từ các ống phản ứng real-time PCR khi các ống phản ứng này đƣợc chiếu các tia sáng kích thích Tùy theo hãng và model sản xuất mà có nhiều kiểu thiết bị real- time khác nhau Các kiểu thiết bị này khác nhau về cách phát ra nguồn sáng kích thích và cách ghi nhận đƣợc ánh sáng huỳnh quang đƣợc phát ra từ các ống phản ứng

Hình 3.5: Biểu đồ kết quả nhân bản

22 Phương pháp này được ứng dụng để phân định nhóm gen bla OXA từ những mẫu lâm sàng

Mẫu sau khi thu về sẽ được tăng sinh trong mụi trường LB Dựng 200àl dịch sau tăng sinh tách chiết thu DNA bằng phương pháp tách chiết cột DNA thu được sau tách chiết tiến hành monoplex Taq-Man real-time PCR để phân định nhóm gen blaOXA Qui trình monoplex Taq-Man real-time PCR đƣợc xây dựng với các cặp mồi/mẫu dò đặc trưng tương ứng cho các loại bla OXA-23, bla OXA-24, bla OXA-51, blaOXA-58 và chứng nội (IC) Chứng nội đƣợc thiết kế trên gen 16S rRNA của A baumannii Quá trình này đƣợc ứng dụng từ công trình nghiên cứu đã đƣợc tiến hành tại công ty TNHH CNSH Khoa Thương

Bảng 3.3: Thành phần phản ứng monoplex Taq-Man real-time PCR

Thành phần Nồng độ ban đầu Nồng độ làm việc Thể tích/1 phản ứng

Hỗn hợp phản ứng 5X 1,5X 7,5àl

Mồi bla OXA F/R 25àM 0,2àM 0,2àl

Mẫu dũ bla OXA 10 àM 0,1 àM 0,25àl

Lưu ý: Ứng với mỗi phản ứng của từng loại bla OXA, mồi bla OXA F/R và mẫu dò bla OXA được thay thế tương ứng: mồi bla OXA-23 F/R/mẫu dò bla OXA-23; mồi bla OXA-24 F/R /mẫu dò bla OXA-24; mồi bla OXA-51 F/R/mẫu dò bla OXA-51; mồi bla OXA-58 F/R/mẫu dò bla OXA-58

Chương trình real-time PCR cho phản ứng monoplex Taq-Man real-time PCR

40 chu kỳ: 95 o C – 10 giây 60 o C – 15 giây (Đọc tín hiệu)

3.2.4 Phương pháp tách chiết tủa thu RNA

Sử dụng bộ kit tách chiết RNA theo phương pháp tách chiết tủa Bộ kit tách chiết RNA gồm năm dung dịch nhƣ sau:

23 Dung dịch 1: thành phần chính là phenol (pH 4), là chất gây biến tính protein cực mạnh nhƣng không hòa tan nucleic acid

Dung dịch 2: chloroform (là chất biến tính protein nhẹ, có trọng lƣợng nặng hơn nước, sau khi ly tâm sẽ phân tách thành 2 pha: pha chloroform nằm dưới và pha nước nằm trên) được dùng để tách protein và polysaccharides ra khỏi nucleic acid, tạo phức hợp với protein và polysaccharides, đi kèm với phenol để tách phenol và tất cả các thành phần còn lại ra khỏi pha nước có chứa DNA

Dung dịch 3: bao gồm isopropanol (1 thể tích isopropanol/1 thể tích dung dịch cần tủa) có tác dụng tủa RNA và chất trợ tủa có tác dụng tạo màu tủa

Dung dịch 4: etanol 70% có tác dụng rửa tủa RNA

Dung dịch 5: DEPC có tác dụng hòa tan tủa

Qui trình thực hiện kit tách chiết tủa thu RNA: (Xem Phụ Lục 1.1)

Qui trình này đƣợc sử dụng để tách chiết thu RNA phục vụ cho giai đoạn khảo sát biểu hiện nhóm gen bla OXA bằng phương pháp duplex real-time RT-PCR sử dụng mẫu dò Taq-Man

Hình 3.6: Quá trình tách chiết RNA

3.2.5 Phương pháp xử lý RNA sau tách chiết bằng enzyme DNase

Nhằm loại bỏ hoàn toàn DNA còn sót lại trong quá trình tách chiết thu RNA, chúng tôi tiến hành xử lý RNA sau tách chiết bằng enzyme DNase

Sử dụng 100μl mẫu tế bào vi khuẩn A.baumannii ATCC 19606 tiến hành tách chiết tủa và thu 50μl RNA Dùng 10μl RNA sau tách chiết tiến hành 2 phản ứng xử lý DNase Ủ với enzyme DNase ở 37 0 C trong 60 phút Sau đó, bổ sung 1μl DNase Stop Solution, ủ 65 0 C trong 10 phút

