NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Khảo sát hệ dung môi định tính cao bạch quả bằng phương pháp TLC - Phân lập và tinh chế isorhamnetin, kaempferol và quercetin có trong cao lá bạch quả - Khảo sát
KẾT QUẢ - BÀN LUẬN
Định danh dược liệu lá bạch quả
Lá bạch quả khô được ngâm mềm trong nước, sau đó được tiến hành cắt vi phẫu
Tiến hành nhuộm vi phẫu:
- Ngâm lát cắt vào dung dịch Javel từ (15 ÷ 30) phút (đến khi lát cắt trở nên trắng)
- Ngâm lát cắt vào dung dịch acid acetic (1 ÷ 3) % trong 2 phút để tẩy Javel còn sót
- Tiếp tục ngâm lát cắt vào dung dịch iod từ (5 ÷ 10) giây, rửa bằng nước cất
- Ngâm vào dung dịch son phèn khoảng (15 ÷ 30) phút
- Rửa bằng nước cất đến khi dung dịch rửa hết màu
Cố định bản mẫu trên phiến kính, tiến hành quan sát dưới kính hiển vi điện tử và ghi nhận kết quả như sau:
Hình II-1 Vi phẫu của lá bạch quả
Kết quả: quan sát vi phẫu cuống lá bạch quả, nhận thấy lớp biểu bì (1, 9) là những tế bào hình chữ nhật sắp xếp theo chiều dài của cuống phía ngoài cùng có tầng cutin Mảnh mô dày (2) nằm sát lớp biểu bì có nhiệm vụ nâng đỡ cho cuống lá Mô giậu (3) nằm phía o C dưới lớp biểu bì trên Mô mềm (6) gồm những tế bào có màng mỏng, xen kẽ có chứa khoang nội tiết (4) và tinh thể canxi oxalat (5) Các bó libe (7) nằm giữa gân lá, xung quanh có nhiều bó gỗ bao bọc (8).
Khảo sát khả năng phân lập các flavonoid trong cao lá bạch quả qua phương thức chiết- thủy phân một bước
2.2.1 Thủy phân không có sự hỗ trợ của vi sóng
Tiến hành sử dụng phương pháp chiết soxhlet cổ điển, kết hợp với thủy phân có hoàn lưu không có sự hỗ trợ của vi sóng
Giai đoạn 1: Chiết cao thô từ lá bạch quả khô
Từ 432 g bột lá bạch quả khô sau khi chiết với hỗn hợp EtOH: H2O và tách béo với n-hexane thu được 60,8 g cao thô (hiệu suất 14,07 %)
Cao thô thu được dạng keo sệt, màu nâu hổ phách, mùi đặc trưng
Giai đoạn 2: Phân lập và tinh chế các hợp chất flavonoid (3) (4) (5) có trong cao bạch quả
Từ 60,8 g cao thô sau khi thủy phân và loại pha nước, cô quay thu được 6,4 g cao flavonoid (cao FL)
Khảo sát hệ dung môi sắc ký bản mỏng
Bảng II-1 Kết quả khảo sát hệ dung môi phân tích cao FL
STT Hệ dung môi Khả năng tách
5 n-hexane – EtOAc - chloroform – formic acid (70:30:5:1) +++
6 ethyl acetate – nước –formic acid –acetic acid (23:7:3:3) ++
7 butyl acetate – formic acid –acetic acid (29:0,5:0,5) -
Ghi chú: - : không xuất hiện vết khi sấy nóng +: xuất hiện 1 vết khi sấy nóng
++: xuất hiện 2 vết khi sấy nóng +++: xuất hiện 3 vết khi sấy nóng
