Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Đánh giá đáp ứng miễn dịch của cơ thể trên người tiêm vaccine và người nhiễm covid-19 bằng elisa phát hiện kháng thể trung hòa

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

TRẦN KHÁNH DUY

ĐÁNH GIÁ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CƠ THỂ TRÊN NGƯỜI TIÊM VACCINE VÀ NGƯỜI NHIỄM COVID – 19

BẰNG ELISA PHÁT HIỆN KHÁNG THỂ TRUNG HOÀ

Chuyên ngành : Công Nghệ Sinh Học

LUẬN VĂN THẠC SĨ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, Tháng 7 năm 2023

Mẫu PL1Mẫu PL1

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠITRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM Cán bộ hướng dẫn khoa học :

TS BS PHẠM HÙNG VÂN PGS TS NGUYỄN THUÝ HƯƠNG Cán bộ chấm nhận xét 1 :

TS PHẠM THỊ KIM TRÂM Cán bộ chấm nhận xét 2 :

TS HOÀNG MỸ DUNG

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 17 tháng 7 năm 2023

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 PGS TS NGUYỄN TIẾN THẮNG - Chủ tịch Hội đồng2 TS PHẠM THỊ KIM TRÂM - Phản biện 1

3 TS HOÀNG MỸ DUNG - Phản biện 24 PGS TS NGUYỄN THUÝ HƯƠNG - Uỷ viên5 TS HUỲNH NGỌC OANH - Thư ký

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: TRẦN KHÁNH DUY MSHV: 2070073Ngày, tháng, năm sinh: 24/ 04/1992 Nơi sinh: Vĩnh Long Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 8420201

I TÊN ĐỀ TÀI: Đánh giá đáp ứng miễn dịch của cơ thể trên người tiêm vaccine

và người nhiễm covid – 19 bằng ELISA phát hiện kháng thể trung hoà (Evaluation of The Immune Response in Vaccinated And Sars – Cov – 2 Infected People by Detection of Neutralizing Antibody Using Elisa)

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

• Đánh giá đáp ứng miễn dịch kháng thể trung hoà trên đối tượng nhiễm tựnhiên virus SARS – CoV – 2 với trạng thái tiêm chủng khác nhau

o Thu nhận mẫu và xử lý mẫu

o Thực hiện thử nghiệm ELISA phát hiện kháng thể trung hoà và thửnghiệm ELISA định lượng kháng kháng protein gai

o Thống kê phân tích tương quan Pearson, hồi quy tuyến tính

• Đánh giá đáp ứng miễn dịch kháng thể trung hoà trên các nhóm tiêm vaccinekhác nhau Hiệu quả mũi tiêm tăng cường

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

o Thực hiện thử nghiệm ELISA phát hiện kháng thể trung hoào Thống kê mô tả mức độ kháng thể trung hoà theo từng nhómo Phân tích khác biệt trung bình (ANOVA) giữa các nhóm

o Phân tích tác động của các biến số giới tính, độ tuổi, khoảng thời giansau tiêm và khoảng cách mũi tiêm đến mức độ kháng thể trung hoà(Independent T – test)

• Đánh giá đáp ứng miễn dịch kháng thể trung hoà trên đối tượng nhiễm virusSARS – CoV – 2 với các trạng thái tiêm chủng khác nhau

o Thực hiện thử nghiệm ELISA phát hiện kháng thể trung hoào Thống kê mô tả mức độ kháng thể trung hoà theo từng nhómo Phân tích khác biệt trung bình (ANOVA) giữa các nhóm

II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 06/02/2023III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:

IV NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS BS Phạm Hùng Vân

PGS TS Nguyễn Thuý Hương

Tp Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 2023

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi muốn được bày tỏ là lòng biết ơn sâu sắc nhất tới Thầy Phạm Hùng Vân, là người hướng dẫn khoa học, người thầy đã quan tâm tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành đề tài này

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới cô Nguyễn Thuý Hương, là giảng viên đồng hướng dẫn đề tài, người đã ân cần hướng dẫn hỗ trợ tôi hoàn thành đề tài này cũng như quý thầy cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường Đại Học Bách Khoa Thành Phố Hồ Chí Minh, đã hết lòng truyền đạt những kiến thức quí báu dẫn dắt tôi đến với con đường khoa học và giáo dục tôi trưởng thành hơn về mọi mặt

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn trân trọng tới Ban lãnh đạo công ty Nam Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và hoàn thành nghiên cứu

Bằng tình yêu mến và lời cảm ơn chân thành, tôi xin được gửi đến các anh chị em phòng RD, phòng DV công ty Nam Khoa những người đã tận tình giúp đỡ và hỗ trợ để tôi hoàn thành luận văn ngày hôm nay

Xin cảm ơn tất cả những người bạn thân đã luôn gắn bó, san sẻ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập tại trường cũng như thời gian tôi thực hiện đề tài

Cảm ơn vợ và hai con đã luôn bên cạnh động viên và là động lực to lớn để tôi hoàn thành đề tài này

Cuối cùng, con xin ghi nhớ công ơn sinh thành, nuôi dưỡng và tình yêu thương của Cha mẹ đã dành cho con, người đã dành cả cuộc đời mình để lo lắng dìu bước con trong cuộc sống này, người đã luôn ở bên con, là chỗ dựa vững chắc để con yên tâm học tập và hoàn thành luận văn này

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2023

Trần Khánh Duy

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ

Đề tài “Đánh giá đáp ứng miễn dịch của cơ thể trên người tiêm vaccine và người nhiễm covid – 19 bằng ELISA phát hiện kháng thể trung hoà” thực hiện nhằm mục tiêu làm rõ đáp ứng miễn dịch cơ thể sau tiêm chủng, miễn dịch hậu nhiễm, cung cấp các bằng chứng khoa học về hiệu quả tiêm chủng trên các loại vaccine triển khai phổ biến ở Việt Nam cũng như chiến lược đa dạng hoá đáp ứng miễn dịch cộng đồng Bằng các thử nghiệm ELISA phát hiện kháng thể trung hoà, định lượng kháng thể đặc hiệu kháng protein gai (Spike) kết hợp với các phương pháp phân tích thống kê liên quan, đề tài đã thu được một số kết quả như sau:

- Ghi nhận sự tương quan giữa nồng độ kháng thể kháng protein S và mức độ biểu hiện kháng thể trung hoà (r (Pearson) = 0.501, p < 0.0001) và tính khả thi của sử dụng thử nghiệm ELISA phát hiện kháng thể trung hoà trong đánh giá đáp ứng miễn dịch với SARS – CoV – 2

- Đáp ứng miễn dịch trên đối tượng tiêm hai mũi vaccine mRNA như MD – MD đạt 89.52%, PF – PF đạt 78.27% là cao hơn vượt trội so với vaccine vector AZ – AZ và vaccine bất hoạt VC – VC, lần lượt tương ứng 48.27% và 27.06% Tiêm trộn vaccine vector – mRNA trong trường hợp AZ – MD đạt 78.75%, AZ – PF đạt 73.55% tương đương nhóm tiêm hai mũi vaccine mRNA và cao hơn nhóm tiêm thuần AZ – AZ Đề tài không ghi nhận mối tương quan giữa đáp ứng miễn dịch kháng thể trung hoà và độ tuổi ở hầu hết các nhóm vaccine ngoại trừ nhóm nhận hai mũi PF – PF (p < 0.0001);

tính ở nhóm tiêm vaccine VC – VC (p = 0.02), không ghi nhận khác biệt ở các nhóm còn lại

- Mũi tiêm tăng cường được báo cáo làm gia tăng đáng kể kháng thể trung hoà các nhóm tiêm so với kết quả tiêm hai mũi trước đó, hiệu quả của mũi tiêm tăng cường bằng vaccine PF là cao hơn so với mũi tiêm vaccine AZ, kết quả trung bình tương ứng đạt 84.77% và 66.35% (p < 0.0001) Chi tiết kết quả nổi bật ở nhóm AZ – AZ – PF đạt 79.95%, VC – VC – PF đạt 91.02% hay nhóm tiêm trộn AZ – MD – PF cho kết quả 93.37%, AZ – PF – PF đạt 85.39% cao hơn nhóm tiêm thuần AZ – AZ -AZ với kết quả 64.32% hay so với nhóm tiêm AZ – MD – AZ đạt 67.49% và nhóm tiêm AZ – PF – AZ đạt 63.4%

- Mức độ kháng thể trung hoà ở người nhiễm virus nhưng chưa từng tiêm chủng ở mức thấp đạt 40.42%, có sự khác biệt mạnh mẽ khi người nhiễm có tiền sử tiêm chủng ít nhất một mũi hoặc hai mũi vaccine tương ứng đạt 84.03% (p < 0.0001) và 86.65% (p < 0.0001) Không cần tiêm mũi bổ sung cho đối tượng đã nhiễm và đã tiêm chủng trước đó

- Giá trị kháng thể trung hoà tăng lên rất cao sau khi nhiễm Omicron ở tất cả các nhóm đối tượng đã tiêm chủng hoặc đã nhiễm biến chủng Delta Không cần thiết tiêm mũi bổ sung cho người nhiễm biến chủng Omicron

ABSTRACT

The study " Evaluation of the immune response in vaccinated and SARS – CoV – 2 infected individuals by detection of neutralizing antibody using ELISA" was conducted with the aim of investigating immune response after vaccination and natural infection by measuring the level of neutralizing antibody against SARS – CoV – 2 Additionally, the findings from this research may offer valuable insights into the effectiveness of commonly used vaccines in Vietnam and inform strategies for enhancing immune response to achieve herd - immunity By performing ELISA assays to detect the potential presence of neutralizing antibodies and quantify Spike-specific antibody proteins followed by statistical analysis methods, our study has obtained the following results:

- Significant correlation was observed between the levels of anti-protein S antibody and neutralizing antibody (r (Pearson) = 0.501, p < 0.0001), which offers supportive evidence for the feasibility of using ELISA test to detect neutralizing antibodies in evaluating the immune response to SARS-CoV-2 - Neutralizing antibody level response in individuals receiving two doses of

mRNA vaccine was 89.52% for MD-MD and 78.27% for PF-PF, both higher than that of individuals vaccinated by AZ-AZ (48.27%) and VC-VC (27.06%) Heterologous vaccination of vector and mRNA vaccine in the group of AZ - MD resulted in a 78.75% neutralizing antibody response, while the AZ–PF group achieved 73.55%, both equivalent to the group

with the duration after injection in the AZ-AZ, PF–PF group and the

combined group of the two vaccines (p (AZ-AZ) < 0.001, p (PF-PF) = 0.015, p (AZ-PF) < 0.001) The difference in the level of neutralizing antibodies was significantly influenced by the gender of individuals receiving VC - VC (p = 0.02), while no such difference was observed in the remaining groups - A booster shot was reported to significantly increase neutralizing antibodies

compared to the previous two doses We observed a substantial rise in neutralizing antibody capacity among participants who received PF as booster vaccine, with a mean antibody level of 84.77%, compared to those receiving AZ vaccine, with a mean level of 66.35% (p < 0.0001) In detail, the results were outstanding in the AZ-AZ-PF group, exhibiting the median of neutralizing antibody level of 79.95%, and the VC-VC-PF group, which displayed a level of 91.02% The mixed group of AZ-MD-PF achieved a value of 93.37% and AZ-PF-PF reached 85.39%, both surpassing the homologous booster AZ-AZ-AZ (64.32%), as well as the group injected with AZ-MD-AZ (67.49%) or AZ-PF-AZ group (63.4%)

- The level of neutralizing antibodies in convalescent participants without vaccination was low at 40.42% when compared to infected individuals who had a history of receiving at least one or two doses of vaccine, which reached values of 84.03% (p < 0.0001) and 86.65% (p < 0.0001), respectively The percentage of neutralizing antibody increased notably after infection with the Omicron variant in both vaccine recipients or those previously infected with the Delta strain As a result, administering an additional vaccine dose is not necessary for those who have been infected with the Omicron strain

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn tốt nghiệp “Đánh giá đáp ứng miễn dịch của cơ thể trên người tiêm vaccine và người nhiễm covid – 19 bằng ELISA phát hiện kháng thể trung hoà” là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện Các số liệu thu thập, kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận văn là trung thực, không sao chép từ bất cứ đề tài nghiên cứu nào và dưới bất kỳ hình thức nào Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định