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

KẾT QUẢ THU THẬP MẪU LÂM SÀNG A baumannii VÀ PHÂN NHÓM CÁC LOẠI bla OXA

NHÓM CÁC LOẠI bla OXA

Mẫu lâm sàng đƣợc thu tại bệnh viện Đại học Y dƣợc Tp HCM, Bệnh viện Đa Khoa Đồng Nai và Bệnh viện Thống Nhất Đồng Nai từ tháng 6/2013 đến tháng 2/2014 Mẫu được phân lập từ các mẫu máu, đàm, mủ vết thương, dịch vết mổ…, đƣợc định danh A baumannii bằng máy định danh tự động Phoenix tại Bệnh viện Đa Khoa Đồng Nai, Bệnh viện Thống Nhất Đồng Nai và phân lập theo phương pháp API tại bệnh viện Đại học Y dƣợc Tp HCM

4.1.1 Bệnh viện Đại Học Y Dƣợc Tp Hồ Chí Minh

65 mẫu thu từ bệnh viện Đại Học Y Dƣợc Tp HCM đƣợc tiến hành tăng sinh, tách chiết DNA và chạy phản ứng monoplex Taq-Man real-time PCR (đã đƣợc tối ưu từ nghiên cứu trước) Thống kê tỷ lệ xuất hiện của các loại gen bla OXA-23, blaOXA-24, bla OXA-51, bla OXA-58 Kết quả thống kê được thể hiện dưới bảng 4.1

Bảng 4.1: Kết quả phân nhóm gen bla OXA với mẫu thu tại BVĐH Y Dược Tp.HCM

Gen Tần số (mẫu) Tỷ lệ (%)

(+) (-) (+) (-) bla OXA-23 45 63 41,7 58,3 bla OXA-24 0 108 0 100 bla OXA-51 49 59 45,4 54,6 bla OXA-58 8 100 7,4 92,6 Đồ thị 4.1: Kết quả phân nhóm gen bla OXA với mẫu thu tại BVĐH Y Dược Tp HCM

Theo kết quả thống kê tỷ lệ xuất hiện các loại gen bla OXA-23, bla OXA-24, blaOXA-51, bla OXA-58 ta nhận thấy nhóm gen bla OXA-23, bla OXA-51 có tần số lặp lại khá cao tương ứng 41,7%, 45,4%, trong khi đó nhóm gen bla OXA-58 chỉ chiếm 7,4% và không có mẫu nào chứa nhóm gen bla OXA-24 Tuy nhiên, mỗi chủng A baumannii không chỉ mang một gen bla OXA mà chúng có thể mang 1, 2, thậm chí có thể 3 đến 4 gen bla OXA, vì thế, chúng tôi tiếp tục thống kê tỷ lệ các nhóm gen

33 hoặc tổ hợp gen bla OXA của các chủng A baumannii Kết quả phân nhóm gen/tổ hợp gen được thể hiện dưới bảng 4.2

Bảng 4.2: Kết quả phân nhóm/tổ hợp nhóm gen bla OXA với mẫu thu tại BVĐH Y dược

Gen/tổ hợp gen Tần số (Mẫu) Tỷ lệ (%) bla OXA-23 2 3,1 bla OXA-51 6 9,2 bla OXA-58 4 6,2 bla OXA-23 và bla OXA-51 40 61,5 bla OXA-23 và bla OXA-58 1 1,5 bla OXA-51 và bla OXA58 1 1,5 bla OXA-23, bla OXA-51 và bla OXA-58 2 3,1

(-) 9 13,8 Đồ thị 4.2: Kết quả phân nhóm/tổ hợp nhóm gen bla OXA với mẫu thu tại BVĐH Y Dược

Theo kết quả phân nhóm gen ta thấy xuất hiện nhiều nhóm gen/tổ hợp nhóm gen tồn tại trong các chủng A baumannii Tuy nhiên, tổ hợp nhóm gen bla OXA-

Loại /tổ hợp nhóm gen bla OXA

34 23,51 chiếm tỷ lệ cao nhất 61,5%, các nhóm gen/tổ hợp nhóm gen khác xuất hiện khá thấp hoặc không đáng kể

Từ những thông tin thu thập đƣợc về các chủng A baumannii mang các loại gen bla OXA tại BVĐH Y Dƣợc Tp HCM, chúng tôi cũng tiến hành thống kê nguồn gốc phân lập mẫu và tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng này

Kết quả phân loại nguồn gốc mẫu được thể hiện dưới bảng 4.3

Bảng 4.3: Kết quả phân loại nguồn gốc mẫu phân lập thu tại BVĐH Y Dược Tp HCM

Loại mẫu Tần số (mẫu) Tỷ lệ (%)

Nước tiểu 5 7,7 Đồ thị 4.3: Kết quả phân loại nguồn gốc mẫu phân lập thu tại BVĐH Y Dược Tp HCM