Dựa trên độ phân cực của các dung môi, tiến hành khảo sát tìm hệ dung môi phù hợp để phân tách 03 hợp chất flavonoid Kết quả tìm được hai hệ thể hiện rõ độ phân giải của 03 hợp chất flavonoid:
n-hexane - EtOAc - chloroform - formic acid (70:30:5:1) (hệ I)
chloroform - MeOH - formic acid (90:9:1) (hệ II)
Do độ độc của dung môi chloroform sử dụng trong hệ II, hệ I được lựa chọn để triển khai dung môi trên TLC và sắc ký cột cổ điển
Hình II-2 TLC hệ dung môi đã khảo sát
Phân lập các phân đoạn bằng sắc ký cột cổ điển thu được các chất I, Q, K a) Chất K
- Tính chất: bột màu vàng xanh, tan trong DMSO, EtOAC, ether, tan ít trong nước
- TLC: Rf = 0,24 - Nhiệt độ nóng chảy: 294,38 o C (xem phụ lục 5) - Phổ 1 H NMR: xem phụ lục 1, 2, 3
Biện giải của chất K được trình bày trong Bảng II-2
Bảng II-2 Dữ liệu phổ 1H NMR của chất K
- Phổ 13 C NMR: xem phụ lục 4 Biện giải của chất K được trình bày trong Bảng II-3
Bảng II-3 Dữ liệu phổ 13C NMR của chất K
Vị trí Loại C 13 C- NMR δ (ppm)
- Phổ HR MS: xem phụ lục 15, 16
Kết luận: phổ khối, 1 H NMR, 13 C NMR phù hợp với cấu trúc của Kaempferol
- Tính chất: bột màu vàng nhạt, sáng, tan trong DMSO, EtOAC, ete, tan ít trong nước
- TLC: Rf = 0,145 - Nhiệt độ nóng chảy: 311,66 o C (xem phụ lục ) - Phổ 1 H NMR: xem phụ lục 6, 7, 8
Biên giải của chất Q được trình bày trong Bảng II-4
Bảng II-4 Dữ liệu phổ 1H NMR của chất Q
- Phổ 13 C NMR: xem phụ lục 9 Biện giải của chất Q được trình bày trong Bảng II-5
Bảng II-5 Dữ liệu phổ 13C NMR của chất Q
Vị trí Loại C 13 C- NMR δ (ppm)
- Phổ HR MS: xem phụ lục 17, 18
Kết luận: phổ khối, 1 H NMR, 13 C NMR phù hợp với cấu trúc của Quercetin c) Chất I
- Tính chất: bột màu vàng nhạt, sạm, tan trong DMSO, EtOAC, ete, tan ít trong nước
- TLC: Rf = 0,36 - Nhiệt độ nóng chảy: 324,25 o C (xem phụ lục 15) - Phổ 1 H NMR: xem phụ lục 11, 12, 13
Biện giải của chất Q được trình bày trong Bảng II-6
Bảng II-6 Dữ liệu phổ 1H NMR của chất I
- Phổ 13 C NMR: xem phụ lục 14 Biện giải của chất I được trình bày trong Bảng II-7
Bảng II-7 Dữ liệu phổ 13C NMR của chất I
Vị trí Loại C 13 C- NMR δ (ppm)
- Phổ HR MS: xem phụ lục 19, 20
Kết luận: phổ khối, 1 H NMR, 13 C NMR phù hợp với cấu trúc của Isorhamnetin
2.2.2 Thủy phân có sự hỗ trợ của vi sóng
Dưới sự hỗ trợ của vi sóng trong quá trình thủy phân cao bạch quả thô, tiến hành khảo sát song song hai thông số tỷ lệ rắn lỏng và thời gian phản ứng với kỳ vọng sẽ cải thiện thời gian phản ứng
Bảng II-8 Điều kiện phản ứng của phương pháp chiết thủy phân có sự hỗ trợ của vi sóng Điều kiện phản ứng
Nguyên liệu: 5,3 g cao bạch quả khô Lò vi sóng 800W