Học viên

Trần Khánh Duy

1.1.2 Cấu trúc và chức năng gen 9

1.2 Đáp ứng miễn dịch chống SARS – CoV – 2 10

1.3 Các loại vaccine ngừa COVID – 19 12

1.4 Giải pháp xét nghiệm định lượng hiệu quả vaccine 14

1.5 Mục tiêu nghiên cứu và định hướng đề tài 16

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 18

2.1 Vật liệu nghiên cứu 18

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.1.2 Hoá chất 19

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Sơ đồ quy trình thực hiện 22

2.2.2 Thống kê kết quả 29

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 31

3.1 Kết quả phân tích tương quan giữa mức độ kháng thể trung hoà và tải lượng kháng thể kháng protein S 31

3.2 Đáp ứng kháng thể trung hoà trên những người đã chích 2 mũi vaccine 33

3.2.1 Phân tích tương quan mức độ biểu hiện kháng thể trung hoà và độ tuổi 38

3.2.2 Phân tích tương quan mức độ biểu hiện kháng thể trung hoà và khoảng cách hai mũi tiêm 40

3.2.3 Phân tích tương quan mức độ biểu hiện kháng thể trung hoà và khoảng thời gian sau tiêm (Khoảng cách ngày tiêm và ngày lấy mẫu khảo sát) 41

3.2.4 Phân tích tương quan mức độ biểu hiện kháng thể trung hoà và giới tính 42

3.3 Đáp ứng kháng thể trung hoà trên những người tiêm mũi tăng cường 44

3.4 Đáp ứng kháng thể trung trên những người nhiễm SARS – CoV – 2 51

3.5 Theo dõi động học của đáp ứng kháng thể trung hoà 54

3.6 Đáp ứng kháng thể trung hoà sau khi nhiễm biến chủng Omicron 57

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của virus và so sánh hệ gen của SARS - CoV - 2 với các chủng coronavirus trước đó

(https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2020.01949/full) 10 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 22 Hình 2.2 Hướng dẫn pha loãng đường cong chuẩn từ nồng độ gốc High Control 27 Hình 3.1 Biểu đồ phản ảnh sự tương quan giữa các kết quả định lượng kháng thể đặc hiệu protein S (trục Y) với kết quả định lương kháng thể trung hòa (trục X) trên 188 mẫu thử được thực hiện hai đợt 33 Hình 3.2 Biểu đồ mức độ đáp ứng miễn dịch ở nhóm đối tượng dựa theo bản chất công nghệ vaccine đã nhận 38 Hình 3.3 Sự khác biệt trong mức độ đáp ứng miễn dịch kháng thể trung hoà trên các nhóm đối tượng tiêm mũi tăng cường dựa theo bản chất công nghệ vaccine sử dụng 49 Hình 3.4 Sự khác biệt trung bình mức độ kháng thể trung hoà trên đối tượng nhiễm SARS - CoV- 2 với lịch sử tiêm chủng khác nhau 54

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Nguồn gốc các biến thể và tốc độ lây lan so với dòng ban đầu

(https://www.who.int/activities/tracking-SARS-CoV-2-variants) 8 Bảng 1.2 Các đột biến trên gen S và trên vùng RDB của gen S ở trên biến thể

Omicron 8 Bảng 2.1 Thông tin đối tượng tham gia thử nghiệm phát hiện kháng thể trung hoà 18 Bảng 2.2 Thành phần Invitrogen SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody ELISA Kit 19 Bảng 2.3 Thành phần Invitrogen Human SARS-CoV-2 Spike (trimer) Ig Total ELISA Kit 20 Bảng 2.4 Thông tin các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 20 Bảng 3.1 Kết quả phân tích tương quan giữa nồng độ kháng thể kháng protein S và mức độ kháng thể trung hoà trên 188 mẫu thử 31 Bảng 3.2 Tương quan tuyến tính giữa nồng độ kháng thể đặc hiệu protein S và mức độ biểu hiện kháng thể trung hoà 32 Bảng 3.3 Đáp ứng miễn dịch kháng thể trung hoà ở người hoàn tất liệu trình tiêm chủng (fully - vaccinated) 35 Bảng 3.4 Mức độ biểu hiện kháng thể trung hoà theo bản chất vaccine 36 Bảng 3.5 Tương quan mức độ biểu hiện kháng thể trung hoà và độ tuổi 39 Bảng 3.6 Tương quan mức độ biểu hiện kháng thể trung hoà và khoảng cách hai mũi tiêm 41 Bảng 3.7 Tương quan mức độ biểu hiện kháng thể trung hoà và khoảng thời gian sau tiêm 42 Bảng 3.8 Tương quan biểu hiện kháng thể trung hoà và giới tính 43 Bảng 3.9 Đáp ứng miễn dịch trung hoà trên những người tiêm ba mũi (Booster) 45 Bảng 3.10 Đáp ứng miễn dịch kháng thể trung hoà ở các nhóm vaccine theo bản chất công nghệ 47 Bảng 3.11 Đáp ứng miễn dịch kháng thể trung hoà ở các nhóm vaccine theo bản chất công nghệ 50 Bảng 3.12 Đáp ứng miễn dịch kháng thể trung hoà ở các nhóm đối tượng nhiễm

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ACE2 Angiotensin-converting enzyme 2

AZ AstraZeneca (ChAdOx1 )

ECDC The European Centre for Disease Prevention and Control

ELISA Enzyme – Linked Immunosorbent Assay

MD Moderna (mRNA - 1273)

mRNA Messenger RNA

NSP nonstructural proteinORF Open reading frame

MỞ ĐẦU

1.Đặt vấn đề

Năm 2019, SARS – CoV – 2 được xác định là tác nhân lây nhiễm khẩn cấp mới trên toàn cầu đánh dấu hơn 100 năm kể từ sau đại dịch cúm năm 1918, thế giới lại đang phải đối mặt với tình trạng tương tự Tại thời điểm ngày 11 tháng 3 năm 2021, hơn 100.000 người bị lây nhiễm ở hơn 100 quốc gia đã được ghi với trường hợp tử vong hơn 4000 người [1], WHO đã chính thức công bố tình trạng “đại dịch” gây ra bởi coronavirus Các ca nhiễm trùng từ đó đã phát triển theo cấp số nhân trên khắp các quốc gia và lục địa Khả năng kiểm soát nhanh chóng đại dịch đã bị hạn chế bởi nhiều yếu tố, bao gồm thiếu kiến thức sinh học chi tiết về SARS-CoV-2 và các phản ứng miễn dịch của vật chủ, thiếu công cụ chẩn đoán nhanh chóng và xác định ca bệnh, cũng như thiếu các phương pháp điều trị hiệu quả Những trở ngại này cũng là động lực cho cộng đồng y tế và khoa học đã tạo ra kiến thức và thông tin với tốc độ chóng mặt và tham gia vào mức độ chia sẻ chưa từng có trên các nền tảng công bố khoa học đa dạng nhất về SARS – CoV – 2 [2]

