nguyễn thị hải yến nghiên cứu điều chế và khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng cao chiết bài thuốc dạ dày yb

Xây dựng phương pháp định lượng militarin trong cao khô Bạch cập, cao khô bài thuốc dạ dày YB bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC .... Tùy theo bản chất của dược liệu, dung môi, tiêu chu

TỔNG QUAN

Tổng quan về Bệnh viêm loét dạ dày tá tràng

1.1.1 Bệnh viêm loét dạ dày tá tràng theo quan điểm Y học hiện đại

Viêm dạ dày được định nghĩa là tình trạng viêm xảy ra tại các tế bào niêm mạc dạ dày [4], [7], [13]

Loét dạ dày – tá tràng là bệnh mạn tính, diễn biến có tính chu kỳ, đặc trưng bởi tình trạng có sự hiện diện của tổn thương loét trên niêm mạc dạ dày hoặc tá tràng [7], [15], [42]

1.1.2 Nguyên nhân gây bệnh và cơ chế bệnh sinh

- Vi khuẩn Helicobacter pylori (H.p): có mặt ở 70 – 90 % bệnh nhân VLDDTT [42]

- NSAID và corticoid: đã được chứng minh gây VLDDTT, với nguy cơ loét dạ dày cao hơn tá tràng [7], [15], [13]

Bình thường, niêm mạc dạ dày tá tràng tồn tại được và quá trình tiêu hóa được tiếp diễn bình thường chính là nhờ sự cân bằng của quá trình bảo vệ (yếu tố chống loét) và tấn công (yếu tố gây loét) [4], [7], [13], [15]

Các yếu tố bảo vệ và tấn công tác động đến sinh lý của dạ dày tá tràng được trình bày ở bảng sau:

Bảng 1.1 Các yếu tố bảo vệ và yếu tố tấn công đến sinh lý dạ dày tá tràng

Yếu tố bảo vệ Yếu tố tấn công

Lớp nhầy Acid HCl và pepsin dịch vị

Muối kiềm bicarbonate Vi khuẩn Helicobacter pylori (H.p)

Hệ thống mao mạch dưới niêm mạc Các thuốc chống viêm không steroid

Sự toàn vẹn và tái tạo của tế bào biểu mô và bề mặt niêm mạc dạ dày – tá tràng

Các yếu tố nguy cơ khác: chất kích thích, di truyền, stress, … Nếu mất sự cân bằng giữa yếu tố bảo vệ và yếu tố tấn công, trong đó yếu tố tấn công ưu thế hơn và/hoặc yếu tố bảo vệ suy giảm sẽ dẫn đến hậu quả gây loét dạ dày tá tràng

1.1.2.3 Triệu chứng lâm sàng a Viêm loét dạ dày [7], [13],[4], [15]

- Đau ở vùng thượng vị, đau có tính chất chu kỳ từng đợt và đau sau khi ăn

- Đầy bụng, ợ hơi, ợ chua và buồn nôn, nôn

- Thăm khám lâm sàng trong cơn đau có thể thấy: o Co cứng vùng thượng vị

3 o Ấn điểm thượng vị cảm giác đau sẽ tăng lên (điểm thượng vị được xác định trung điểm của đường nối rốn và mũi ức) b Viêm loét tá tràng [4], [15], [13], [7]

- Thường đau vào lúc đói hoặc ban đêm, đau quặn thắt, đau ở thượng vị sang phải

- Nôn, buồn nôn ngay cả lúc đói

- Thăm khám lâm sàng trong cơn đau có thể thấy: o Co cứng vùng thượng vị o Ấn điểm môn vị cảm giác đau tăng lên (điểm môn vị được xác định là điểm thượng vị lệch sang bên phải khoảng 2 cm)

Mục tiêu của việc điều trị loét dạ dày tá tràng là giảm đau, làm lành vết loét, ngăn ngừa tái phát và giảm các biến chứng liên quan đến vết loét Vì vậy, hiện nay các thuốc thường được sử dụng trong điều trị loét dạ dày tá tràng là: thuốc kháng acid dịch vị, thuốc ức chế tiết acid dịch vị, thuốc bảo vệ niêm mạc dạ dày, thuốc diệt vi khuẩn H.p [7], [15], [13]

- Thuốc kháng acid dịch vị (antacid):

Bao gồm: các muối và hydroxyd của nhôm, magnesi, calci Các biệt dược như: Alusi, Phosphalugel, Almagel, Maalox,

- Thuốc ức chế tiết acid dịch vị:

Thuốc kháng thụ thể H2 của Histamin: cimetidin, ranitidin, famotidin và nizatidin Thuốc ức chế bơm proton H + /K + -ATPase (PPIs): omeprazol, pantoprazol, lansoprazol, rabeprazol, esomeprazol,

- Thuốc tăng cường yếu tố bảo vệ niêm mạc dạ dày:

Thuốc bảo vệ niêm mạc và băng bó ổ loét: sucralfat

Thuốc kích thích tiết nhầy, tái tạo tế bào biểu mô: misoprostol

- Thuốc diệt vi khuẩn Helicobacter pylori (H.p):

Loại bỏ vi khuẩn Helicobacter pylori được khuyến cáo trong tất cả bệnh nhân có

H.p dương tính, đặc biệt là ở những bệnh nhân có vết loét đang hoạt động, tiền sử bị loét trước đó hoặc tiền sử liên quan đến loét có biến chứng

Các thuốc thường dùng để diệt vi khuẩn H.p gồm:

+ Kháng sinh: amoxicillin, tetracyclin, clarithromycin, levofloxacin

+ Dẫn xuất 5-nitro imidazol: metronidazol, tinidazol.

Bệnh viêm loét dạ dày tá tràng theo quan điểm Y học cổ truyền

Theo quan điểm Y học cổ truyền, bệnh viêm loét dạ dày tá tràng thuộc phạm vi chứng vị quản thống, vị thống Vị quản thống hay còn gọi là vị thống, là chỉ các bệnh mà có triệu chứng đau tức sinh ra ở vùng thượng vị dưới mũi ức [2]

Nguyên nhân gây bệnh là do tình chí bị kích thích dẫn đến can khí uất kết, mất khả năng sơ tiết, làm rối loạn khí cơ thăng thanh, giáng trọc của tỳ vị mà gây ra các triệu chứng như đau vùng thượng vị, ợ hơi, ợ chua, hoặc do ăn uống thất thường làm cho tỳ vị tổn thương, mất khả năng kiện vận, hàn tà nhân đó xâm nhập gây khí trệ, huyết ứ, sinh ra các cơn đau [1], [2]

1.2.2 Thể can khí phạm vị

Còn gọi là can vị bất hòa, can khắc tỳ, can mộc khắc tỳ thổ, … thường chia làm 3 thể nhỏ [1], [2] a Thể khí trệ (khí uất) [1], [2]

- Triệu chứng: đau vùng thượng vị từng cơn, đau lan ra hai mạng sườn xuyên ra sau lưng, bụng đầy chướng, ấn thấy đau, ợ hơi, ợ chua, chất lưỡi hơi đỏ, rêu lưỡi trắng hoặc vàng mỏng, mạch huyền

- Phương pháp chữa: hoà can lý khí (sơ can giải uất, sơ can hoà vị) b Thể hỏa uất [1], [2]

- Triệu chứng: đau vùng thượng vị nhiều, đau rát, ấn thấy đau, miệng khô đắng, hay ợ chua, chất lưỡi đỏ, rêu lưỡi vàng, mạch huyền, sác

- Phương pháp chữa: sơ can tiết nhiệt (thanh can hoà vị) c Thể huyết ứ [1], [2]

- Triệu chứng: đau dữ dội ở một vị trí nhất định vùng thượng vị, cự ấn (ấn vào thấy đau tăng lên, ấn vào khó chịu) Chia làm 2 loại:

- Thực chứng: nôn ra máu, đại tiện phân đen, môi đỏ, lưỡi đỏ, rêu lưỡi vàng, mạch huyền sác hữu lực (bệnh thể cấp)

- Hư chứng: sắc mặt xanh nhợt, người mệt mỏi, chân tay lạnh, môi nhạt, chất lưỡi bệu có điểm huyết ứ, rêu lưỡi nhuận, mạch hư đại hoặc tế sác (bệnh thể hoãn)

- Phương pháp chữa: o Thực chứng: thông lạc hoạt huyết hay lương huyết chỉ huyết o Hư chứng: bổ huyết chỉ huyết

1.2.3 Thể tỳ vị hư hàn

- Triệu chứng: đau vùng thượng vị liên miên, nôn nhiều, mệt mỏi, thích xoa bóp và chườm nóng, đầy bụng, nôn ra nước trong, sợ lạnh, tay chân lạnh, đại tiện phân nát, có lúc táo, rêu lưỡi trắng, chất lưỡi nhợt, mạch hư tế

- Phương pháp chữa: ôn trung kiện tỳ (ôn bổ tỳ vị, ôn vị kiện trung) [1], [2].