Dung môi: MeOH Tác nhân thủy phân: HCl 36% cc Tỷ lệ rắn lỏng
Thời gian phản ứng, phút
Biểu đồ II-1 Hàm lượng chất I trong cao FL của phương pháp thủy phân có sự hỗ trợ của vi sóng
Biểu đồ II-2 Hàm lượng chất Q trong cao FL của phương pháp thủy phân có sự hỗ trợ của vi sóng
THỜI GIAN PHẢN ỨNG VI SÓNG, PHÚT
HÀM LƯỢNG CHẤT I TRONG CAO FL
1 g : 30 mL 1 g : 35 mL 1 g : 40 mL Tỷ lệ rắn lỏng
THỜI GIAN PHẢN ỨNG, PHÚT
HÀM LƯỢNG CHẤT Q TRONG CAO FL
1 g : 30 mL 1 g : 35 mL 1 g : 40 mLTỷ lệ rắn lỏng
Biểu đồ II-3 Hàm lượng chất K trong cao FL của phương pháp thủy phân có sự hỗ trợ của vi sóng Đối với phương pháp thủy phân dưới sự hỗ trợ của vi sóng, chất I thu được với hàm lượng cao nhất (0,812 %) ở điều kiện như sau: thời gian phản ứng 3 phút, tỷ lệ rắn : lỏng là 1 g : 40 mL Đây cũng là điều kiện thu được hàm lượng trong cao FL của chất Q và chất K cao nhất; lần lượt là 2,687 % và 1,801 %
- Đối với chất I: Ở điều kiện tỷ lệ rắn: lỏng là 1: 30 và 1:35, hàm lượng trong cao FL của chất I thu được sau 2 phút cao hơn hẳn ở phút đầu tiên lần lượt là 1,29 lần và 1,41 lần Tuy nhiên, khi tăng thời gian phản ứng lên đến phút thứ 3, hàm lượng trong cao FL của chất I đột ngột giảm mạnh, thậm chí còn thấp hơn cả hàm lượng thu được ở phút đầu tiên (giảm 1,58 lần so với phút thứ 2 ở cả hai điều kiện phản ứng nói trên) Có thể đưa ra giả thuyết chất I bị biến tính theo thời gian phản ứng dẫn đến việc hàm lượng của chất I suy giảm đáng kể
- Đối với chất Q: ở các điều kiện tỷ lệ rắn lỏng khảo sát, hàm lượng trong cao
FL của chất Q có xu hướng giảm nhẹ từ phút thứ 1 sang phút thứ 2 Thời gian phản ứng đến 3 phút, có sự chuyển biến khác nhau về hàm lượng thu được giữa các điều kiện tỷ lệ rắn lỏng khảo sát Trong khi ở tỷ lệ 1:35, hàm lượng các chất trong cao FL tăng nhẹ; ở tỷ lệ 1:40 hàm lượng thu được tăng lên 1,17
% so với phút thứ 2 và đạt giá trị cao nhất trong cả phương pháp là 2,687% thì ở tỷ lệ 1:30, hàm lượng chất Q thu được lại tiếp tục giảm ở phút thứ 3
THỜI GIAN PHẢN ỨNG, PHÚT
HÀM LƯỢNG CHẤT K TRONG CAO FL
1 g : 30 mL 1 g : 35 mL 1 g : 40 mLTỷ lệ rắn lỏng
- Đối với chất K: khi khảo sát ở tỷ lệ 1:30, hàm lượng chất K trong cao FL có xu hướng tăng nhẹ khi thời gian phản ứng tăng từ 1 đến 3 phút Với tỷ lệ 1:35 có hàm lượng chất K trong cao FL tăng từ 1 lên 2 phút và giảm nhẹ khi tăng lên 3 phút Hàm lượng trong cao FL của chất K ở tỷ lệ rắn: lỏng 1:40 giảm khi tăng thời gian phản ứng từ 1 phút đến 2 phút, tăng lên 0,16 % và đạt giá trị cao nhất khi thời gian tăng lên 3 phút.