SARS-CoV-2 gây nhiễm trùng đường hô hấp trên và dưới, thường đi kèm với sốt, ho, mất khứu giác và vị giác Hầu hết các trường hợp nhiễm trùng vẫn ở mức độ nhẹ, có tới 20–40% bệnh nhân không có triệu chứng Tuy nhiên, một số bệnh nhân có diễn biến tăng nặng và phát triển viêm toàn thân, tổn thương mô, suy hô hấp cấp tính, biến chứng huyết khối tắc mạch, tổn thương tim và / hoặc cơn bão cytokine, dẫn đến tử vong Nguy cơ mắc bệnh COVID-19 mức độ nghiêm trọng còn phụ thuộc vào các bệnh đi kèm (ví dụ, tiểu đường, cao huyết áp và béo phì), tuổi tác,

SARS-CoV-2 từ nhiều nền tảng (mRNA được bao bọc bởi hạt nano lipid, vắc-xin virion bất hoạt hoặc vaccine vector virus) đã được cấp phép sử dụng khẩn cấp (EUA) hoặc phê duyệt và được triển khai cho hàng tỷ người trên toàn thế giới Ở các quốc gia có tỷ lệ tiêm chủng cao, số ca nhiễm trùng, nhập viện và tử vong đã giảm rõ rệt, mặc dù sự thành công của việc tiêm chủng đã bị đe dọa bởi sự xuất hiện của các biến thể bao gồm B.1.351 (Beta), B.1.1.28 (Gamma), B.1.617.2 (Delta) và B.1.1.529 (Omicron) mới nhất cũng như sự chần chừ của bộ phận cá nhân anti-vaccine Với việc diễn tiến biến chủng mới ngày một đa dạng, các sản phẩm vaccine mới cũng như điều kiện tiếp cận vaccine khác nhau của các quốc gia đã đặt ra câu hỏi về mức độ hiệu quả của đáp ứng miễn dịch vaccine, miễn dịch hậu nhiễm hay chiến lược đa dạng hoá trạng thái đáp ứng miễn dịch cộng đồng Để giải đáp các trở ngại trên, công cụ đo lường miễn dịch là một trong những giải pháp khả thi nhằm cung cấp góc nhìn khoa học, thực tế và có ý nghĩa nhất với việc đánh giá mức độ miễn dịch cá thể trong tổng hợp các giải pháp phòng chống SARS- CoV-2 Đề tài

“ĐÁNH GIÁ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CƠ THỂ TRÊN NGƯỜI TIÊM VACCINE VÀ NGƯỜI NHIỄM COVID – 19 BẰNG ELISA PHÁT HIỆN KHÁNG THỂ TRUNG HOÀ” được thực hiện với mong muốn đóng góp thông tin

khoa học cơ bản về miễn dịch hậu nhiễm, miễn dịch nhân tạo do vaccine cũng như những sự lựa chọn tối ưu trong năng lực quốc gia về triển khai tiêm chủng toàn dân ứng phó với đại dịch Covid – 19

2 Nội dung nghiên cứu

• Sử dụng kit ELISA phát hiện kháng thể đặc hiệu protein S và kit ELISA phát hiện kháng thể trung hòa trong mẫu huyết thanh/huyết tương của cá thể được tiêm chủng 1 mũi, 1 liệu trình, tiêm tăng cường và cá thể đã nhiễm tự nhiên SARS-CoV-2 Từ đó đánh giá

o Hiệu quả các loại vaccine khác nhau, bao gồm các hình thức tiêm thuần và tiêm trộn các vaccine

o Mối tương quan giữa khả năng tạo đáp ứng miễn dịch của vaccine với các yếu tố giới tính, độ tuổi, thời gian sau tiêm

o Hiệu quả của mũi tiêm tăng cường

o Mức độ miễn dịch ở đối tượng đã nhiễm cùng với lịch sử tiêm chủng tương ứng

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng mẫu:

• Huyết thanh/ huyết tương của cá thể đã thực hiện tiêm chủng: 1 mũi, 1 liệu trình, tiêm tăng cường

• Huyết thanh/ huyết tương của cá thể đã nhiễm tự nhiên SARS – CoV - 2

4 Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu

Mẫu thử được thu nhận từ các tình nguyện viên theo từng giai đoạn:

• Giai đoạn 1: nhóm đối tượng đã tiêm vaccine mũi đầu tiên hoặc / và hoàn tất 1 liệu trình, cá nhân đã nhiễm SARS – CoV – 2 nhưng chưa tham gia tiêm vaccine

• Giai đoạn 2: nhóm đối tượng đã hoàn tất liệu trình tiêm chủng, một số cá thể nhiễm mới sau tiêm hoặc tiêm tăng cường sau khi nhiễm, cá thể đã tiêm mũi tăng cường

• Giai đoạn 3: theo dõi cá nhân tiêm mũi tăng cường, mũi phối hợp, các nhân nhiễm mới hoặc tái nhiễm do biến chủng mới

Các đánh giá dựa trên định lượng kháng thể trung hoà thông qua kỹ thuật ELISA với tên gọi thử nghiệm trung hoà thay thế (surrogate virus neutralization test)

• Cung cấp thông tin về mức độ hiệu quả cũng như triển vọng của việc mở rộng tiêm chủng thông qua việc tiêm trộn, tiêm tăng cường nhằm có quyết định lựa chọn giải pháp vaccine tối ưu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 SARS – CoV – 2