Bài thuốc dạ dày YB

1.3.1 Nguồn gốc và xuất xứ của bài thuốc dạ dày YB Ở Việt Nam, bài thuốc dạ dày chúng tôi nghiên cứu có nguồn gốc từ Yên Bái Nhưng khi tra cứu tài liệu tham khảo nước ngoài, nhận thấy bài thuốc có tên gọi là “Hội

5 thương tán” được ghi chép trong cuốn sách “Thiên gia diệu phương” (Những bài thuốc đông y hay của muôn nhà) với liều lượng như sau [6]:

Bạch cập: 60 g Diên hồ sách: 30 g

Cách dùng và đường dùng: các vị đều đem tán mịn, khi uống đem trộn với lượng tương đương đường trắng, lúc đầu uống ngày 3 lần, mỗi lần 3g; tùy theo triệu chứng bệnh giảm đi mà chuyển thành mỗi ngày 2 lần hoặc 1 lần, mỗi lần vẫn uống 3g; uống lúc đói, trước bữa ăn [6]

Hiệu quả lâm sàng của bài thuốc: đã quan sát hơn 200 bệnh nhân, phần lớn những trường hợp uống 1 đợt có thể có tác dụng ổn định bệnh từ 3 đến 6 tháng; uống 2 đợt thì có tác dụng từ 8 tháng đến 1 năm; uống 3 đợt phần lớn khỏi hẳn [6]

1.3.2 Công thức bài thuốc dạ dày YB nghiên cứu

Bạch cập: 1200 mg Diên hồ sách: 600 mg

Xuyên bối mẫu: 600 mg Đại hoàng: 600 mg

Cam thảo: 2000 mg Mai mực: 1200 mg

Liều lượng: ngày 2 – 4 liều tùy theo mức độ bệnh, uống trước bữa ăn 1 giờ Hiện tại trên thị trường có chế phẩm Cốm dạ dày “Osluma” của công ty Cổ phần Dược phẩm Khang Minh với công thức như trên và cách dùng: hòa thuốc trong gói vào khoảng 50 mL nước nóng, chờ nguội bớt, khuấy đều rồi uống

Cách sử dụng theo dân gian hoặc chế phẩm cốm có đặc điểm là cách pha thuốc phức tạp, đồng thời khi uống sẽ có cảm giác khó chịu, lợn cợn trong miệng do liều lượng lớn, các thành phần thuốc là các tiểu phân dược liệu không tan Do đó, cần thiết phải bào chế thành các dạng chế phẩm tiện lợi hơn như viên nén, viên nang Do bài thuốc này không sử dụng theo phương pháp sắc [11] , nên việc bào chế theo phương pháp chiết nước nóng thông thường có thể không bảo tồn được tối đa tác dụng bài thuốc nên cần thiết phải tối ưu hóa việc chiết xuất các thành phần theo các dung môi, phương pháp thích hợp

1.3.3 Công năng, chủ trị của bài thuốc dạ dày YB

- Công năng: hoạt huyết, hóa ứ, chế toan, chỉ thống [6]

- Chủ trị: trị khí trệ, huyết ứ, thanh nhiệt, sinh cơ, giảm acid dạ dày, giảm đau Dùng để điều trị dạ dày viêm, dạ dày loét, tá tràng viêm, tá tràng loét [6]

- Giải thích phương thuốc: o Cam thảo có tác dụng hoãn cấp chỉ thống đồng thời là lượng nhiều nhất trong bài thuốc đóng vai trò vừa là Quân, vừa là Sứ dẫn thuốc đến nơi bệnh

6 o Bối mẫu có tác dụng thanh nhiệt, Diên hồ sách lý khí giảm đau, Bạch cập có tác dụng sinh cơ, chỉ huyết, tiêu sưng Ba vị thuốc này điều trị chứng hỏa uất và khí trệ, huyết ứ đóng vai trò là thần o Ô tặc cốt có tác dụng giáng khí chỉ nôn, Đại hoàng giúp trục ứ thông kinh đóng vai trò là tá.

Tổng quan về các vị thuốc trong Bài thuốc dạ dày YB

1.4.1.1 Tên khoa học: Rhizoma Bletillae striatae

Thân rễ, rễ củ phơi hay sấy khô của cây Bạch cập [Bletilla striata (Thunb.) Reichb f.], họ Lan (Orchidaceae) [8], [10], [23]

- Polysaccharid: Chất nhầy là thành phần chủ yếu trong rễ củ cây Bạch cập chiếm khoảng 55 % Đây là một heteropolysaccharid có độ nhớt, trọng lượng phân tử cao, cấu tạo hóa học là glucomannan (bao gồm D-glucose và D-mannose) [10], [30], [9], [5]

- Glycosid: militarin, dactylorhin A, gymnosid (I, II, III, IV), bletilnosid (A, B), dancosterol, 3-O-β-D-glucopyranosyl-3-epiruscogenin, Có khoảng 19 glycosid được tìm thấy trong Bạch cập [52] Trong đó, hàm lượng militarin có thể lên tới 4,92 % ở các loài Bletilla [52] và đồng thời militarin là chất chính, đã được đưa vào kiểm soát trong chỉ tiêu định tính, định lượng dược liệu Bạch cập trong dược điển Trung Quốc và Hồng Kông [17], [23]

- Bibenzyl: có tổng cộng 44 bibenzyl có cấu trúc xác định chia thành 3 nhóm theo đặc điểm Nhóm I là bibenzyl đơn giản (batatasin III, 3’-O-methylbatatasin III, …) [5], nhóm II là các benzyl bibenzyl (blestritin B, blestritin C, …), nhóm III là các bibenzyl quang hoạt (blestritin D, F, H, I; blestritin A, …) [27], [52]

- Phenanthren và dẫn xuất: bao gồm các dihydrophenanthren, phenanthren, biphenanthren, phenanthraquinon, triphenanthren, … [10], [31]

- Ngoài ra có một số thành phần khác bao gồm: steroid, triterpenoid, acid phenolic, anthraquinon, …[27], [52]

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của militarin

7 Militarin thuộc nhóm O-glycosid có độ phân cực mạnh nên tan tốt trong nước, ethanol, dung môi hữu cơ có độ phân cực thấp [26]

Cấu trúc hoá học có mối liên hệ chặt chẽ với đặc điểm dược lý của hoạt chất: Militarin có tác dụng cầm máu, chống viêm, chống loét dạ dày tá tràng, bảo vệ thần kinh, bảo vệ phổi và đặc tính chống lại khối u, kháng khuẩn [26]

Militarin là một hợp chất của benzyl diglycosid với polyhydroxy, hai vòng benzen, nhiều nhóm ester và hai vòng pyran, có độ hấp thụ tối đa ở gần 223 nm [26]

Một số chương trình sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng để định lượng militarin trong dược liệu Bạch cập được trình bày ở Bảng 1.2

Bảng 1.2 Một số chương trình sắc ký sử dụng trong định lượng militarin

Tài liệu tham khảo Điều kiện sắc ký

Dược điển Hồng Kông [17] - Cột C18 (4,6 mm × 250 mm; 5 μm)

- - Tốc độ dòng: 1 mL/phút

- - Bước sóng phát hiện: 223 nm

Dược điển Trung quốc [23] - Cột C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 μm)

- Pha động Acetonitril: acid phosphoric 0,1% với tỷ lệ 22:78

- Tốc độ dòng: 1 mL/phút

- Bước sóng phát hiện: 223 nm

Bạch cập tham gia vào các quá trình cầm máu bao gồm cầm máu nguyên phát trong việc thúc đẩy tăng tốc độ kết tập tiểu cầu và hình thành cục máu đông fibrin (cầm máu thứ phát) bằng cách kích hoạt các yếu tố đông máu khác nhau, thúc đẩy tổng hợp thromboxane-A2 làm giảm quá trình chảy máu Do tác dụng cầm máu rõ ràng nên Bạch cập đã được phát triển như một loại nguyên liệu cầm máu mới, kết hợp với các phương pháp hiện tại để làm nguyên liệu cầm máu trong điều trị phẫu thuật [24], [36], [32]

8 Trong giai đoạn viêm, Bạch cập có thể kiểm soát biểu hiện của các yếu tố gây viêm (TNF-α, IL-1β) ở mức độ thích hợp, giảm phản ứng viêm trong vết thương và ngăn ngừa tổn thương cho các tế bào còn lại Đồng thời giúp làm tăng nồng độ oxid nitric (NO) trong vết thương, từ đó thúc đẩy quá trình hóa ứng động bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn nhân và đại thực bào NO có vai trò như chất trung gian nội tiết, có cơ chế giãn mạch tại chỗ, tân tạo mạch máu, tăng sinh tế vào nội mô để vết thương có được nguồn cung cấp máu dồi dào hơn từ đó giúp sửa chữa, làm lành vết thương [40], [41], [47]

- Tác dụng chống loét dạ dày tá tràng:

Polysaccharid tạo thành lớp màng bảo vệ niêm mạc bị tổn thương khỏi ảnh hưởng của acid dạ dày và pepsin [25] Đã có nghiên cứu tác dụng chống loét dạ dày của Bạch cập trên chuột cống thí nghiệm [9] và trong thử nghiệm lâm sàng kết kết hợp với Panax notoginseng, omeprazol và amoxicillin có thể làm giảm phản ứng viêm của loét dạ dày, bảo vệ bề mặt loét, thúc đẩy tái tạo và sửa chữa mô loét [19], [47]

Các dẫn chất Phenanthren và dẫn chất Bibenzyl đều có tác dụng kháng khuẩn đối với các vi khuẩn như tụ cầu vàng, tụ cầu vàng kháng methicilin, tụ cầu da, vi khuẩn đường ruột Enterococcus faecalis, … [9], [45], [5]

1.4.1.5 Tác dụng và công dụng theo Y học cổ truyền

- Tính vị, quy kinh: vị đắng, tính bình, quy vào kinh phế, vị

Chỉ huyết: dùng trong các bệnh ho ra máu, xuất huyết đường tiêu hóa, chảy máu

Bổ phế sinh cơ: dùng đối với bệnh lao đã thành hang trong phổi hoặc ho lao, thổ huyết

Sát trùng giải độc: dùng ngoài để trị ung thũng cá vết nứt nẻ trên da hoặc rắc bột bạch cập và các chỗ da bị bỏng, các chỗ nứt nẻ ở kẽ hậu môn [12]

- Định tính bằng sắc ký lớp mỏng, so sánh với chất chuẩn militarin hoặc dược liệu chuẩn Bạch cập [8], [17], [23]