Ngoài ra, kết quả trên TLC cũng cho thấy ở các điều kiện tỷ lệ rắn : lỏng khác nhau, đều có sự xuất hiện các chất không mong muốn Thời gian phản ứng càng tăng, các chất tạp xuất hiện càng nhiều
Tiến hành phân lập bằng sắc ký cột cổ điển các phân đoạn Q, K, I Kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết (bán định lượng) với LC-MS:
Phổ LC- MS: xem phụ lục 24 Phổ khối (m/z): [M+H]: 303,0492 Độ tinh khiết: 86,0 %
Phổ LC- MS: xem phụ lục 25
Phổ khối (m/z): [M+H]: 287,0540 Độ tinh khiết: 78,0 %
Phổ LC- MS: xem phụ lục 26 Phổ khối (m/z): [M+H]: 317,0695 Độ tinh khiết: 99,9 %
Khảo sát khả năng phân lập các flavonoid trong cao lá bạch quả qua các phương thức chiết- thủy phân một bước
2.3.1 Phương pháp chiết Soxhlet one-pot
Nhận thấy hạn chế của phương pháp hai bước chiết- thủy phân là vấn đề thời gian và phức tạp trong việc thiết lập phản ứng, phương pháp chiết Soxhlet one- pot được thực hiện khảo sát ở tỷ lệ rắn lỏng và thời gian phản ứng với kỳ vọng sẽ cải thiện được hạn chế nói trên
Công thức tính hàm lượng các flavonoid có trong cao FL:
Bảng II-9 Điều kiện phản ứng của phương pháp chiết Soxhlet one-pot Điều kiện phản ứng
Nguyên liệu: 30,0 g bột lá bạch quả Dung môi: EtOH 70%
Tác nhân thủy phân: HCl 36%
STT Tỷ lệ rắn lỏng
Thời gian phản ứng, phút
I: Không phát hiện HQ = 1,980 % HK = 1,473 %
I: Không phát hiện HQ = 1,903 % HK = 1,187 %
I: Không phát hiện HQ = 1,667 % HK = 1,147 %
I: Không phát hiện HQ = 2,088 % HK = 1,677 %
I: Không phát hiện HQ = 2,381 % HK = 1,662 %
I: Không phát hiện HQ = 2,491 % HK = 1,692 %
I: Không phát hiện HQ = 2,322 % HK = 1,615 %
I: Không phát hiện HQ = 2,314 % HK = 1,691 %
I: Không phát hiện HQ = 2,555 % HK = 1,748 %
Biểu đồ II-4 Hàm lượng trong cao FL của chất Q của phương pháp chiết Soxhlet one-pot
THỜI GIAN PHẢN ỨNG, PHÚT
HÀM LƯỢNG CHẤT Q TRONG CAO FL
1g : 8 mL 1 g : 10 mL 1 g : 12 mLTỷ lệ rắn lỏng
Biểu đồ II-5 Hàm lượng trong cao FL của chất K của phương pháp chiết Soxhlet one-pot Đối với phương pháp chiết soxhlet one-pot, không thu được chất I trong tất cả điều kiện khảo sát Hàm lượng trong cao FL của chất Q và K thu được cao nhất ở điều kiện như sau: thời gian phản ứng 200 phút, tỷ lệ rắn : lỏng là 1 g : 12 mL; hàm lượng thu được lần lượt là 2,555 % và 1,748 % Ở điều kiện tỷ lệ rắn : lỏng thấp hơn, thời gian phản ứng càng dài, hàm lượng trong cao FL của chất Q và chất K càng giảm
Kết quả khảo sát cũng cho thấy dịch chiết bao hàm những chất không mong muốn khác trong quá trình chiết Tuy nhiên, lượng tạp này không đáng kể
- Đối với chất I: không thu được chất I trong tất cả điều kiện khảo sát Có thể đưa ra giả thuyết điều kiện phản ứng quá mãnh liệt đã làm biến tính mất chất I
- Đối với chất Q: hàm lượng chất Q trong cao FL thu được khi thực hiện phương pháp này không tuân theo một quy luật nhất định nào Theo sự tăng của dòng thời gian, nếu như ở tỷ lệ 1:10, hàm lượng tăng dần từ 2.088 % lên đến 2.491
% thì ngược lại ở tỷ lệ 1:8, hàm lượng giảm dần từ 1.98 % và đạt giá trị thấp nhất 1.667 % tại phút thứ 200 Trong lúc đó, hàm lượng chất Q thu được trong cao FL ở tỷ lệ 1:12 lại theo một diễn biến khác: giảm nhẹ từ 2.322% rồi lại tăng lên va đạt giá trị cao nhất là 2.555% tại phút thứ 200