Thế giới hiện đang đối mặt với một tình huống khủng hoảng y tế xuất hiện lần đầu tiên vào cuối tháng 12 năm 2019 bắt nguồn từ một vài trường hợp mắc bệnh viêm phổi không rõ nguyên nhân ở Vũ Hán, Trung Quốc Các bệnh nhân có các triệu chứng chung như sốt, ho khan, đau họng, khó thở và mệt mỏi Mẫu quệt hầu họng và hậu môn được thu thập cùng với máu và dịch rửa phế quản (BALF – Bronchoalveolar Larva Fluid) từ tất cả bảy bệnh nhân, không phân biệt tuổi tác và giới tính của họ, sau đó được gửi đến Viện Virus Vũ Hán để kiểm tra Khi đợt bùng phát đầu tiên diễn ra tại chợ hải sản vào mùa đông, các hình thái tương tự như đợt lây nhiễm Hội chứng hô hấp cấp tính nặng (SARS) trước đó được ghi nhận, các nhà khoa học đầu tiên sàng lọc các mẫu bằng cách sử dụng mồi pan-CoV qPCR Kết quả gây bất ngờ với năm mẫu được báo cáo dương tính với coronavirus Phân tích chi tiết bằng cách sử dụng trình tự di truyền và cây phát sinh loài thông qua công nghệ giải trình tự thế hệ mới đã xác định tác nhân gây ra bệnh hô hấp này, một loại coronavirus mới (2019-nCoV) [4] Ngày 11 tháng 3 năm 2020, tổ chức WHO chính thức công bố tình trạng đại dịch trên toàn cầu và đặt tên cho bệnh mới là Corona Virus Disease 2019 hay Covid-19 Virus sau đó được đặt lại theo danh pháp quốc tế với tên chính thức là SARS – CoV – 2 bởi ICTV (International Committee on Taxonomy of Viruses) Đây cũng là chủng virus được định danh với tốc độ chưa có tiền lệ bằng việc sử dụng tiến bộ khoa học nổi bật là công nghệ giải trình tự thế hệ

1.1.1 Phân loại

1.1.1.1 Giả thuyết nguồn gốc

Nhờ vào việc nhanh chóng xác định trình tự bộ gen và phân tích phát sinh loài của coronavirus mới SARS-CoV-2 đã chỉ ra rằng nó tương tự về mặt di truyền với coronavirus SARS-CoV đã biết trước đây và đó cũng là lý do nó được xếp vào họ

Coronaviridae Coronavirus chứa RNA sợi đơn dương (+ ve ssRNA) làm vật liệu di

truyền của nó, có chiều dài khoảng 30 kb được bọc kín bởi một lớp vỏ và phủ bên ngoài màng acid béo giúp virus tránh được phản ứng miễn dịch của vật chủ và hỗ

trợ xâm nhập của nó bên trong tế bào chủ [5] Phân họ Coronavirinae được chia

nhỏ thành bốn chi, cụ thể là alpha-, beta-, gamma- và delta- coronavirus (α-CoV, CoV, γ-CoV và δ-CoV) Các virus có khả năng lây nhiễm sang người được xếp vào chi α-CoV và β-CoV (SARS-CoV & MERS-CoV), trong khi virus thuộc các chi γ-CoV và δ-CoV chủ yếu được biết là lây nhiễm cho lợn và chim SARS-CoV-2 thuộc giống β-CoV, vì nó có 88% nhận dạng trình tự với coronavirus từ dơi nhưng chỉ giống 79% với SARS-CoV và 50% giống với MERS-CoV Giả thuyết ban đầu được xây dựng rằng vật chủ trực tiếp của virus này có thể là một con dơi, sau đó truyền nó sang một số vật chủ trung gian không xác định đóng vai trò là nguồn truyền virus cho người

β-1.1.1.2 Biến thể SARS – CoV – 2 (Variants)

Theo quan điểm này, SARS-COV-2 là coronavirus của động vật chứ không phải của người, tuy nhiên sau khi virus nhiễm sang người và lây lan thì chính virus đã có những thích ứng bằng cách xảy ra và chọn lọc các đột biến trên bộ gen của nó (đặc biệt là gen chịu trách nhiệm hình thành protein gai, protein S, là cấu trúc giúp virus xâm nhập vào tế bào biểu mô hô hấp của người qua thụ thể ACE2 trên bề mặt tế bào) để thay đổi thành những biến thể (variants) giúp chúng dễ lây lan hơn từ người sang người Các biến thể mới nhanh chóng được hình thành dựa trên tỷ lệ lây nhiễm nhanh chóng, với con số tuyệt đối nhiễm trùng lớn dẫn đến xác suất xuất hiện biến dị di truyền ngày càng cao một phần do sai hỏng chức năng sao chép bộ gen virus một phần do quá trình tương tác giữa virus với ký chủ hình thành cơ chế trốn tránh

miễn dịch, hay tình huống tái tổ hợp trong trường hợp bùng phát đồng nhiễm các chủng virus khác nhau Theo đúng qui luật tiến hóa thì các biến thể xuất hiện càng về sau thì càng lây lan nhanh hơn các biến thể xuất hiện trước và sẽ nhanh chóng thay thế các biến thể trước Biến thể đầu tiên của virus xuất hiện ngay sau khi COVID-19 lan qua châu Âu và Mỹ từ cuối tháng 2/2020 là dòng D614G với đột biến tại codon 614 trên gen S: aspartic acid (D) bị thay thế bằng Glycine (G), và sự thay đổi này làm cho protein S bám vào ACE2 dễ dàng hơn hơn, giúp cho virus dễ xâm nhập vào tế bào hơn [6] Chỉ cần sau 4 tháng lây lan là SARS-COV-2 dòng G đã thay thế hoàn toàn dòng D và đột biến D614G cũng vẫn còn hiện diện trong các biến thể được phát hiện sau này Cho đến hiện nay, SARS-COV-2 đã xuất hiện 4 biến thể quan ngại (VOC; Variants of concern) là Alpha, Beta, Gamma và Delta với tốc độ lây lan nhanh hơn dòng nguyên thủy theo thứ tự là 82%, 50%, 161% và 198% (Bảng 1.1) Ngoài 4 biến thể trên thì SARS-COV-2 còn xuất hiện thêm một số biến thể khác nữa như Epsilon, Kappa, Iota, Eta… và các biến thể này được xếp vào các biến thể theo dõi (VOI: Variants of interest) Tuy nhiên cục diện đã thay đổi hoàn toàn kể từ từ tháng 11/2021, khi xuất hiện biến thể Omicron tại Nam Phi [7], khiến cho hiện nay WHO và ECDC chỉ còn lưu ý đến hai biến thể Delta và Omicron vì các biến thể khác được ghi nhận là hầu như đã biến mất, và trong tương lai có lẽ chỉ còn Omicron Lý do là tốc độ lây lan của Omicron cực kỳ nhanh vì trên gen S của Omicron xuất hiện rất nhiều đột biến Nếu các biến thể Alpha, Beta, Gamma và Delta chỉ có từ 10 đến 11 đột biến trên gen S với chỉ 1 đến 3 đột biến trên vùng bám thụ thể (RBD: Receptor binding domain) của gen S thì Omicron lại có đến 34 đột biến trên gen S và trên vùng RDB có đến 15 đột biến (Bảng 1.2) Chính những đột biến này đã giúp cho Omicron không chỉ lây lan nhanh hơn biến