- Định lượng: hiện tại, chỉ có Dược điển Trung Quốc và Hồng Kông đã xây dựng tiêu định tính, định lượng dược liệu Bạch cập để kiểm soát chất lượng còn chuyên luận Bạch cập trong Dược điển Việt Nam nước ta lại chưa có chỉ tiêu định lượng để đánh giá và quản lý dược liệu này: o Phương pháp: sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) o Chất chuẩn đối chiếu: militarin o Yêu cầu: hàm lượng militarin trong Bạch cập không được thấp hơn 1,9 % [17] hoặc 2,0 % [23] tính theo dược liệu khô kiệt

1.4.2.1 Tên khoa học: Bulbus Fritillariae

Thân hành đã phơi hay sấy khô của cây Xuyên bối mẫu (Fritillariae cirrhosa D Don), thuộc họ Loa kèn (Liliaceae) [8], [23]

- Chủ yếu là các alcaloid bao gồm: sipeimin (được phân lập đầu tiên năm 1988), peimisin, peiminin, peimin và chuanbeinon, [5], [27] Hàm lượng tổng alcaloid trong Xuyên bối mẫu thấp khoảng từ 0,02 đến 0,3% [33] Sipeimin chủ yếu được sử dụng làm tiêu chuẩn kiểm soát chất lượng dược liệu [23]

- Steroid: β-Sitosterol, daucosterol, campesterol, dẫn chất 6β-dihydroxycholestan, [21]

- Nucleosid: cho đến nay, hơn 10 nucleosid đã được phân lập và xác định từ Xuyên bối mẫu như uracil, thymin, cytidin, inosin và thymidin, … [21]

- Ngoài ra, còn có các tinh dầu, acid hữu cơ, một số nguyên tố như calci, magnesi,

… có trong Xuyên bối mẫu [21]

- Tác dụng trên hệ hô hấp:

Bốn alcaloid trong Xuyên bối mẫu, cụ thể là peiminin, imperialin N-oxid, isoverticin và isoverticin N-oxid có thể ức chế trung tâm ho ở chuột và có tác dụng chống ho phụ thuộc vào liều [48]

Là một trong những tác dụng quan trọng nhất thông qua cơ chế ức chế quá trình phosphoryl hóa của TNF-α, IL-6, IL-1β, p38, ERK, c-Jun N-terminal kinase (JNK), p65 và IκB và tăng sản xuất IL-10 trong đại thực bào RAW264.7 làm giảm các cytokin gây viêm trong các tế bào [48], [35], [20], [48]

1.4.2.5 Tác dụng và công dụng theo Y học cổ truyền

- Tính vị, quy kinh: tính hơi hàn, vị ngọt đắng Quy vào kinh tâm, phế

Thanh nhiệt, nhuận phế, hóa đờm, tán kết Chủ trị: Ho ráo do phế nhiệt, ho khan, ho đờm có máu, ho lao (không có vi khuẩn); loa lịch (tràng nhạc), áp xe vú, bướu cổ [8], [23]

1.4.2.6 Định tính, định lượng Định tính bằng sắc ký lớp mỏng, so sánh với chất chuẩn peiminin hoặc dược liệu chuẩn Xuyên bối mẫu [23] Định lượng tổng hàm lượng alcaloid tính theo sibeimin C27H43NO3 không được thấp hơn 0,05 % tính theo dược liệu khô kiệt [23]

1.4.3.1 Tên khoa học: Tuber Corydalis

Rễ củ phơi hay sấy khô cùa câv Diên hồ sách [Corydalis yanhusuo (Y H Chou & Chun c Hsu) W T Wang], họ Thuốc phiện (Papaveraceae) [8], [5], [10]

- Alcaloid chủ yếu: dehydrocorydalin, corydalin, tetrahydropalmatin, palmatin columbamin, protopin, leonticin, … [10], [39] Hiện nay có 80 alcaloid đã phân lập từ rễ củ Diên hồ sách [22]

Tác dụng dược lý của Bài thuốc dạ dày YB theo Y học hiện đại

Theo Y học hiện đại, để điều trị bệnh trong bài thuốc là sự phối hợp hiệp đồng của tất cả các vị dược liệu Trong bài thuốc dạ dày nghiên cứu có tác dụng đa dạng với nhiều cơ chế hiệp đồng cùng nhau Cam thảo có tác dụng chống viêm Bạch cập có tác dụng chống viêm, cầm máu, ngoài ra chất nhầy trong bạch cập có tác dụng chống viêm, bao vết loét, làm lành vết thương thúc đẩy phục hồi Bối mẫu, diên hồ sách có tác dụng chống viêm đồng thời giúp giảm đau, giảm triệu chứng Đại hoàng có tác dụng chống viêm, giảm acid dạ dày thông qua cơ chế giống như ức chế bơm proton như thuốc hiện đại Ô tặc cốt có tác dụng trung hòa acid dạ dày, chống chảy máu

Có thể thấy các vị thuốc trong bài thuốc tác dụng theo nhiều cơ chế, đặc biệt có những cơ chế như bao vết loét, ức chế bơm proton, trung hòa dịch vị tương tự như các thuốc hiện đại đang sử dụng để điều trị viêm loét dạ dày Một số vị thuốc như đại hoàng, bối mẫu, ô tặc cốt tuy không phải là quân, thần theo lý luận y học cổ truyền nhưng có vai trò quan trọng trong bài thuốc theo lý luận y học hiện đại do đảm nhiệm những cơ chế dược lý chống loét dạ dày khác với các vị thuốc còn lại, từ đó gây tác dụng hiệp đồng, tăng cường khả năng chữa bệnh của bài thuốc.

Phương pháp điều chế cao khô

Cao thuốc là chế phẩm được điều chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy định các dịch chiết thu được từ dược liệu thực vật hay động vật với các dung môi thích hợp Các dược liệu trước khi chiết xuất được xử lý sơ bộ (rửa sạch, phơi khô hoặc sấy khô và chia nhỏ đến kích thước thích hợp) Đối với một số dược liệu đặc biệt có chứa men làm phân hủy hoạt chất, cần phải diệt men trước khi đưa vào sử dụng bằng cách dùng hơi cồn sôi, hơi nước sôi hoặc bằng phương pháp thích hợp khác [8]

Cao khô là khối bột hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm Cao khô không được có độ ẩm lớn hơn 5 % [8]

1.6.2 Phương pháp điều chế cao khô

Chiết xuất dược liệu bằng các dung môi thích hợp Tùy theo bản chất của dược liệu, dung môi, tiêu chuẩn chất lượng của thành phẩm cũng như điều kiện, quy mô sản xuất và trang thiết bị, có thể sử dụng các phương pháp chiết xuất: ngâm, hãm, sắc, ngấm kiệt, chiết xuất ngược dòng, chiết xuất bằng thiết bị siêu âm, chiết xuất bằng phương pháp sử dụng điện trường và các phương pháp khác [8]

Giai đoạn 2: Cô đặc, sấy

Dịch chiết được cô đặc đến khi dung môi dùng để chiết xuất còn lại không quá

20 % được cao đặc, tiếp tục sấy khô để độ ẩm còn lại không quá 5 % thu được cao khô Để đạt đến thể chất quy định, quá trình cô đặc và sấy khô dịch chiết thường được tiến hành trong các thiết bị cô dưới áp suất giảm ở nhiệt độ không quá 60 o C Nếu không có các thiết bị cô đặc và sấy dưới áp suất giảm thì được phép cô cách thủy (không được cô trực tiếp trên lửa) và sấy ở nhiệt độ không quá 80 o C Trường hợp muốn thu được cao thuốc có tỷ lệ tạp chất thấp, phải tiến hành loại tạp chất bằng các phương pháp thích hợp tùy thuộc vào bản chất của dược liệu, dung môi và phương pháp chiết xuất [8]

1.6.3 Yêu cầu chất lượng với cao khô

- Mùi vị, độ đồng nhất và màu sắc: cao thuốc phải đúng màu sắc đã mô tả trong chuyên luận riêng, có mùi và vị đặc trưng của dược liệu sử dụng [8]

- Mất khối lượng do làm khô (nếu không có chỉ dẫn khác): không quá 5 % [8]

- Kim loại nặng: không được quá 20 phần triệu nếu không có chỉ dẫn khác Cách tiến hành: Lấy 1,0 g chế phẩm tiến hành thử theo phương pháp 3, Phụ lục 9.4.8 – DĐVN

V Dùng 2 mL dung dịch chì mẫu 10 phần triệu Pb (TT) để chuẩn bị mẫu đối chiếu [8]

- Dung môi tồn dư: nếu điều chế với dung môi không phải là cồn, nước hay hỗn hợp cồn - nước, dư lượng dung môi sử dụng phải đáp ứng yêu cầu qui định trong Phụ lục 10.14 Xác định dung môi tồn dư – DĐVN V [8]

- Dư lượng hóa chất bào vệ thực vật: đáp ứng yêu cầu quy định trong Phụ lục 12.17

Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật – DĐVN V [8]

- Giới hạn nhiễm khuẩn: đáp ứng yêu cầu qui định trong Phụ lục 13.6 Thử giới hạn nhiễm khuẩn – DĐVN V [8]

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng, phương tiện nghiên cứu

Các vị thuốc Bạch cập (Rhizoma Bletillae), Xuyên bối mẫu (Bullus Fritillariae cirrlosac), Diên hồ sách (Tuber Corydalis yanhusuo), Đại hoàng (Rhiroma Rhei), Cam thảo (Radix et Rhiroma Glycyrrhizae) đạt tiêu chuẩn DĐTQ 2020 [23]; Ô tặc cốt (Os

Sepiae) đạt tiêu chuẩn DĐVN V [8] (Phụ lục 1) Các vị thuốc trong phương thuốc được cung cấp bởi Công ty TNHH Đông Dược Dân Lợi được trình bày ở Hình 2.1

Hình 2.1 Các vị thuốc của bài thuốc dạ dày YB

Chú thích: 1 Vị thuốc Bạch cập 2 Vị thuốc Xuyên bối mẫu

3 Vị thuốc Đại hoàng 4 Vị thuốc Diên hồ sách

5 Vị thuốc Cam thảo 6 Vị thuốc Ô tặc cốt

- Tủ sấy Memmerk, Shellab (Đức)

- Cân phân tích Sartorius – TE214S (Đức)

- Cân kỹ thuật Precisa – XB320C (Thụy Sĩ)

- Đèn tử ngoại Viber Lourmat (Pháp)

- Máy siêu âm, ống sinh hàn hồi lưu

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Shimadzu bao gồm: Bơm LC-30AD, detector SPD-M20A DAD, hệ thống tiêm mẫu tự động SIL-30AC, bộ phận ổn định nhiệt CTO-10AS của Shimadzu

- Pipet chính xác các loại, micro pipet và các dụng cụ thủy tinh cần thiết khác

- Hóa chất đạt tiêu chuẩn phân tích, được mua tại Công ty TNHH Sela, 48 dốc Thọ Lão, phường Đống Mác, quận Hai Bà Trưng, Hà Nội: ethanol tuyệt đối, n-hexan, ethyl acetat, n-butanol, acid formic, methanol, cloroform, …

- Acetonitril, Methanol: loại dùng cho HPLC của Merk

- Chất chuẩn: militarin (C34H46O17) hàm lượng ≥ 98% (99,089%) công ty Wuhan ChemFaces Biochemical Co., Ltd, số mẫu CFN90409.

Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng militarin trong cao khô

Bạch cập và cao khô bài thuốc dạ dày YB bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Nội dung 2: Nghiên cứu điều chế cao khô bài thuốc dạ dày YB

Nội dung 3: Khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng cao khô bài thuốc dạ dày YB

- Định tính một số thành phần hóa học của cao khô bài thuốc dạ dày YB bằng sắc ký lớp mỏng

- Định lượng militarin có trong cao khô bài thuốc dạ dày YB bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xây dựng phương pháp định lượng militarin trong cao khô Bạch cập, cao khô bài thuốc dạ dày YB bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

2.3.1.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn militarin

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc:

Cân chính xác 10,00 mg chất chuẩn militarin vào bình định mức 25 mL thêm 20 mL MeOH, siêu âm 15 phút và định mức đến vạch bằng MeOH thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 400 ppm

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn trung gian:

Hút chính xác 5 mL dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 20 mL Bổ sung đến vạch bằng MeOH thu được dung dịch chuẩn trung gian có nồng độ khoảng 100 ppm

Xây dựng dãy đường chuẩn có nồng độ như bảng dưới đây:

Bảng 2.1 Cách pha dung dịch để xây dựng đường chuẩn định lượng militarin

Nồng độ militarin cần pha

Thể tích dung dịch chuẩn trung gian (mL) 1 1 1 2 8

18 Sau đú, lọc cỏc mẫu trờn qua màng lọc 0,45 àm vào vial sạch

2.3.1.2 Chuẩn bị mẫu cao nghiên cứu

❖ Chuẩn bị các vị thuốc:

Bạch cập, Bối mẫu, Diên hồ sách, Đại hoàng, Cam thảo, Ô tặc cốt: Loại bỏ tạp chất, rửa sạch, sấy khô Sau đó tiến hành xay nghiền vị dược liệu và rây qua lỗ rây kích thước 1400 μm để được kích thước thô

Xác định độ ẩm của các dược liệu làm nguyên liệu bằng phương pháp mất khối lượng do làm khô, yêu cầu đạt tiêu chuẩn DĐVN V [8]

• Điều chế cao lỏng Bạch cập

Cân khoảng 20 g Bạch cập vào bình nón có nút màu với dung tích 500 mL Thêm khoảng 140 mL dung môi là EtOH 70 % (tỉ lệ dược liệu/dung môi là 1/7) Đem chiết siêu âm ở nhiệt độ 40 C với thời gian 50 phút Tiến hành chiết 2 lần, sau đó lọc, ép bã, gộp dịch và cô đến cắn trên thiết bị cô quay Hòa lại với 20 mL EtOH 70 % được cao lỏng Bạch cập

• Điều chế chất nhầy có trong Bạch cập

Lấy bã dược liệu thu được ở phần chiết cao khô Bạch cập Chiết siêu âm trong 60 phút ở 80 o C, 2 lần; lần 1 với 400 mL nước và lần 2 với 200 mL nước (tỉ lệ dược liệu/dung môi lần lượt là 1/20 và 1/10) Thỉnh thoảng dùng đũa thủy tinh đảo trộn Sau mỗi lần chiết, tiến hành lọc, ép bã, gộp dịch Cô đến thể tích khoảng 200 mL trên thiết bị cô quay Đổ một lượng EtOH 96 % vào dịch chiết vừa cô đến thể tích gấp 3 lần, ly tâm thu lấy tủa được chất nhầy Bạch cập

• Điều chế cao lỏng Xuyên bối mẫu, Diên hồ sách

Cân khoảng 40 g từng dược liệu vào 2 bình nón có nút mài với dung tích 500 mL Tiến hành ngâm 24 giờ mỗi dược liệu với 40 mL giấm ăn trước khi đem đi chiết Sau đó chiết siêu âm 2 lần mỗi lần với 28 mL nước (tỉ lệ dược liệu/dung môi là 1/7), tiến hành trong 60 phút và ở 80 C Lọc, ép bã, gộp dịch chiết thu được sau 2 lần rồi đem đi cô quay đến thể tích khoảng 50 mL Sau đó thêm lượng EtOH 96 % thích hợp để được EtOH 50 % Lọc và cô đến cắn trên thiết bị cô quay Hòa cắn với 20 mL EtOH 50 % thu được cao lỏng Xuyên bối mẫu và cao lỏng Diên hồ sách

• Điều chế cao lỏng Đại hoàng

Cân khoảng 20 g Đại hoàng vào bình nón có nút mài với dung tích 500 mL Chiết hồi lưu cách thủy 2 lần mỗi lần 60 phút Lần 1 với khoảng 160 mL EtOH 70 %, lần 2 với 100 mL EtOH 70 % (tỉ lệ dược liệu/dung môi lần lượt là 1/8 và 1/5) Lọc, ép bã, gộp dịch chiết và cô đến cắn trên thiết bị cô quay Hòa lại với 20 mL EtOH 70 % được cao lỏng Đại hoàng [51]

• Điều chế cao lỏng Cam thảo

19 Cân khoảng 20 g Cam thảo vào bình nón có nút màu với dung tích 500 mL với dung môi EtOH 70 % Thêm khoảng 140 mL dung môi là EtOH 70 % (tỉ lệ dược liệu/dung môi là 1/7 Đem chiết siêu âm ở nhiệt độ 40 C với thời gian 60 phút Tiến hành chiết 2 lần, sau đó lọc, ép bã, gộp dịch và cô đến cắn trên thiết bị cô quay Hòa lại với 20 mL EtOH 70 % được cao lỏng Cam thảo

❖ Điều chế cao khô Bạch cập và cao khô bài thuốc dạ dày YB

Sau khi điều chế cao lỏng các vị thuốc và chất nhầy Bạch cập ở trên Tiến hành sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 70 C đến hàm ẩm dưới 5 % thu được chất nhầy Bạch cập khô, cao khô Bạch cập và cao khô các vị dược liệu khác tương ứng

Tiến hành trộn cao khô các vị thuốc, chất nhầy Bạch cập và Mai mực tương ứng theo tỉ lệ tương ứng của hiệu suất chiết cao và công thức bài thuốc (mục 1.3.2) được cao khô bài thuốc dạ dày YB

2.3.1.3 Chuẩn bị mẫu thử làm việc

Cân chính xác khoảng 0,1000 g cao Bạch cập vào bình định mức 100 mL Thêm khoảng 80 mL EtOH 70 %, siêu âm trong 30 phút Định mức đến vạch bằng EtOH 70

% Ly tâm ở 6000 rpm trong 5 phút Lấy 1 mL dịch nổi phía trên vào bình định mức 10 mL, định mức đến vạch bằng dung môi thích hợp theo khảo sát Lọc qua màng lọc 0,45 àm vào vial sạch thu được dung dịch thử của cao đơn Bạch cập

❖ Cao khô bài thuốc dạ dày YB

Cân chính xác khoảng 1,5 g cao khô bài thuốc dạ dày YB vào bình định mức 100 mL Thêm khoảng 80 mL EtOH 70 %, siêu âm trong 30 phút Định mức đến vạch bằng EtOH 70 % Ly tâm ở 6000 rpm trong 5 phút Lấy 1 mL dịch nổi phía trên vào bình định mức 10 mL, định mức đến vạch bằng dung môi thích hợp theo khảo sát Lọc qua màng lọc 0,45 àm vào vial sạch thu được dung dịch thử của cao đơn Bạch cập

❖ Placebo cao đơn Bạch cập

Cân chính xác khoảng 0,1000g cao Bạch cập vào bình nón dung tích 100 mL Thêm 50 mL EtOH 70 % và 50 mg NaOH, đun hồi lưu cách thủy trong 30 phút Sau đó trung hòa bằng 2mL dung dịch HCOOH 2M Để nguội rồi đổ vào bình định mức 100 mL, tráng bình nón và định mức đến vạch bằng EtOH 70 % Ly tâm ở 6000 rpm trong

5 phút Lấy 1 mL dịch nổi phía trên vào bình định mức 10 mL, định mức đến vạch bằng dung mụi thớch hợp theo khảo sỏt Lọc qua màng lọc 0,45 àm vào vial sạch thu được dung dịch placebo cao đơn Bạch cập

❖ Placebo cao khô bài thuốc dạ dày YB

Làm tương tự như mẫu thử làm việc của cao bài thuốc dạ dày YB nhưng không phối hợp thành phần cao đơn Bạch cập và chất nhầy Bạch cập

2.3.1.4 Khảo sát điều kiện chạy sắc ký

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Kết quả xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng militarin trong cao khô Bạch cập và trong cao khô Bài thuốc