Kết quả kháng sinh đồ của các mẫu phân lập được thể hiện dưới bảng 4.4

Máu Đàm Dịch vết mổ Mủ Nước tiểu

Nguồn gốc mẫu phân lập

Bảng 4.4: Kết quả kháng sinh đồ mẫu phân lập thu tại BVĐH Y Dược Tp HCM

Kháng sinh Tần số (Mẫu) Tỉ lệ (%)

S(Sensitive): Nhạy cảm, I (Intermediate): Trung gian, R(Resistant): Kháng Đồ thị 4.4: Kết quả kháng sinh đồ mẫu phân lập thu tại BVĐH Y Dược Tp HCM

36 Theo kết quả thu đƣợc ta thấy A baumannii đa số đƣợc phân lập từ mẫu đàm chiếm 60%, chứng tỏ A baumannii tồn tại chủ yếu ở các khu vực điều trị hô hấp, viêm phổi… Đồng thời, tỷ lệ kháng đối với các kháng sinh của A baumannii lên đến 55-81%

Nhƣ vậy, với kết quả phân tích từ các chủng A baumannii thu tại bệnh viện Đại Học Y Dƣợc Tp HCM cho thấy tỷ lệ kháng kháng sinh trên chủng A baumannii tại đây là khá cao và tổ hợp nhóm gen bla OXA-23,51 là nhóm gen cần đƣợc chú ý

4.1.2 Bệnh viện Đa Khoa Đồng Nai

65 mẫu thu từ bệnh viện Đa Khoa Đồng Nai được tiến hành phân tích tương tự mẫu thu từ bệnh viện Đại Học Y Dƣợc Tp HCM Kết quả thống kê tỷ lệ xuất hiện của các loại gen bla OXA-23, bla OXA-24, bla OXA-51, bla OXA-58 được thể hiện dưới bảng 4.5

Bảng 4.5: Kết quả phân nhóm gen bla OXA với mẫu thu tại BVĐK Đồng Nai

Gen Tần số Tỷ lệ (%)

(+) (-) (+) (-) bla OXA-23 50 15 76,9 23,1 bla OXA-24 1 64 1,5 98,5 bla OXA-51 59 6 90,8 9,2 bla OXA-58 4 61 6,2 93,8

37 Đồ thị 4.5: Kết quả phân nhóm gen bla OXA với mẫu thu tại BVĐK Đồng Nai

Theo kết quả thống kê tỷ lệ xuất hiện các loại gen bla OXA-23, bla OXA-24, blaOXA-51, bla OXA-58 tại bệnh viện Đa Khoa Đồng Nai ta nhận thấy, nhóm gen blaOXA-23, bla OXA-51 có tần số lặp lại khá cao tương ứng 76,9%; 90,8%, trong khi đó nhóm gen bla OXA-58 chỉ chiếm 6,2% và nhóm gen bla OXA-24 thấp nhất với

Tiếp theo, chúng tôi thống kê tỷ lệ các nhóm gen hoặc tổ hợp gen bla OXA của các chủng A baumannii Kết quả phân nhóm gen/tổ hợp gen được thể hiện dưới bảng 4.6

Bảng 4.6: Kết quả phân nhóm/tổ hợp nhóm gen bla OXA với mẫu tại BVĐK Đồng Nai

Gen/tổ hợp gen Tần số Tỷ lệ (%) bla OXA-24 1 1,5 bla OXA-51 7 10,8 bla OXA-58 2 3,1 bla OXA-23 và bla OXA-51 50 76,9 bla OXA-51 và bla OXA58 2 3,1

38 Đồ thị 4.6: Kết quả phân nhóm/tổ hợp nhóm gen bla OXA với mẫu tại BVĐK Đồng Nai

Theo kết quả phân nhóm gen ta thấy xuất hiện nhiều nhóm gen/tổ hợp nhóm gen tồn tại trong các chủng A baumannii Tuy nhiên, tổ hợp nhóm gen bla OXA- 23,51 chiếm tỷ lệ cao nhất 76,9%, các nhóm gen/tổ hợp nhóm gen khác xuất hiện khá thấp hoặc không đáng kể

Từ những thông tin thu thập đƣợc về các chủng A baumannii mang các loại gen bla OXA tại bệnh viện Đa Khoa Đồng Nai, chúng tôi cũng tiến hành thống kê nguồn gốc phân lập mẫu và tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng này

Kết quả phân loại nguồn gốc mẫu phân lập được thể hiện dưới bảng 4.7

Bảng 4.7: Kết quả phân loại nguồn gốc mẫu phân lập thu tại BVĐK Đồng Nai

Loại mẫu Tần số Tỷ lệ (%)

OXA-24 OXA-51 OXA-58 OXA-23,51 OXA-51,58 (-)