Bảng 1.1 Nguồn gốc các biến thể và tốc độ lây lan so với dòng ban đầu (https://www.who.int/activities/tracking-SARS-CoV-2-variants)

Biến thể Tên khác Nguồn gốc Thời gian phát hiện

Tốc độ lây

Omicron B.1.1529 South Afica Nov 2021 500%

SARS – CoV – 2 Variant Classification and Definition Bảng 1.2 Các đột biến trên gen S và trên vùng RDB của gen S ở trên biến thể

Omicron

Biến thể Đột biến Đột biến quan ngại

Alpha 10 (+3) 1 (+2) ở vùng RBD, 1 (+1) giảm hiệu quả moAb, 1 gần cleavage site, có D614G

Beta 10 1 ở vùng RBD, 2 giảm hiệu quả moAb, có D614G

Gamma 11 3 ở vùng RBD, 2 giảm hiệu quả moAb, 1 gần cleavage site, có D614G

Delta 10 2 ở vùng RBD, 1 gần cleavage site, có D614G

Omicron 34 10 ở vùng RBD, 2 giảm hiệu quả moAb, 2 gần cleavage site, có D614G

1.1.2 Cấu trúc và chức năng gen

Bộ gen SARS-CoV-2 bao gồm 12 khung đọc mở (ORF) Đầu kết thúc 5 ′ của bộ gen virus, có mặt các ORF chồng lấn 1a và 1b mã hóa RNA polymerase và các protein không cấu trúc khác của virus và chiếm khoảng 2/3 bộ gen Các gen mã hóa các protein cấu trúc như gai (S), màng (M), vỏ (E) và nucleocapsid (N), có mặt trong một phần ba bộ gen còn lại của nó kéo dài từ đầu 5' đến đầu 3', cùng với một số gen mã hóa protein không cấu trúc (NSP) và protein phụ nằm rải rác ở giữa (Hình 1.1) Như đã mô tả ở nội dụng trên một số thay thế axit amin đã xảy ra trong các gen coronavirus mới mã hóa protein S, NSP2, NSP3 và miền liên kết thụ thể (RBD) Những đột biến này trong NSP2 & NSP3 cũng được cho là mang lại khả năng lây nhiễm nâng cao của coronavirus mới

Báo cáo mô tả SARS-CoV-2 khai thác thụ thể của men Angiotensin – Converting enzyme 2 (ACE2) để xâm nhập vào bên trong tế bào người, trong khi MERS-CoV liên kết đặc biệt với thụ thể Dipeptidyl Peptidase 4 (DPP4) [8] Liên kết của hạt virus với thụ thể cụ thể trên tế bào chủ đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh khả năng gây bệnh của nó Khảo sát các thụ thể tiềm năng cho các Betacoronavirus khác nhau (β-CoV) bao gồm cả SARS-CoV-2 người ta phát hiện ra rằng sự xâm nhập của virus đã được tăng cường trong các tế bào người biểu hiện thụ thể ACE2 thay vì DPP4 hoặc Aminopeptidase N (APN) trong trường hợp của coronavirus mới [9] Nghiên cứu Cryo-EM (Cryogenic electron microscopy) về protein S nhấn mạnh rằng ái lực của ACE2 và protein S của SARS-CoV-2 lớn hơn 10–20 lần so với SARS-CoV đã biết trước đây [10] Kiến thức về các thụ thể tiềm năng mà virus có thể liên kết cùng với các protease liên quan của nó sẽ cho phép phát triển các loại

1.2 Đáp ứng miễn dịch chống SARS – CoV – 2

Một khi virus xâm nhập vào bên trong tế bào đích, hệ thống miễn dịch của vật chủ sẽ nhận diện toàn bộ virus hoặc các yếu tố kháng nguyên (Epitopes), tạo ra phản ứng miễn dịch tự nhiên (Innate) hoặc thích ứng (Adaptive) Các thụ thể nhận dạng mầm bệnh (PRR – Pathogen recognition receptors) hiện diện trên các tế bào miễn dịch, chủ yếu là các thụ thể Toll-like 3, 7 và 8 nhận dạng đầu tiên virus, dẫn đến việc tăng cường sản xuất interferon (IFN) Chức năng của các tế bào miễn dịch bẩm sinh của vật chủ bị suy giảm trong quá trình nhiễm trùng SARS-CoV và MERS-CoV bởi các protein không cấu trúc của chúng ảnh hưởng đến việc sản xuất cytokine [11] Phản ứng miễn dịch dịch thể đối với SARS-CoV-2 đã được ghi nhận là tương tự như đối với các bệnh nhiễm trùng coronavirus khác, liên quan đến việc sản xuất IgG (Immunoglobulin G) và IgM (Immunoglobulin M) đặc trưng Khi bắt đầu nhiễm SARS-CoV, các tế bào B tạo ra phản ứng sớm chống lại protein N, trong

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của virus và so sánh hệ gen của SARS - CoV - 2 với các chủng coronavirus trước đó