3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký

3.1.1.1 Lựa chọn bước sóng phát hiện

Phân tích mẫu chuẩn militarin C3 (mục 2.3.1.1) và ghi phổ trong khoảng 190 –

400 nm Kết quả cho thấy militarin hấp thụ cực đại ở bước sóng 222nm nên chúng tôi lựa chọn bước sóng 222nm để lấy sắc ký đồ

Hình 3.1 Hình ảnh phổ của militarin trong khoảng 190 – 400 nm 3.1.1.2 Khảo sát hệ

Kết quả khảo sát 3 hệ pha động tiến hành khi phân tích mẫu thử cao khô Bài thuốc theo mục 2.3.1.4 được thể hiện qua Hình 3.2 dưới đây:

- Đối với hệ I theo Dược điển Hồng Kông nhận thấy độ phân giải của pic militarin so với pic liền kề kém nhất, đồng thời gian phân tích 60 phút tương đối dài

Hình 3.2 Kết quả khảo sát pha động sắc ký

- Hệ II theo Dược điển Trung Quốc, tại thời gian lưu ứng với militarin chỉ xuất hiện một pic militarin nhưng đồ thị độ tinh sạch (purity) pic cho thấy pic militarin không tách hoàn toàn khỏi các chất tạp khác Ngoài ra, chạy đẳng dòng với nồng độ dung môi hữu cơ thấp sẽ cần thời gian chạy dài để rửa giải tạp chất khỏi cột (do là cao toàn phần của nhiều loại dược liệu khác nhau nên thành phần hóa học đa dạng) để thuận lợi cho quá trình chạy theo chế độ batch

- Hệ III nhận thấy độ phân giải pic militarin tách tốt so với hê I, chân pic gọn, thời gian chạy ngắn hơn Tuy nhiên, độ phân giải Rs chưa đạt 1,5

Do vậy, chúng tôi chọn hệ III và tiến hành khảo sát dung môi pha loãng mẫu với mục đích loại tạp để loại tạp

3.1.2 Khảo sát dung môi pha loãng mẫu

Phân tích mẫu thử cao khô Bài thuốc khảo sát các dung môi pha loãng mẫu bao gồm: EtOH 70 %, nước, dung dịch FeCl35% trong nước theo mục 2.3.1.5 Kết quả khảo sát loại tạp được thể hiện qua Hình 3.3 dưới đây:

- Nếu dung môi pha loãng mẫu là EtOH70 % (Hình 3.3a) và dung môi pha loãng mẫu là nước (Hình 3.3b) thì pic militarin không đạt độ phân giải giữa 2 pic liền kề

- Hình 3.3c với dung môi pha loãng mẫu là FeCl3 5% trong nước, nhận thấy pic militarin có độ phân giải tốt so với pic liền kề (Rs >1,5), đồng thời pic tạp liền kề có diện tích pic giảm đáng kể, purity (hình 3.3d) đạt yêu cầu

Do đó, chúng tôi chọn dung môi pha loãng mẫu là FeCl3 5 % với mục đích loại tạp Điều này có thể giải thích là do FeCl3 5% tạo phức kết tủa với các acid hữu cơ, các

Hình 3.3 Kết quả khảo sát dung môi pha loãng mẫu

30 gốc phenol nên giúp loại bỏ tạp chất, từ đó làm giảm hoặc thậm chí mất pic của các chất tạo phức trên sắc ký đồ HPLC Điều đó, đã được Yasuda và cộng sự chứng minh qua việc sử dụng các ion Fe 2+ , Fe 3+ , Cu 2+ gây ảnh hưởng đến kết quả HPLC của các catechin trong lá chè [34]

Vì loại tạp bằng FeCl3 5% nên pha động phải có tính acid để tránh kết tủa trong cột Chúng tôi chọn hệ pha động có chứa acid formic vì không gây kết tủa với FeCl3 5% như acid phosphoric, đồng thời lamda cutoff formic nhỏ hơn 223 nm trong khi lamda cutoff của acid khác thường được sử dụng trong HPLC như acid acetic là 235 nm [3]

Vì điều kiện sắc ký đã lựa cho cao khô Bài thuốc cho thấy tách pic militarin tốt Nên chúng tôi tiến hành áp dụng quy trình và hệ pha động của cao khô Bài thuốc cho cao đơn Bạch cập để định lượng militarin có trong cao Bạch cập Kết quả cho thấy pic militarin gọn, tách tốt đạt hệ số phân giải và purity được thể hiện qua Hình 3.4

Hình 3.4 Sắc ký đồ cao đơn Bạch cập theo hệ đã lựa chọn

3.1.3 Thẩm định quy trình định lượng

❖ Cao khô Bài thuốc dạ dày YB

Chú thích: 1 Dung môi; 2 Placebo Bài thuốc; 3 Chuẩn militarin

4 Mẫu thử Bài thuốc; 5 Mẫu thử thêm chuẩn Bài thuốc dạ dày

Hình 3.5 Kết quả thẩm định độ đặc hiệu phương pháp định lượng cao Bài thuốc

Chú thích: 1 Dung môi; 2 Placebo Bạch cập; 3 Chuẩn militarin

4 Mẫu thử Bạch cập; 5 Mẫu thử thêm chuẩn Bạch cập

Trên sắc ký đồ của dung dịch mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn của cao đơn Bạch cập và cao Bài thuốc đều cho pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn militarin Các pic trên sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn của cao đơn Bạch cập và cao Bài thuốc tách nhau hoàn toàn khỏi các pic khác, pic cân đối, rõ nét Trong khi đó, trên sắc ký đồ của mẫu dung môi và mẫu placebo của cao đơn Bạch cập và cao Bài thuốc, không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn militarin Mặt khác, phổ của pic mẫu thử và mẫu chuẩn của cao Bài thuốc và cao đơn Bạch cập lần lượt cho kết quả hệ số chồng phổ đạt 0,9942 và 0,9990 (> 0,99) Do đó phương pháp đảm bảo độ chọn lọc, đặc hiệu

3.1.3.2 Độ thích hợp hệ thống

Tiến hành tiêm 6 lần dung dịch chuẩn militarin có nồng độ C3 (mục 2.3.1.1) Ghi lại về diện tích pic, thời gian lưu và số đĩa lý thuyết Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát tính thích hợp hệ thống

Thời gian lưu (phút) Số đĩa lý thuyết

Hình 3.6 Kết quả thẩm định độ đặc hiệu phương pháp định lượng cao Bạch cập

- Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu, diện tích pic militarin rong mẫu chuẩn lần lượt là 0,37%; 0,72% Các giá trị thu được RSD thời gian lưu < 1%, RSD diện tích pic < 2% Số đĩa lý thuyết trung bình 9353,30 > 5000 (theo dược điển Hồng Kông)

- Như vậy có thể thấy, điều kiện sắc ký lựa chọn có độ lặp lại cao về thời gian lưu, diện tích pic và số đĩa lý thuyết, nên hệ thống HPLC sử dụng có sự tương thích hệ thống tốt, phù hợp cho phép định lượng militarin trong cao khô Bạch cập và cao khô Bài thuốc và đạt yêu cầu theo AOAC [18]

Cân được chính xác 10,0300 mg chất chuẩn militarin với độ tinh khiết 99,089%

Từ dung dịch gốc, tiến hành pha loãng thành dãy chuẩn làm việc ở các nồng độ khác nhau như mục 2.3.1.1 Sau đó, tiến hành tiêm vào hệ thống HPLC Thiết lập phương trình tương quan của diện tích pic và nồng độ militarin theo phương trình hồi quy tuyến tính Kết quả thu được thể hiện trong Bảng 3.2 và Hình 3.7

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính

Phương trình hồi quy tuyến tính: y = 92134x – 86920

R 2 = 0,9991 Trong đó: y: diện tích pic (mAU.s) x: nồng độ militarin (ppm) Độ chệch (%)

Hệ số b 86920 Đồ thị biểu diến mối tương quan giữa nồng độ militarinvà diện tích pic trong khoảng nồng độ khảo sát từ 4,95 ppm đến 79,27 ppm

Kết quả nghiên cứu điều chế Bài thuốc

3.2.1 Điều chế các vị thuốc Xuyên bối mẫu, Diên hồ sách, Đại hoàng, Cam thảo, Chất nhầy Bạch cập

- Mẫu nghiên cứu: dược liệu Xuyên bối mẫu, Diên hồ sách, Đại hoàng, Cam thảo, Chất nhầy Bạch cập được tiến hành như mục 2.3.1.2

- Kết quả nghiên cứu về độ ẩm, hiệu suất chiết cao khô các vị thu được ở bảng 3.7, hình ảnh cao khô các vị thể hiện ở hình 3.7

Bảng 3.7 Khối lượng cao, hiệu suất bào chế, độ ẩm của từng vị thuốc

Khối lượng dược liệu (g) Độ ẩm dược liệu (%)

Khối lượng dược liệu thực tế (g)

Khối lượng cao (g) Độ ẩm cao khô (%)

Khối lượng cao khô thực tế (g)

Diên hồ sách 40,9534 13,2 35,5476 3,9063 3,01 3,7887 10,66 Đại hoàng 20,5750 11,4 18,2295 4,0516 4,51 3,8689 21,22

Cao khô Bối mẫu có màu nâu, đậm, mùi thơm, để lâu dễ hút ẩm

Cao khô Diên hồ sách có màu vàng cam, mùi thơm, để lâu dễ hút ẩm

Cao khô Đại hoàng có màu nâu ánh đỏ, mùi thơm, để lâu dễ hút ẩm

Cao cam thảo có màu vàng đất, mùi thơm, để lâu dễ hút ẩm

Chất nhầy Bạch cập có màu nâu sau khi đem sấy khô ở 70 độ

Hình 3.7 Hình ảnh, màu sắc, mô tả mùi của từng cao vị thuốc

3.2.1.1 Cao khô Xuyên Bối mẫu, Diên hồ sách

❖ Vì các hoạt chất chính trong Xuyên bối mẫu và Diên hồ sách là alcaloid như trình bày ở mục 1.4.2 Nên chúng tôi tiến hành ngâm giấm trong 24 giờ, nhằm chuyển dạng các alcaloid về dạng muối để thuận lợi cho quá trình chiết nước Ngoài ra, còn mục đích để làm trương nở dược liệu giúp tăng hiệu suất chiết