Loại /tổ hợp nhóm gen bla OXA

39 Đồ thị 4.7: Kết quả phân loại nguồn gốc mẫu phân lập thu tại BVĐK Đồng Nai

Kết quả kháng sinh đồ của các mẫu phân lập được thể hiện dưới bảng 4.8

Bảng 4.8: Kết quả kháng sinh đồ mẫu phân lập thu tại BVĐK Đồng Nai

Kháng sinh Tần số Tỉ lệ (%)

S(Sensitive): Nhạy cảm, I (Intermediate): Trung gian, R(Resistant): Kháng

Máu Đàm Dịch vết mổ Mủ

Nguồn gốc mẫu phân lập

40 Đồ thị 4.8: Kết quả kháng sinh đồ mẫu phân lập thu tại BVĐK Đồng Nai

Theo kết quả thu đƣợc ta thấy A baumannii thu tại BVĐK Đồng Nai cũng đƣợc phân lập chủ yếu từ mẫu đàm chiếm 71,2%, chứng tỏ tại BVĐK Đồng Nai, A baumannii cũng tồn tại chủ yếu ở các khu vực điều trị hô hấp, viêm phổi… Đồng thời, tỷ lệ kháng đối với các kháng sinh của A baumannii lên đến 66-82%

Nhƣ vậy, với kết quả phân tích từ các chủng A baumannii thu tại BVĐK Đồng Nai cho thấy tỷ lệ kháng kháng sinh trên chủng A baumannii tại đây cũng khá cao và tổ hợp nhóm gen bla OXA-23,51 cũng là nhóm gen cần đƣợc chú ý

4.1.3 Bệnh viện Thống Nhất Đồng Nai

XÂY DỰNG QUI TRÌNH DUPLEX TAQ-MAN REAL-TIME RT-PCR 43 1 Thử nghiệm hiệu quả phản ứng duplex Taq-Man real-time PCR

Trước tiên, chúng tôi tiến hành xây dựng qui trình duplex Taq-Man real-time PCR trên DNA tách chiết từ chủng A baumannii Sau đó, qui trình này sẽ đƣợc áp dụng trên cDNA (phiên mã ngƣợc từ RNA tách chiết từ chủng A baumannii) và chứng minh hiệu quả của phản ứng duplex Taq-Man real-time RT-PCR

Qui trình duplex Taq-Man real-time PCR đƣợc kết hợp từ các qui trình monoplex Taq-Man real-time PCR Ban đầu, chúng tôi sẽ thử nghiệm hiệu quả phản ứng duplex khi kết hợp hai phản ứng monoplex, nếu kết quả thử nghiệm không đạt yêu cầu, chúng tôi sẽ tiến hành tối ƣu các thành phần phản ứng để đảm bảo phản

44 ứng duplex không có sự cạnh tranh, ức chế giữa các mồi, mẫu dò và đạt hiệu quả tốt nhất

4.2.1 Thử nghiệm hiệu quả phản ứng duplex Taq-Man real-time PCR

4.2.1.1 Thử nghiệm hiệu quả phản ứng duplex với bla OXA-51 và IC

Tiến hành thử nghiệm hiệu quả phản ứng duplex Taq-Man real-time PCR với blaOXA-51 và IC từ các phản ứng monoplex Taq-Man real-time PCR với thành phần phản ứng thể hiện dưới bảng 4.11

Bảng 4.11: Thành phần phản ứng duplex Taq-Man real-time PCR với bla OXA-51 và IC

Nồng độ ban đầu Nồng độ làm việc Thể tích/phản ứng

Hỗn hợp Apta Taq 5X 1,5X 7,5àl

Mồi IC-F/R 25àM 0,2àM 0,2àl

Mẫu dũ IC 10àM 0,1àM 0,25àl

Mồi OXA-51-F/R 25àM 0,2àM 0,2àl

Mẫu dũ OXA-51 10àM 0,1àM 0,25àl

Kết quả thử nghiệm hiệu quả phản ứng duplex Taq-Man real-time PCR với blaOXA-51 và IC được thể hiện dưới bảng 4.12, 4.13

Bảng 4.12: Kết quả thử nghiệm hiệu quả phản ứng đối với bla OXA-51 và IC

(bản sao/àl) Thử nghiệm hiệu quả

Trong cùng một cột, các số mang cùng một chữ cái thì khác biệt không có ý nghĩa ở độ tin cậy 95% (P > 0.05) (số liệu chi tiết xem ở bảng 2.1 phụ lục 2)

Bảng 4.13: Thông số phản ứng thử nghiệm hiệu quả đối với bla OXA-51 và IC

Nhận xét: Để phản ứng real-time PCR đạt hiệu quả đòi hỏi các thông số slope

(độ dốc) gần với giá trị 3,32; R 2 (hệ số tương quan) ≥ 0,99; E (hiệu quả PCR) = 90- 105% Theo kết quả thu nhận đƣợc ta thấy kết quả mẫu (FAM) chƣa đạt với thông số slope = 2,982 và E = 116,4% Kết quả IC (HEX) đạt với E = 99,8% Nhƣ vậy, để nâng cao hiệu quả phản ứng cũng nhƣ sự ổn định theo các nồng độ pha loãng, chúng tôi tiếp tục thực hiện các thí nghiệm tối ƣu thành phần mồi, mẫu dò và nồng độ hỗn hợp Apta Taq sử dụng cho phản ứng duplex (nhiệt độ lai của bla OXA-51 và IC ở phản ứng monoplex tương đồng nên chúng tôi bỏ qua giai đoạn tối ưu nhiệt độ lai phản ứng)