(https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2020.01949/full)

khi các kháng thể chống lại protein S có thể được phát hiện sau 4-8 ngày kể từ khi xuất hiện các triệu chứng ban đầu Mặc dù protein N nhỏ hơn protein S, nhưng nó có tính sinh miễn dịch cao Các kháng thể IgA (Immunoglobulin A), IgG và IgM đặc hiệu với SARS-CoV được phát hiện sau khi bắt đầu xuất hiện các triệu chứng tại các thời điểm khác nhau ở những bệnh nhân bị nhiễm bệnh IgG được phát hiện duy trì bền vững trong một thời gian dài, trong khi mức IgM bắt đầu giảm sau 3 tháng [12] Kháng thể IgM và IgA được phát hiện 5 ngày sau khi xuất hiện các triệu chứng ban đầu, trong khi IgG được phát hiện sau 14 ngày Một nghiên về sự nhân lên virus và hiện diện kháng thể đã ghi nhận sự hiện diện của hiệu giá kháng thể IgG và IgM cao hơn ở những bệnh nhân nặng Họ cũng quan sát thấy rằng những người phản ứng yếu với kháng thể IgG có tốc độ đào thải virus nhanh hơn những người phản ứng mạnh Quan sát này cho thấy rằng phản ứng kháng thể mạnh mẽ dẫn đến mức độ nghiêm trọng của bệnh trong khi phản ứng yếu ớt có liên quan đến việc đào thải virus [13]

1.2.1.1 Đáp ứng miễn dịch hậu nhiễm (nhiễm trùng tự nhiên)

Ở những người bị nhiễm SARS-CoV-2 cho thấy IgM luôn được phát hiện trước IgG, đạt đỉnh điểm trong khoảng từ hai đến năm tuần và giảm dần trong khoảng thời gian từ ba đến năm tuần sau đó kể từ lúc khởi phát triệu chứng IgG đạt đỉnh trong khoảng từ tuần thứ ba đến tuần thứ bảy sau khi khởi phát triệu chứng, tồn tại trong ít nhất tám tuần Các kháng thể trung hòa có thể phát hiện được trong vòng bảy đến 15 ngày kể từ ngày khởi phát bệnh và tăng cho đến ngày 14 – 22 sau đó giảm dần Hiệu giá kháng thể thấp hơn đã được quan sát thấy ở những người bị bệnh không có triệu chứng hoặc bệnh nhẹ về mặt lâm sàng Cũng như miễn dịch tế

1.2.1.2 Miễn dịch do vaccine

Việc đánh giá các phản ứng miễn dịch do tiêm chủng chủ yếu tập trung vào sự gia tăng của các kháng thể nhắm vào vùng S1 của protein gai SARS-CoV-2 Ưu điểm chính của vaccine là hiệu giá IgG kháng S (Spike) cao hơn so với nhiễm trùng tự nhiên, với huyết thanh của những người được tiêm chủng cho thấy khả năng trung hòa tốt hơn virus SARS-CoV-2 so trong ống nghiệm [15]

1.3 Các loại vaccine ngừa COVID – 19

Cho đến hiện nay, đã có nhiều loại vaccine được các các hãng dược phẩm nghiên cứu, cho ra đời và sử dụng để ngừa COVID-19, chủ yếu dựa trên 4 công nghệ sau [16]

Vaccine bất hoạt: là công nghệ sử dụng chính virus SARS-COV-2 nuôi cấy trên tế

bào Verocell rồi sau đó được bất hoạt để làm vaccine Sinopharm và Sinovac của Trung Quốc là những công ty đầu tiên sử dụng công nghệ này trong sản xuất vaccine ngừa COVID-19 Tuy đây là một công nghệ vaccine truyền thống, nhưng do virus SARS-COV-2 vẫn còn được xem là tác nhân độc hại, do vậy mà các nhà máy sản xuất vaccine phải đảm bảo các điều kiện cũng như tiêu chuẩn an toàn sinh học cấp III (BSIII), cũng vì đó mà giá thành của vaccine này không thể nào rẻ được Để tránh phải sử dụng SARS-COV-2 làm vaccine bất hoạt, viện Icahm MS Mount Sinai tại New York đã sử dụng virus New Castle Disease (NCD là virus gây bệnh cho gà) được cho tái tổ hợp gen S của tác nhân SARS-COV-2 để virus NCD tái tổ hợp này biểu hiện được protein gai của SARS-COV-2 trên bề mặt [17] Ưu thế của virus NCD tái tổ hợp này khi được dùng làm vaccine bất hoạt là nuôi cấy được trên trứng gà lộn, nhờ vậy mà có thể sử dụng phương tiện sản xuất vaccine của nhà máy sản xuất vaccine cúm, không cần phải xây dựng nhà máy đảm bào an toàn sinh học cấp III cực kỳ tốn kém Viện Vaccine và Sinh Phẩm Nha Trang (IVAC) đã nhận chuyển giao công nghệ này để sản xuất thử vaccine có tên là Covivac và đang trong quá trình thử nghiệm

Vaccine tiểu đơn vị: là công nghệ sản xuất vaccine protein gai của SARS-COV-2 từ

các tế bào nuôi cấy Hiện nay có hai loại vaccine sử dụng công nghệ này Vaccine Novavac (Mỹ) được sản xuất từ các tế bào bướm đêm cho nhiễm baculovirus đã được tái tổ hợp gen S của SARS-COV-2 rồi nuôi cấy để gặt lấy các tiểu đơn vị protein S làm vaccine Vaccine Nanocovax (Nanogen, Việt Nam) được sản xuất từ các tế bào CHO (Chinese Hamster Ovary) đã được chèn gen S của SARS-COV-2 rồi nuôi cấy để thu lấy các tiểu đơn vị protein S làm vaccine Vaccine Nanocovac đã qua thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 3

Vaccine DNA vector: là công nghệ sản xuất vaccine bằng cách sử dụng adenovirus

đã được chèn gen S của SARS-COV-2 làm vector chuyển gen S vào tế bào người được chích vaccine để tế bào người sản xuất ra protein S, nhờ vậy mà kích hoạt được hệ thống miễn dịch của cơ thể sinh ra các miễn dịch đặc hiệu chống lại protein S [6] Hiện có 4 loại vaccine sử dụng công nghệ này Hãng AstraZeneca phối hợp với đại học Oxford sử dụng DNA vector là adenovirus của tinh tinh (chimpanzee) Gameleya của Nga thì sử dụng adenovirus type 5 và type 26 của người làm DNA vector Johnson&Johnson (Mỹ) sử dụng adenovirus type 26 và Cansino (Trung Quốc) thì sử dụng adenovirus type 5 của người để làm vaccine DNA vector