❖ Sử dụng phương pháp siêu âm giúp thành tế bào bị phá hủy, đồng thời đẩy nhanh quá trình giải phóng và khuếch tán các thành phần trong tế bào, giảm thiểu thời gian chiết Chiết ở nhiệt độ cao 80 C do nước có độ nhớt lớn, ở nhiệt độ cao thì độ nhớt giảm xuống, ngoài ra, còn giúp tăng cường đảo khối khuếch tán giúp việc chiết xuất nhanh hơn

❖ Do chiết nước, dịch chiết sẽ hòa tan nhiều các tạp chất có bản chất protein và polysaccharid nhưng chúng không có nhiều tác dụng sinh học nên tiến hành loại bỏ bằng EtOH cao độ

❖ Sau 2 lần chiết chúng tôi tiến hành kiểm tra bã bằng cách lấy khoảng 0,2 g bã dược liệu vào ống ly tâm, thêm 20 mL nước siêu âm trong 15 phút, gạn dịch trong vào ống nghiệm Nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendoff vào ống nghiệm, nhận thấy không xuất hiện kết tủa nên chúng tôi nhận định rằng trong bã dược liệu không còn nhiều alcaloid, nên việc chiết tiếp không đem lại hiệu quả kinh tế Do đó, dừng lại ở chiết xuất 2 lần

Các hoạt chất chính trong Đại hoàng là các anthranoid nên nhóm nghiên cứu chúng tôi tham khảo tài liệu [51] tiến hành như mục 2.3.3.1

❖ Các hoạt chính có tác dụng trong cam thảo là saponin với thành phần chính là acid glycyrrhizic và flavonoic với 2 thành phần chủ yếu liquiritin và isoliquiritin (mục 1.4.5)

❖ Theo TLTK [49]: Điều kiện chiết xuất tối ưu đối với acid glycyrrhizic và liquiritin là chiết hồi lưu ở 70 độ C với dung môi là EtOH 70 %, tỉ lệ dung môi/dược liệu là 1/25 và thời gian chiết là 1,5 giờ Tuy nhiên cách chiết xuất này tốn nhiều dung môi và năng lượng nên chúng tôi đã khảo sát sử dụng phương pháp chiết hỗ trợ siêu âm, chiết 2 lần, mỗi lần với lượng EtOH 70 % gấp 7 lần so với lượng dược liệu, thời gian chiết 45 phút

❖ Sau 2 lần chiết, chúng tôi tiến hành kiểm tra bã bằng cách lấy khoảng 0,2 g bã dược liệu vào ống ly tâm Thêm 20 mL MeOH siêu âm trong 15 phút, gạn dịch trong vào ống nghiệm Thêm từ từ H2SO4 đặc vào thành ống nghiệm Nhận thấy, ở lớp ngăn cách xuất hiện vệt màu nhạt không đáng kể nên chúng tôi nhận định rằng trong bã dược liệu không còn nhiều saponin và flavonoid nên việc chiết tiếp không đem lại hiệu quả kinh tế

❖ Cách chiết polysaccharid được tiến hành theo TLTK [53], [46]

38 Đầu tiên, dược liệu cần được chiết bằng cồn cao độ để loại bỏ sắc tố, lipid, oligosacarid và các chất phân tử nhỏ khác Do đó, có thể tận dụng bã dược liệu Bạch cập thu được trong quá trình chiết cao khô Bạch cập để đảm bảo hiệu quả kinh tế Phương pháp chiết thường được lựa chọn là phương pháp ngâm nóng Tuy nhiên, do thiếu các thiết bị khuấy trộn hiệu quả và thực tế bã dược liệu Bạch cập khi ngâm nóng có hiện tượng dính tạo khối nên chúng tôi sử dụng phương pháp chiết hỗ trợ siêu âm nhằm tận dụng khả năng đảo trộn của sóng siêu âm Qua khảo sát sơ bộ, chúng tôi chọn thể tích chiết lần lượt là 20 lần và 10 lần khối lượng dược liệu ban đầu để đảm bảo dịch chiết có độ nhớt phù hợp, có thể lọc được trên thiết bị lọc áp suất giảm Sau đó chất nhầy cần được kết tủa bằng cách tăng nồng độ cồn, để tiết kiệm dung môi chúng tôi tiến hành cô dịch chiết nước trên thiết bị cô quay để được lượng nước còn khoảng 200 mL Đổ 1 lượng cồn 96 tương ứng 2 lần thể tích thu được các tủa polysaccharid dạng bông trắng nổi phía trên Sau đó ly tâm và sấy thu được chất nhầy

3.2.2 Điều chế cao khô Bạch cập

Hàm lượng militarin trong dược liệu Bạch cập được xác định là 3.1% (PL1)

3.2.2.1 Kết quả khảo sát mốt số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất làm cao khô Bạch cập

Khảo sát ảnh hưởng của 3 yếu tố: Dung môi chiết xuất, số lần chiết xuất, thời gian chiết xuất, bằng phương pháp OFAT Thông số đánh giá là hiệu suất chiết militarin toàn phần trong cao chiết từ dược liệu Kết quả khảo sát các yếu tố như sau:

➢ Khảo sát dung môi chiết

Tiến hành theo mục 2.3.3.2 Các nồng độ ethanol được khảo sát là: 30 %, 50 %, 70 % và 90 % Kết quả của quá trình khảo sát được thể hiện qua hình 3.8

Hình 3.8 Kết quả khảo sát dung môi chiết xuất

Hiệu suất chiết militarin toàn phần sử dụng dung môi Ethanol có nồng độ thay đổi từ 30 %, 50 %, 70 % và 90 % (tt/tt) dao động trong khoảng 45,39% đến 67,02% Khi thay đổi nồng độ ethanol từ 30 % lên 70 % hiệu suất chiết militarin tăng từ 45.39% lên 67,02% Sau đó, tiếp tục tăng nồng độ ethanol lên 90 % thì hiệu suất chiết lại giảm xuống 55,79%

39 Ở khảo sát này, dung môi có nồng độ EtOH 70 % là dung môi cho hiệu suất chiết militarin cao nhất nên được lựa chọn làm dung môi chiết xuất điều chế cao khô

Khảo sát thời gian chiết được tiến hành theo mục 2.3.3.2 Các khoảng thời gian được khảo sát là: 30 phút, 50 phút, 70 phút và 90 phút Kết quả của quá trình khảo sát được thể hiện qua Hình 3.9

Hình 3.9 Kết quả khảo sát thời gian chiết xuất

Nhận thấy giữa các khoảng thời gian khảo sát, hiệu suất chiết militarin dao động trong khoảng từ 67,43% đến 76,22% Khi tăng thời gian chiết xuất từ 30 phút lên 50 phút, hiệu suất chiết tăng từ 67,43% lên 76,22% (gấp 1,13 lần) Tuy nhiên khi tiếp tục tăng thời gian chiết lên 70 phút, 90 phút thì hiệu suất chiết lại giảm xuống còn 74,05%; 73,95% Như vậy, với thời gian chiết 50 phút cho hiệu suất chiết militarin cao nhất trong số các giá trị khảo sát, nên được lựa chọn làm thời gian chiết xuất để điều chế cao khô Bạch cập

Khảo sát số lần chiết được tiến hành theo mục 2.3.3.2 Kết quả của quá trình khảo sát được thể hiện qua Hình 3.10

Hình 3.10 Kết quả khảo sát số lần chiết xuất

Nhận thấy, hiệu suất chiết militarin thu hồi qua 2 lần đạt > 80 % nên chúng tôi lựa chọn chiết xuất 2 lần để điều chế cao khô Lý do không chọn chiết 3 lần vì lần thứ 3 hiệu suất militarin 5,80 % thấp không có ý nghĩa để chiết tiếp

Từ các kết khảo sát trên, nhóm nghiên cứu lựa chọn các điều kiện chiết xuất để điều chế cao khô Bạch cập gồm:

➢ Phương pháp chiết xuất: siêu âm

➢ Dung môi chiết xuất: EtOH 70 %

➢ Thời gian chiết xuất: 50 phút

➢ Tỉ lệ dung môi/ dược liệu: 1/7 (g/ml)

3.2.2.2 Điều chế cao khô Bạch cập từ các yếu tố đã khảo sát

Từ các yếu tố đã khảo sát ở mục 3.2.2.1, bước đầu tiến hành chiết xuất ở các điều kiện đã lựa chọn Tiến hành chiết xuất và và tạo cao khô Bạch cập ở quy mô 20 g dược liệu

Cách tiến hành: như mục 2.3.1.2 theo các yếu tố đã khảo sát

Kết quả thu được: thể hiện ở Bảng 3.8 và Hình 3.11

Bảng 3.8 Khối lượng cao, hàm lượng, hiệu suất chiết militarin trong Bạch cập

Khối lượng cao (g) Độ ẩm cao khô (%)

Hàm lượng militarin trong cao (%)

Thể chất, màu sắc, mùi vị

Dạng bột khô, dễ hút ẩm, màu nâu đất

3.2.3 Điều chế cao khô bài thuốc dạ dày YB

Sau khi có cao khô các vị thuốc đã điều chế như trên, tiến hành phối hợp theo công thức bài thuốc quy đổi tương ứng về khối lượng cao thu được công thức tương ứng với 1 liều của bài thuốc dạ dày YB như bảng 3.9:

Hình 3.11 Hình ảnh cao khô Bạch cập sau khi điều chế

Bảng 3.9 Công thức bài thuốc dạ dày YB tính theo 1 liều

Tên vị thuốc Khối lượng cao (mg)