4.2.1.2 Thử nghiệm hiệu quả phản ứng duplex với bla OXA-23 và IC

Tiến hành tương tự qui trình thử nghiệm hiệu quả phản ứng duplex Taq-Man real-time PCR với bla OXA-51 và IC Kết quả thu được thể hiện dưới bảng 4.14,

Bảng 4.14: Kết quả thử nghiệm phản ứng đối với bla OXA-23 và IC

Nồng độ DNA (bản sao/àl)

Trong cùng một cột, các số mang cùng một chữ cái thì khác biệt không có ý nghĩa ở độ tin cậy 95% (P > 0.05) (số liệu chi tiết xem ở bảng 2.8 phụ lục 2)

Bảng 4.15: Thông số phản ứng thử nghiệm hiệu quả đối với bla OXA-23 và IC

Nhận xét: Để phản ứng real-time PCR đạt hiệu quả đòi hỏi các thông số slope

(độ dốc) gần với giá trị 3,32; R 2 (hệ số tương quan) ≥ 0,99; E (hiệu quả PCR) = 90- 105% Theo kết quả thu nhận đƣợc ta thấy kết quả mẫu (FAM) và IC (HEX) đều đạt với các thông số slope = 3,32; E = 100,1% và R 2 = 1 Đồng thời, giá trị Ct giữa mẫu và IC tương đương nhau và ổn định với các nồng độ pha loãng

Như vậy, với kết quả này, giá trị Ct của mẫu và IC tương đương nhau và hiệu quả phản ứng đạt các thông số chuẩn Do đó, chúng tôi không tối ƣu thành phần mồi, mẫu dò, nồng độ hỗn hợp phản ứng và sử dụng nghiệm thức này cho các thí nghiệm tiếp theo, tức nồng độ làm việc của mẫu với mồi và mẫu dò tương ứng 0,2àM và 0,1àM, nồng độ hỗn hợp phản ứng là 1,5X

4.2.2 Tối ƣu phản ứng duplex Taq-Man real-time PCR với bla OXA-51 và IC

4.2.2.1 Tối ưu thành phần mồi, mẫu dò Tiến hành thí nghiệm với việc thay đổi các thông số:

- Nồng độ mồi bla OXA-51-F/R: 0,2; 0,3; 0,4 àM - Nồng độ mẫu dũ bla OXA-51: 0,1; 0,15; 0,2 àM - DEPC: thay đổi cho phù hợp tổng thể tích một phản ứng 20μl

Thành phần các nghiệm thức được thể hiện chi tiết dưới bảng 4.16, 4.17, 4.18

Bảng 4.16: Nghiệm thức 1 tối ưu thành phần mồi, mẫu dò đối với bla OXA-51 và IC

Nghiệm thức 1 Nồng độ ban đầu Nồng độ làm việc Thể tích/phản ứng

Hỗn hợp Apta Taq 5X 1,5X 7,5àl

Mồi IC-F/R 25àM 0,2àM 0,2àl

Mẫu dũ IC 10àM 0,1àM 0,25àl

Mồi OXA-51-F/R 25àM 0,2àM 0,2àl

Mẫu dũ OXA-51 10àM 0,1àM 0,25àl

Bảng 4.17: Nghiệm thức 2 tối ưu thành phần mồi, mẫu dò đối với bla OXA-51 và IC

Nghiệm thức 2 Nồng độ ban đầu Nồng độ làm việc Thể tích/phản ứng

Hỗn hợp Apta Taq 5X 1,5X 7,5àl

Mồi IC-F/R 25àM 0,2àM 0,2àl

Mẫu dũ IC 10àM 0,1àM 0,25àl

Mồi OXA-51-F/R 25àM 0,3àM 0,3àl

Mẫu dũ OXA-51 10àM 0,15àM 0,375àl

Bảng 4.18: Nghiệm thức 3 tối ưu thành phần mồi, mẫu dò đối với bla OXA-51 và IC

Nghiệm thức 3 Nồng độ ban đầu Nồng độ làm việc Thể tích/phản ứng

Hỗn hợp Apta Taq 5X 1,5X 7,5àl

Mồi IC-F/R 25àM 0,2àM 0,2àl

Mẫu dũ IC 10àM 0,1àM 0,25àl

Mồi OXA-51-F/R 25àM 0,4àM 0,4àl

Mẫu dũ OXA-51 10àM 0,2àM 0,5àl

Kết quả các nghiệm thức được thể hiện dưới bảng 4.19, 4.20

Bảng 4.19: Kết quả tối ưu thành phần mồi, mẫu dò đối với bla OXA-51 và IC

Nồng độ DNA (bản sao/àl)

Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3

Số liệu chi tiết xem ở bảng 2.2, 2.3, 2.4 phụ lục 2.