THỜI GIAN PHẢN ỨNG, PHÚT
HÀM LƯỢNG CHẤT K TRONG CAO FL
1 g : 8 mL 1 g : 10 mL 1 g : 12 mLTỷ lệ rắn lỏng
- Đối với chất K: tương tự như chất Q, hàm lượng thu được của chất K trong cao FL cũng không theo một trât tự nào Đối lập với sự tăng đều hàm lượng chất K qua các mốc thời gian (khoảng 1,03- 1,05 lần) ở tỷ lệ 1:12, hàm lượng tại tỷ lệ 1:8 lại giảm dần Riêng ở tỷ lệ 1:10, hàm lượng giảm nhẹ từ 1,667 % khi tăng thời gian phản ứng từ 135 đến 165 phút, rồi tăng giá trị hàm lượng lên 2.555 % trong quãng thời gian còn lại từ 165 đến 200 phút
Tiến hành phân lập bằng sắc ký cột cổ điển các phân đoạn Q, K, I Kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết (bán định lượng) với LC-MS:
Phổ LC- MS: xem phụ lục 21 Phổ khối (m/z): [M+H]: 303,0481 Độ tinh khiết: 85,5 %
Phổ LC- MS: xem phụ lục 22 Phổ khối (m/z): [M+H]: 287,0547 Độ tinh khiết: 71,4 %
2.3.2 Phương pháp chiết với sự hỗ trợ của siêu âm Bảng II-10 Điều kiện phản ứng của phương pháp chiết với sự hỗ trợ của siêu âm Điều kiện phản ứng
Nguyên liệu: 5 g cao lá bạch quả Bể siêu âm 1000W
Dung môi: MeOH Tác nhân thủy phân: HCl 36%
Thời gian phản ứng, phút
I: không phát hiện HQ = 2,306 % HK = 1,624 %
I: không phát hiện HQ = 2,309 % HK = 1,620 %
I: không phát hiện HQ = 2,385 % HK = 1,725 %
I: không phát hiện HQ = 2,317 % HK = 1,685 %
I: không phát hiện HQ = 2,270 % HK = 1,629 %
I: không phát hiện HQ = 2,570 % HK = 1,678 % Ở nhiệt độ 80 o C, hầu như không có tạp chất xuất hiện và ba chất I, Q, K trong dịch chiết được thể hiện khá rõ trên TLC Mặt khác, thời gian phản ứng càng lâu, lượng chất I bị suy giảm một cách rõ rệt
Biểu đồ II-6 Hàm lượng trong cao FL của chất I của phương pháp chiết với sự hỗ trợ của siêu âm
Biểu đồ II-7 Hàm lượng trong cao FL của chất Q của phương pháp chiết với sự hỗ trợ của siêu âm
THỜI GIAN PHẢN ỨNG, PHÚT
HÀM LƯỢNG CHẤT I TRONG CAO FL
THỜI GIAN PHẢN ỨNG, PHÚT
HÀM LƯỢNG CHẤT Q TRONG CAO FL
Biểu đồ II-8 Hàm lượng trong cao FL của chất K của phương pháp chiết với sự hỗ trợ của siêu âm
- Đối với chất I: Không thu được chất I ở 60 o C tại tất cả thời gian phản ứng khảo sát Ở 70 o C và 80 o C, thời gian phản ứng càng tăng, hàm lượng trong cao FL của chất I giảm dần về 0 Hàm lượng thu được cao nhất ở 80 o C
- Đối với chất Q: ở nhiệt độ 60 o C và 80 o C, hàm lượng chất Q thu được trong cao FL tăng dần theo thời gian và đạt giá trị cao nhất ở 80 o C Riêng với trường hợp khảo sát 70 o C, sau khi tăng nhẹ, hàm lượng trong cao FL của chất Q giảm
- Đối với chất K: hàm lượng trong cao FL của chất K có diễn biến tương tự như hàm lượng trong cao FL của chất Q ở cùng điều kiện Tuy nhiên, hàm lượng đạt cao nhất ở 60 o C
Tiến hành phân lập bằng sắc ký cột cổ điển các phân đoạn Q, K, I Kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết (bán định lượng) với LC-MS:
Phổ LC- MS: xem phụ lục 27 Phổ khối (m/z): [M+H]: 303,0495
THỜI GIAN PHẢN ỨNG, PHÚT
HÀM LƯỢNG CHẤT K TRONG CAO FL
Nhiệt độ phản ứng ( o C) Độ tinh khiết: 87,3 % - Chất K:
Phổ LC- MS: xem phụ lục 28
Phổ khối (m/z): [M+H]: 287,0547 Độ tinh khiết: 72,7 %
Phổ LC- MS: xem phụ lục 26 Phổ khối (m/z): [M+H]: 317,0696 Độ tinh khiết: 99,9 %