Cam thảo 549 Đại hoàng 127 Ô tặc cốt 1200

Định tính các vị thuốc trong cao khô bài thuốc dạ dày YB bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM)

3.3.1 Xây dựng phương pháp định tính các vị thuốc trong cao khô Bài thuốc bằng SKLM

3.3.1.1 Vị thuốc Bạch cập a Khảo sát phương pháp chiết:

Theo TLTK [29], militarin trong Bài thuốc chứa các vị (Bạch chỉ, Cam thảo, Diên hồ sách, Bạch cập, Tam thất, Mai mực, Cà dược) được chiết bằng bằng BuOH bão hòa nước và loại tạp bằng NH3 đặc Vì vậy, chúng tôi khảo sát 3 quy trình như sau:

• Quy trình 1: Tiến hành như trên chiết bằng BuOH bão hòa nước nhưng không loại tạp

• Quy trình 2: Chiết bằng BuOH bão hòa nước và loại tạp bằng NH3

• Quy trình 3: Chiết bằng BuOH bão hòa nước loại tạp bằng dd FeCl3 2% với nguyên lý là FeCl3 tạo phức hoặc kết tủa với các acid hữu cơ, các hợp chất có gốc phenol

❖ Chuẩn bị các mẫu thử:

- Các mẫu cao khô Bài thuốc được cân vào 3 bình nón riêng biệt, chiết trong cùng một điều kiện theo từng phương pháp chiết như sau:

+ Phương pháp 1: Cân khoảng 2 g cao khô bài thuốc vào bình nón, thêm 30 mL BuOH bão hòa trong nước, siêu âm 15 phút rồi lọc vào bình cầu Cô cạn dịch lọc trên thiết bị cô quay chân không, hòa tan cắn trong 2 mL MeOH thu được dịch chấm sắc ký + Phương pháp 2: Cân khoảng 2 g cao khô bài thuốc vào bình nón, thêm 30 mL BuOH bão hòa trong nước, siêu âm 15 phút Lọc dịch vào bình gạn Lắc loại tạp với 20 mL dung dịch NH3 đặc Để tách lớp và lấy lớp BuOH đem cô đến cắn trên thiết bị cô quay chân không Hòa lại cắn bằng 2 mL MeOH để thu dung dịch chấm sắc ký

+ Phương pháp 3: Tiến hành như phương pháp chiết 2 nhưng thay dung dịch NH3 đặc bằng dung dịch FeCl3 2 %

- Dung dịch chất chuẩn gốc militarin nồng độ 400 ppm: mục 2.3.1.1

❖ Tiến hành: Chạy sắc ký trong cùng điều kiện với thể tích chấm 10 μL, hệ pha động EA: Aceton: MeOH: H 2 O (10,5:3:1,5:0,5) Sau khi khai triển lấy bản mỏng ra

42 ngoài để khô và nhúng dung dịch H2SO4 10 %/ EtOH 96% (TT) Sấy bản mỏng ở 105 độ C trong 5 phút, quan sát ở ánh sáng thường

❖ Kết quả: Khảo sát phương pháp chiết Bạch cập được thể hiện ở Hình 3.12

+ Quy trình 1: các vết thu được không tách rời, đặc biệt nhận thấy, ở vị trí Rf của tương ứng với militarin bị dính vết

+ Quy trình 2 và quy trình 3: vết thu được ở vị trí Rf tương ứng với chuẩn militarin tách rõ ràng, nên cả 2 quy trình đều có thể chiết được militarin trong Bài thuốc Nhưng dung dịch NH3 đắt tiền và độc hại hơn FeCl3 2% Do đó, quy trình 3 được lựa chọn chiết cao khô Bài thuốc

Chú thích hình 3.12: C-MLT: chuẩn militarin

PP1, PP2, PP3: lần lượt là phương pháp 1,2,3 b Khảo sát hệ pha động

- Mẫu nghiên cứu: Cao khô Bài thuốc, dung dịch chuẩn militarin (MLT)

- Tiến hành chiết cao khô Bài thuốc theo phương pháp 3 như đã lựa chọn trên, khai triển sắc ký theo điều kiện chung (mục 2.3.4.1)

- Pha động: khảo sát các hệ dung môi sau:

+ Hệ 1: Cloroform: MeOH: H2O (14:5:1) lắc lấy lớp dưới

- Thể tớch chấm mẫu: 10 àL

- Phát hiện vết: Nhúng bản mỏng vào dung dịch H2SO4 10 %/EtOH 96 %, sấy bản mỏng ở nhiệt độ 105 o C trong 5 phút, quan sát ở ánh sáng thường c Kết quả:

Qua khảo sát lựa chọn Hệ 2: EA: Aceton: MeOH: H2O (10,5:3:1,5:0,5) cho kết quả tách tốt nhất (Phụ lục 2)

3.3.1.2 Vị thuốc Xuyên bối mẫu và Diên hồ sách a Phương pháp chiết mẫu:

Do các thành phần hoạt chất trong Xuyên bối mẫu, Diên hồ sách chủ yếu là các alcaloid (mục 1.4.2 và 1.4.3) nên chúng tôi tiến hành chiết như sau:

- Mẫu cao khô Bài thuốc

Lấy khoảng 2,5 g cao khô Bài thuốc cho vào ống ly tâm dung tích 50 mL, thêm 5mL dung dịch NH3 đặc và 30 mL cloroform, đảm bảo đậy nắp kín và lắc tay trong 10 phút Lọc lấy phần dịch đổ vào bình gạn và gạn lấy lớp cloroform Chiết lớp cloroform 2 lần mỗi lần với 20 mL dung dịch HCl 1 % Gộp lấy lớp nước và trung hòa bằng dung dịch

NH3 đặc đến pH kiềm (kiểm tra bằng giấy quỳ) Sau đó chiết 2 lần, mỗi lần với 20 mL

Hình 3.12 SKĐ khảo sát phương pháp chiết MLT trong Bạch cập

43 cloroform Gộp lấy lớp cloroform và cô đến cắn dưới áp suất giảm và hòa lại cắn bằng

2 mL EA thu được dịch chấm sắc ký

- Mẫu dược liệu Xuyên Bối mẫu, Diên hồ sách: tiến hành tương tự như mẫu cao khô Bài thuốc với 1 g dược liệu Xuyên bối mẫu và 1 g Diên hồ sách b Khảo sát hệ pha động

- Tiến hành khai triển sắc ký theo điều kiện chung như mục 2.3.4.1

- Pha động: khảo sát các hệ dung môi sau:

 Đối với vị thuốc Xuyên bối mẫu

+ Hệ 3: EA: MeOH: NH3 đặc (8,5:1:0,5)

 Đối với vị thuốc Diên hồ sách

- Thể tớch chấm mẫu: 10 àL

- Phát hiện vết: Sau khi triển khai xong, lấy bản mỏng ra, để khô Sau đó, tiến hành nhúng bản mỏng vào dung dịch Dragendoff (TT), quan sát ở ánh sáng thường c Kết quả:

- Đối với Xuyên bối mẫu, qua khảo sát chọn Hệ 2: NH3 25 %: MeOH: EA (0,5:1:6) cho kết quả tách tốt nhất (Phụ lục 2)

- Đối với Diên hồ sách, qua khảo sát chọn Hệ 3: Toluen: Aceton: MeOH (8:2:2) cho kết quả tách tốt nhất (Phụ lục 2)

3.3.1.3 Vị thuốc Đại hoàng a Phương pháp chiết mẫu:

Do các hợp chất chính trong Đại hoàng là các anthranoid nên tiến hành quy trình chiết sau:

- Mẫu cao khô bài thuốc:

Cân khoảng 2,5 g cao khô bài thuốc vào bình nón, thêm 20 mL dung dịch HCl 10

% và 20 mL cloroform (TT), đun hồi lưu trong cách thủy trong 2 giờ, để nguội Chuyển dịch thu được vào bình gạn, gạn lấy lớp Cloroform Lớp nước còn lại lắc với cloroform thêm 2 lần nữa, mỗi lần 20 mL Gộp các dịch chiết cloroform ở trên, cô trên cách thủy đến cạn Hòa cắn thu được trong 3 mL EA thu được dung dịch chấm sắc ký

Lấy 1g bột dược liệu vào bình nón, thêm 30 mL MeOH, siêu âm 15 phút Lọc, sau đó gạn lấy dịch vào bình nón 250 mL cô trên cách thủy đến cạn Sau đó, tiến hành tiếp tục như mẫu cao khô bài thuốc

44 b Khảo sát hệ pha động:

- Tiến hành khai triển sắc ký theo điều kiện chung như mục 2.3.4.1

- Pha động: khảo sát các hệ dung môi sau:

+ Hệ 1: Toluen: EA: MeOH: Acid formic: H2O (30:10:2:0,5:5) (lắc kỹ, để tách lớp, lấy lớp trên)

+ Hệ 2: Toluen: EA: Acid formic (8:4:1)

- Thể tớch chấm mẫu: 10 àL

- Phát hiện: Sau khi khai triển lấy bản mỏng ra ngoài để khô và quan sát bản mỏng dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 366 nm Sau đó hơ bản mỏng bằng NH3 và quan sát ở ánh sáng thường c Kết quả:

Qua khảo sát lựa chọn Hệ 1: Toluen: EA: MeOH: Acid formic: H2O (30:10:2:0,5:5) cho các vết tách tốt nhất (lắc kỹ, để tách lớp, lấy lớp trên) (Phụ lục 2)