Bảng 4.20: Thông số phản ứng tối ưu thành phần mồi, mẫu dò đối với bla OXA-51 và IC

Nhận xét: Để phản ứng real-time PCR đạt hiệu quả đòi hỏi các thông số slope

(độ dốc) gần với giá trị 3,32; R 2 (hệ số tương quan) ≥ 0,99; E (hiệu quả PCR) = 90- 105% Theo kết quả thu nhận đƣợc: Đối với nghiệm thức 1: kết quả mẫu (FAM) chƣa đạt với thông số slope 2,982 và E = 116,4% Kết quả IC (HEX) đạt với E = 99,8% Đối với nghiệm thức 2: Kết quả IC (HEX) đạt với các thông số slope = 3,32; E

= 100,1% và R 2 = 1 Kết quả mẫu (FAM) tương đối tốt với các thông số slope 3,33; E = 99,7% và R 2 = 1 Đối với nghiệm thức 3: Kết quả IC và mẫu đều đạt với các thông số slope 3,32; E = 100,1%, R 2 = 1

Nhƣ vậy, với kết quả trên, ta có thể chọn nghiệm thức 2 hoặc 3 đều đạt hiệu quả tốt và ổn định khi pha loãng theo các nồng độ Tuy nhiên, đối với kết quả nghiệm thức 3 ta thấy giá trị Ct của mẫu và IC tương đương nhau và hiệu quả phản ứng cũng đạt giá trị tốt hơn Do đó, chúng tôi chọn nghiệm thức 3, tức nồng độ làm việc mồi, mẫu dũ của bla OXA-51 tương ứng 0,4àM và 0,2àM

4.2.2.2 Kết quả tối ưu nồng độ hỗn hợp Apta Taq

Từ kết quả thí nghiệm tối ƣu nồng độ mồi, mẫu dò, chúng tôi chọn và cố định nồng độ làm việc mồi, mẫu dò của bla OXA-51 trong phản ứng duplex tương ứng 0,4àM và 0,2àM, nồng độ làm việc mồi, mẫu dũ của IC tương ứng 0,2àM và 0,1àM Tiến hành thớ nghiệm với cỏc nghiệm thức thay đổi nồng độ hỗn hợp Apta Taq tương ứng với các thông số:

49 - Nồng độ làm việc hỗn hợp Apta Taq: 1,5; 2,0; 2,5X - DEPC: thay đổi cho phù hợp tổng thể tích một phản ứng 20μl

Kết quả các nghiệm thức được thể hiện dưới bảng 4.21, 4.22

Bảng 4.21: Kết quả tối ưu nồng độ hỗn hợp phản ứng đối với bla OXA-51 và IC

Nồng độ DNA (bản sao/àl)

Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3

Số liệu chi tiết xem ở bảng 2.5, 2.6, 2.7 phụ lục 2

Bảng 4.22: Thông số phản ứng tối ưu nồng độ hỗn hợp phản ứng đối với bla OXA-51 và

Nhận xét: Để phản ứng real-time PCR đạt hiệu quả đòi hỏi các thông số slope

(độ dốc) gần với giá trị 3,32; R 2 (hệ số tương quan) ≥ 0,99, E (hiệu quả PCR) = 90- 105% Theo kết quả thu nhận đƣợc:

Giá trị Ct của các nghiệm thức tương đương nhau, không biến động nhiều

Hiệu quả phản ứng của nghiệm thức 1 và 2 (E = 100%) tốt hơn so với nghiệm thức

Nhƣ vậy, với kết quả trên, ta có thể chọn nghiệm thức 1 hoặc 2 đều đạt hiệu quả tốt và ổn định khi pha loãng theo các nồng độ Tuy nhiên, nhằm đạt hiệu quả kinh tế tốt nhất, chúng tôi chọn nghiệm thức 1, tức nồng độ làm việc hỗn hợp phản ứng của bla OXA-51 tương ứng 1,5X

Tóm lại, phản ứng duplex Taq-Man real-time PCR sử dụng với các thành phần: Nồng độ mồi và mẫu dũ của mẫu tương ứng: 0,4àM và 0,2àM (đối với gen blaOXA-51); 0,2àM và 0,1àM (đối với gen bla OXA-23) Nồng độ mồi và mẫu dũ của IC tương ứng: 0,2àM và 0,1àM Nồng độ hỗn hợp phản ứng: 1,5X