3.3.1.4 Vị thuốc Cam thảo a Khảo sát phương pháp chiết:

 Mẫu cao khô Bài thuốc

Cân khoảng 1,5 g cao khô bài thuốc dạ dày YB vào ống ly tâm, thêm 20 mL ether ethylic (TT), siêu âm 30 phút nhiệt độ lạnh (sử dụng đá khô), Ly tâm 6000 vòng/10 phút, gạn bỏ dịch ether Thêm vào bã 25 mL MeOH (TT), siêu âm 30 phút, lọc lấy dịch chiết vào bình cầu Cô dịch chiết ở áp suất giảm đến cắn Hòa tan cắn trong 20 mL nước Lắc dung dịch thu được với n-BuOH 3 lẩn, mỗi lần 20 mL Gộp dịch chiết Butanol, rửa 3 lần với nước, bỏ nước rửa Bay hơi dịch chiết BuOH trên cách thủy tới cắn, hòa tan cắn trong 5 mL methanol (TT) được dung dịch thử chấm sắc ký

Do các hợp chất chính trong cảm thảo là acid glycyrrhyzic và các flavonoid là liquiritin và isoliquiritin Các hợp chất này có đặc tính ít tan trong nước ở dạng acid Tuy nhiên, vì có tính acid nên có thể tan được trong dung dịch kiềm như Na2CO3 vì vậy nên chúng tôi phát triển phương pháp chiết như sau:

Cân khoảng 1,5 g cao khô Bài thuốc vào ống ly tâm, thêm 30 mL dung dịch

Na2CO3 1%, siêu âm 15 phút Ly tâm 6000 vòng/10 phút, gạn lớp dịch vào 2 ống ly tâm khác Acid hóa từng ống bằng dung dịch HCl 10 % đến pH khoảng 2 Để yên trong 1 tiếng sau đó ly tâm ở 6000 vòng/10 phút thu lấy tủa Rửa tủa 2 lần, lần 1 với 10 mL nước vào từng ống ly tâm, lần 2 với 10 mL diethyl ether vào từng ống ly tâm; với mỗi lần rửa, tiến hành siêu âm trong 10 phút và ly tâm ở 6000 vòng/10phút để thu lấy tủa Sau cùng hòa tủa bằng tổng cộng 2 mL MeOH thu được dịch chấm sắc ký

 Dược liệu cam thảo: tiến hành tương tự mẫu cao khô bài thuốc với lượng 1g bột dược liệu

 Tiến hành: Chạy sắc ký trong cùng điều kiện với thể tích chấm 10 μL, hệ pha động với hệ EA: acid formic: acid acetic: nước (15:1:1:2) Sau khi khai triển xong, lấy bản mỏng ra để khô ngoài không khí, phun dung dịch acid sulfuric 10 % trong ethanol (TT), sấy bản mòng ở 105 °C trong 5 phút Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng

 Kết quả: Khảo sát phương pháp chiết Cam thảo được thể hiện qua Hình 3.13

Ta thấy quy trình chiết 2 vết tách rõ ràng và đẹp hơn so với quy trình 1 không tách được vết

Do đó, tiến hành chọn phương pháp chiết 2 để khảo sát hệ pha động b Khảo sát hệ pha động

- Tiến hành: chuẩn bị các mẫu theo phương pháp chiết

2 đã lựa chọn như ở trên

- Pha động: kháo sát các hệ dung môi sau

+ Hệ 1: EA: acid formic: acid acetic: nước (15:1:1:2)

+ Hệ 2: EA: acetic: nước (5:1:0,8) c Kết quả:

Qua khảo sát chọn Hệ 2: EA: acetic: nước (5:1:0,8) cho kết quả tách vết tốt nhất

3.3.2 Thẩm định phương pháp định tính

Theo TLTK [3], chúng tôi tiến hành thẩm định phương pháp định tính các vị thuốc trong cao khô Bài thuốc bằng cách chạy trên cùng 1 điều kiện đã xác định đối với mẫu thử, mẫu dược liệu đối chiếu (hoặc mẫu chuẩn) và mẫu placebo

Định lượng militarin có trong cao khô bài thuốc

Kết quả định lượng militarin trong cao khô Bài thuốc dạ dày sau khi điều chế được trên điều kiện đã chọn trên 3 mẫu cao khô bài thuốc được trình bày ở bảng sau

Bảng 3.15 Kết quả định lượng militarin trong cao khô bài thuốc dạ dày

Nhận xột: Hàm lượng trung bỡnh của militarin trong mỗi mẻ là 11583,26 (àg/g) Độ lệch chuẩn hàm lượng militarin giữa các lần là 0,78 %.

Bàn luận

3.5.1 Xây dựng quy trình định lượng militarin trong cao khô Bạch cập và cao khô Bài thuốc dạ dày

Nhóm nghiên cứu đã xây dựng phương pháp định lượng militarin trong cao khô Bạch cập và cao khô Bài thuốc dạ dày mà trước đó chưa có tác giả nào tiến hành Chương trình sắc ký được tham khảo từ Dược điển Hồng Kông và Dược điển Trung quốc và có

Hình 3.18 SKĐ định tính Cam thảo trong cao khô Bài thuốc

49 điều chỉnh dung môi để phù hợp để cho được pic militarin tách tốt nhất trong cả cao đơn Bạch cập và cao Bài thuốc Phương pháp định lượng mà nhóm nghiên cứu xây dựng đã được thẩm định theo những tiêu chí của AOAC và đã đáp ứng được các tiêu chí như tính đặc hiệu, tính thích hợp hệ thống, khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ thu hồi và độ lặp lại Điều này cho thấy, các điều kiện sắc ký được lựa chọn là phù hợp

3.5.2 Nghiên cứu điều chế cao khô Bài thuốc dạ dày

Bài thuốc dạ dày YB được sử dụng và ghi chép trong danh mục dưới dạng thuốc tán, bột nên các thành phần được bảo tồn nguyên vẹn khi sử dụng Việc bào chế dưới dạng cao khô với mục đích giảm liều dùng cho bệnh nhân đồng thời thuận tiện cho việc phát triển bào chế dưới dạng viên nén, viên nang khi sản xuất Vì điều kiện quy mô phòng thí nghiệm nên chúng tôi chỉ khảo sát điều kiện chiết xuất bằng phương pháp OFAT cho một vị thuốc là Bạch cập để điều chế cao khô, các vị thuốc còn lại chúng tôi tiến hành tham khảo tài liệu để tiến hành điều chế Sau đó, phối trộn theo tỉ lệ hiệu suất chiết cao và công thức bài thuốc để thu được lượng tương ứng

3.5.3 Xây dựng quy trình định tính các vị thuốc trong cao khô Bài thuốc dạ dày Để thẩm định dấu vân tay của các vị thuốc trong Bài thuốc dạ dày YB có 2 phương pháp chiết hoạt chất:

- Chiết chọn lọc theo từng nhóm hoạt chất: phương pháp này loại được nhiều tạo chất và các nhóm chất khác nhau, vì vậy sẽ cho kết quả chính xác hơn, tuy nhiên tốn dung môi và nhiều công đoạn phức tạp

- Chiết không chọn lọc: Dùng dung môi MeOH, EtOH để chiết toàn bộ các thành phần có trong dược liệu và bài thuốc dạ dày (MeOH, EtOH là nhưng dung vạn năng, có khả năng hòa tan rộng) Phương pháp này nhanh, tốn ít dung môi; tuy nhiên do chiết không chọn lọc nên có thể có nhiều tạp chất và khó đưa ra nhận định cụ thể về từng hoạt chất riêng biệt

Ban đầu chúng tôi tiến hành khảo sát quy trình chiết không chọn lọc và hệ đung môi theo DĐVN V nhưng kết quả khả năng tách vết kém và nhiều dược liệu cho sắc ký đồ có các vết giống nhau do chế phầm là hỗn hợp nhiều thành phần dược liệu nên khả năng tách vết khó hơn trong dược liệu Do vậy, chúng tôi tiến hành chiết định tính dựa vào hoạt chất chính có trong từng dược liệu với hệ dung môi trong DĐVN V, DĐTQ, tài liệu tham khảo khác và thay đổi một số thông số đã đáp ứng yêu cầu định tính các dược liệu này trong cao khô Bài thuốc

Ngoài ra, qua quá trình nghiên cứu và triển khai sắc ký lớp mỏng để xác định dấu vân tay của các vị thuốc, chúng tôi nhận thấy rằng, để có kết quả tốt thì cần phải thực hiện các bước khảo sát về khối lượng mẫu nghiên cứu cần dùng, hệ dung môi khai triển, lượng mẫu chấm trên bản mỏng, và tính lặp lại của kết quả

50 Kết quả phân tích sắc ký lớp mỏng từ cao khô bài thuốc, các mẫu cao placebo và các vị thuốc đối chiếu cho thấy, trên sắc ký đồ của cao khô có các vết tương ứng với các vết của các các vị thuốc trong phương thuốc; bên cạnh đó, cao khô Bài thuốc còn có các vết đặc hiệu với từng vị dược liệu mà cao đặc placebo tương ứng không có Như vậy, có thể sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng để xác định dấu vân tay hoá học các vị dược liệu trong cao khô bài thuốc dạ dày nhằm góp phần xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cao khô Bài thuốc dạ dày YB

3.5.4 Định lượng militarin trong cao khô Bài thuốc dạ dày

Trong điều kiện đã lựa chọn, nhóm tiến hành điều chế cao khô Bạch cập có hiệu suất chiết militarin cao từ phần khảo sát Kết quả cho thấy, hàm lượng phần trăm militarin toàn phần trong cao là 17,25 % và hiệu suất chiết militarin thu được là 90,03 % Điều này được lý giải là do trong Dược liệu Bạch cập chiếm 55 % chất nhầy, khi tiến hành chiết bằng EtOH 70 % thì chất nhầy sẽ bị loại bỏ và đồng thời chiết xuất được nhiều militarin Tiến hành phối trộn cao khô Bạch cập và cao khô của các vị thuốc còn lại theo tỉ lệ hiệu suất tạo cao và công thức bài thuốc, đem định lượng Bài thuốc bằng phương pháp đã khảo sát ở trên tiến hành 3 lần thu được kết quả thu được hàm lượng militarin trong cao khụ Bài thuốc là 11583,26 ± 0,78 àg/g