Sau khi tối ƣu qui trình duplex Taq-Man real-time PCR, chúng tôi áp dụng qui trình này trên cDNA (phiên mã ngƣợc từ RNA sau tách chiết) Tuy nhiên, RNA sau tách chiết phải đảm bảo loại bỏ hoàn toàn DNA còn sót lại, do đó, chúng tôi cần tiến hành tối ƣu qui trình xử lý RNA sau tách chiết

4.2.3 Khảo sát lƣợng enzyme DNase sử dụng

Tiến hành thí nghiệm xác định lƣợng enzyme DNase sử dụng phù hợp nhằm phân hủy hoàn toàn lƣợng DNA còn sót lại trong quá trình tách chiết RNA Sử dụng 100μl mẫu tế bào vi khuẩn A baumannii ATCC 19606 tiến hành tách chiết tủa và thu 50μl RNA Dùng 10μl RNA sau tách chiết tiến hành 2 phản ứng xử lý DNase Ủ với enzyme DNase ở 37 0 C trong 60 phút, sau đó, bổ sung 1μl DNase Stop Solution, ủ 65 0 C trong 10 phút

Thành phần một phản ứng xử lý RNA sau tách chiết:

Bảng 4.23: Thành phần một phản ứng xử lý RNA sau tách chiết

Thành phần Hàm lƣợng/phản ứng

RNase-free DNase 10X reaction buffer 1μl

Kết quả thu được thể hiện dưới bảng 4.24

Bảng 4.24: Kết quả khảo sát lượng enzyme DNase sử dụng

CẢM ỨNG BIỂU HIỆN TRÊN CHỦNG LÂM SÀNG

4.4.1 Chủng lâm sàng mang gen bla OXA-51

Tiến hành cảm ứng với khỏng sinh Penicillin G (4àg/ml) và Meropenem

(0,01àg/ml) trờn 5 chủng lõm sàng đƣợc chọn lọc từ cỏc chủng thu đƣợc tại cỏc bệnh viện, 5 chủng này chỉ mang gen bla OXA-51 và có kết quả kháng sinh đồ giống nhau

Kết quả thu được thể hiện dưới bảng 4.30

Bảng 4.30: Kết quả biểu hiện gen bla OXA-51 trên chủng lâm sàng mang gen bla OXA-51

Mẫu Ct mẫu Ct IC ∆Ct ∆∆Ct Biểu hiện

Trong cùng một cột của cùng một mẫu, các số mang cùng một chữ cái thì khác biệt không có ý nghĩa ở độ tin cậy 95% (P > 0,05).(số liệu chi tiết xem ở bảng 5.1 phụ lục 5) Đồ thị 4.17: Kết quả biểu hiện gen bla OXA-51 trên chủng lâm sàng mang gen bla OXA-51

Nhận xét : Dựa vào kết quả phân tích ANOVA ta nhận thấy, khi cảm ứng với kháng sinh Penicillin G và Meropenem trên 5 mẫu lâm sàng mang gen bla OXA-51, sự khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95% (P > 0,05) về giá trị ∆Ct trường hợp không cảm ứng và cảm ứng, đồng thời mức độ biểu hiện của gen bla OXA-51 ở tất cả 5 chủng đều thấp hơn so với trường hợp không cảm ứng

4.4.2 Chủng lâm sàng mang gen bla OXA-23,51

Tiến hành cảm ứng với khỏng sinh Penicillin G (4àg/ml) và Meropenem (0,01àg/ml) trờn 5 chủng lõm sàng đƣợc chọn lọc từ cỏc chủng thu đƣợc tại cỏc bệnh viện, 5 chủng này mang gen bla OXA-23,51 và có kết quả kháng sinh đồ giống nhau

4.4.2.1 Kết quả biểu hiện gen bla OXA-23 trên chủng lâm sàng mang gen bla OXA-23,51

Mức độ bi ểu hi ện

Không cảm ứngPenicillin GMeropenem

63 Kết quả thu được thể hiện dưới bảng 4.31

Bảng 4.31: Kết quả biểu hiện gen bla OXA-23 trên chủng lâm sàng mang gen bla OXA-23,51

Mẫu Ct mẫu Ct IC ∆Ct ∆∆Ct Biểu hiện

Trong cùng một cột của cùng một mẫu, các số mang cùng một chữ cái thì khác biệt không có ý nghĩa ở độ tin cậy 95% (P > 0,05).(số liệu chi tiết xem ở bảng 5.2 phụ lục 5)

64 Đồ thị 4.18: Kết quả biểu hiện gen bla OXA-23 trên chủng lâm sàng mang gen bla OXA

Nhận xét: Dựa vào kết quả phân tích ANOVA ta nhận thấy, khi cảm ứng với kháng sinh Penicillin G và Meropenem trên 5 mẫu lâm sàng mang gen bla OXA-

23,51, sự khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95% (P > 0,05) về giá trị ∆Ct trường hợp không cảm ứng và cảm ứng Mức độ biểu hiện của gen bla OXA-23 ở tất cả 5 mẫu đều cao hơn so với trường hợp không cảm ứng, tuy nhiên, sự biểu hiện là không giống nhau Ở mẫu 6, 7, mức độ biểu hiện của gen bla OXA-23 tương đối cao, từ 2,24-3,59 lần so với trường hợp không cảm ứng, trong khi đó, mẫu 8, 9, 10 lại có mức độ biểu hiện của gen bla OXA-23 tương đối thấp, từ 1,11-1,94 lần so với trường hợp không cảm ứng

4.4.2.2 Kết quả biểu hiện gen bla OXA-51 trên chủng lâm sàng mang gen bla OXA-23,51

Kết quả thu được thể hiện dưới bảng 4.32

Không cảm ứngPenicillin GMeropenem

Bảng 4.32: Kết quả biểu hiện gen bla OXA-51 trên chủng lâm sàng mang gen bla OXA-23,51

Mẫu Ct mẫu Ct IC ∆Ct ∆∆Ct Biểu hiện

Trong cùng một cột của cùng một mẫu, các số mang cùng một chữ cái thì khác biệt không có ý nghĩa ở độ tin cậy 95% (P > 0,05).(số liệu chi tiết xem ở bảng 5.3 phụ lục 5)

66 Đồ thị 4.19: Kết quả biểu hiện gen bla OXA-51 trên chủng lâm sàng mang gen bla OXA-

Nhận xét: Dựa vào kết quả phân tích ANOVA ta nhận thấy, khi cảm ứng với kháng sinh Penicillin G và Meropenem trên 5 mẫu lâm sàng mang gen bla OXA-

23,51, nhìn chung, sự khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95% (P > 0,05) về giá trị ∆Ct trường hợp không cảm ứng và cảm ứng Mức độ biểu hiện của gen bla OXA-51 ở tất cả 5 mẫu đều cao hơn so với trường hợp không cảm ứng, tuy nhiên, sự biểu hiện là không giống nhau Ở mẫu 6, 7, mức độ biểu hiện của gen bla OXA-51 tương đối cao, từ 2,24-3,80 lần so với trường hợp không cảm ứng, trong khi đó, mẫu 8, 9, 10 lại có mức độ biểu hiện của gen bla OXA-51 tương đối thấp, từ 1,13-2,04 lần so với trường hợp không cảm ứng

Tóm lại, theo kết quả kháng sinh đồ, các chủng lựa chọn đều kháng kháng sinh Meropenem, với kết quả khảo sát trên nhóm chủng lâm sàng ta thấy: Đối với 5 mẫu thuộc nhóm chủng chỉ mang gen bla OXA-51, khi sử dụng kháng sinh cảm ứng biểu hiện nhận thấy mức độ biểu hiện của chúng không đáng kể, thậm chí thấp hơn so với trường hợp không cảm ứng, điều đó chứng tỏ kháng sinh có ảnh hưởng đến sự biểu hiện gen bla OXA-51 và gen bla OXA-51 không phải là nhân tố chính ảnh hưởng đến tính kháng kháng sinh Penicillin G, Meropenem của nhóm chủng A baumanniii chỉ mang gen bla OXA-51 (trong phạm vi khảo sát) Đối với 5 mẫu thuộc nhóm chủng mang cả hai gen bla OXA-23 và bla OXA-51, khi sử dụng kháng sinh cảm ứng biểu hiện nhận thấy mức độ biểu hiện của chúng

Không cảm ứngPenicillin GMeropenem

67 không đồng đều, có chủng biểu hiện cao, có chủng biểu hiện thấp hoặc gần nhƣ không biểu hiện, điều đó chứng tỏ kháng sinh có ảnh hưởng đến sự biểu hiện blaOXA-23 và bla OXA-51, đồng thời, sự kết hợp của hai gen này có một sự ảnh hưởng nhất định đến tính kháng kháng sinh Penicillin G và Meropenem của nhóm chủng A baumanniii mang cả hai gen bla OXA-23, bla OXA-51 (trong phạm vi khảo sát) Tuy nhiên, mức độ ảnh hưởng như thế nào vẫn chưa thể khẳng định được

Theo một số nghiên cứu trên thế giới về chủng A baumanniii, các tác giả đã nhận định rằng, chủng mang gen bla OXA-51 bình thường biểu hiện khá yếu ớt, tuy nhiên, nếu đƣợc chèn chuỗi trình tự ISAba1 ở vùng thƣợng nguồn có thể làm tăng sự biểu hiện của chúng [6,33] Với nhận định này, chúng ta cũng có thể dự đoán, có khả năng những mẫu lâm sàng mang gen bla OXA-51 đƣợc khảo sát không có chuỗi trình tự ISAba1 chèn vào vùng thƣợng nguồn của gen nên mức độ biểu hiện của chúng không cao Tuy nhiên, vẫn chƣa thể đƣa ra một nhận định chắc chắn