Vaccine mRNA: là công nghệ tổng hợp hoàn toàn trong ống nghiệm các chuỗi

mRNA mã hóa các thông tin trên gen S của SARS-COV-2 từ các plasmid đã được chèn gen S, sau đó bọc các mRNA vào trong các hạt nanolipid để làm vaccine chích vào người Khi chích vào người, các mRNA sẽ xâm nhập trực tiếp vào tế bào người, sử dụng các ribosome tế bào để tổng hợp ra các protein S của virus nhờ đó mà kích hoạt được hệ thống miễn dịch của cơ thể tạo ra các miễn dịch đặc hiệu chống lại

thành phần của chuỗi mRNA, và cuối cùng là phải bọc được mRNA vào trong các hạt nanolipid Công nghệ sản xuất vaccine mRNA được cho là công nghệ sản xuất vaccine tiên tiến và cách mạng nhất hiện nay vì đây là công nghệ sản xuất nhanh, linh hoạt và hiệu quả nhất Nhanh là vì qui trình sản xuất rất nhanh với thời gian cho mỗi mẻ sản xuất là không quá 12 giờ; Linh hoạt là có thể thay đổi trình tự mRNA khá dễ dàng theo sự thay đổi do đột biến của tác nhân gây dịch; và hiệu quả là vì đáp ứng miễn dịch của cơ thể sau khi được chích vaccine loại này cũng được công nhận là mạnh nhất Hiện có hai nhà sản xuất đang làm chủ công nghệ sản xuất vaccine mRNA, đó là Pfizer/BioNtech (Mỹ) và Moderna (Mỹ) Ngoài ra còn có một nhà sản xuất nữa là Arcturus (Mỹ) cho ra đời một loại vaccine mRNA tự nhân bản dành cho COVID-19 và đang chuyển giao công nghệ cho công ty Vin-Biocare

1.4 Giải pháp xét nghiệm định lượng hiệu quả vaccine

Định lượng hiệu quả của vaccine bao gồm định lượng hiệu quả của đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể và đáp ứng miễn dịch tế bào

Đối với đáp ứng miễn dịch tế bào, hiện nay các nhà nghiên cứu có thể định lượng

đáp ứng này bằng phương pháp định lượng interferon gamma từ tế bào lympho T tiết ra khi gặp kháng nguyên protein S của SARS-COV-2 Tuy nhiên trên thực tế thì rất khó để có thể thực hiện kỹ thuật này trong các phòng thí nghiệm chẩn đoán, do vậy mà có thể nói chúng ta chưa có xét nghiệm định lượng đáp ứng miễn dịch tế bào áp dụng được tại các cơ sở xét nghiệm [16]

Đối với đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể, thì lý tưởng nhất là phải định lượng

được kháng thể có hoạt tính trung hòa trực tiếp virus SARS-COV-2 Muốn vậy phải cho huyết thanh người thử gặp virus SARS-COV-2 trước khi cho nhiễm vào tế bào Verocell để xem huyết thanh có hiệu quả làm giảm khả năng gây nhiễm của virus lên tế bào Verocell không Huyết thanh người thử được xem là có hiệu quả trung hòa SARS-COV-2 khi ngăn cản không cho virus nhiễm vào tế bào với biểu hiện là làm giảm khả năng tạo plaque của virus lên cấy tế bào Verocell Thử nghiệm này được gọi là PRNT (plaque reduction neutralisation test: thử nghiệm trung hòa giảm plaque, hình 6) PRNT là thử nghiệm tiêu chuẩn nhất để có thể định lượng được

hiệu quả bảo vệ của đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể có trong huyết thanh của người được chích ngừa [19], tuy nhiên PRNT chỉ có thể thực hiện được trong phòng thí nghiệm có đủ chuẩn an toàn sinh học cấp III (BSIII) vì phải thao tác nuôi cấy SARS-COV-2, chính vì vậy PRNT không thể thực hiện tại các phòng xét nghiệm chẩn đoán

Như vậy thì có giải pháp xét nghiệm nào có thể thực hiện được trong các phòng xét nghiệm chẩn đoán để định lượng được hiệu quả của đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể trung hòa SARS-COV-2 trên người được chích vaccine? Hiện đã có những xét nghiệm huyết thanh học thực hiện trên các thiết bị miễn dịch tự động để định lượng được kháng thể đặc hiệu protein S (Roche, với đơn vị định lượng là IU) hay định lượng kháng thể đặc hiệu RBD (Abbott, với đơn vị định lượng là BAU: Binding Antibody Unit) Câu hỏi được đặt ra là liệu các xét nghiệm này có phản ánh được lượng kháng thể trung hòa có trong huyết thanh người thử hay không? Chúng ta cũng biết là protein S có rất nhiều loại đặc hiệu kháng nguyên (gọi là epitope) và chỉ có một số ít là kích hoạt tạo ra kháng thể trung hòa, còn đa số thì không liên quan Chính vậy định lượng kháng thể đặc hiệu protein S là định lượng tất cả các kháng thể đặc hiệu cho vô số các loại epitope kháng nguyên trên protein S, trong đó chỉ có một số rất ít là thật sự có vai trò kháng thể trung hòa RBD là vùng gắn thụ thể ACE2 của protein S và kháng thể đặc hiệu RBD có thể bao gồm cả kháng thể trung hòa lẫn kháng thể nhận diện RBD chứ không có vai trò trung hòa (hình 8) Chính vậy định lượng kháng thể đặc hiệu RBD cũng không phản ảnh được lượng kháng thể trung hòa

Từ các phân tích trên có thể thấy rằng các xét nghiệm huyết thanh học thực hiện

% kháng thể có trong huyết thanh người thử cạnh tranh được với RBD không cho gắn lên ACE2

1.5 Mục tiêu nghiên cứu và định hướng đề tài

Mục tiêu 1: Xem xét mức độ hiệu quả của việc đáp ứng miễn dịch ở các chủng loại vaccine được sử dụng ở Việt Nam

Ở giai đoạn 1, tiến hành thu nhận mẫu từ 330 cá thể từ giữa tháng 10/2021 đến cuối tháng 11/2021, cá nhân tham gia tập trung vào các cá nhân hoàn thành tiêm chủng mũi 2 ở các loại vaccine khảo sát Thực hiện đồng thời, đo mức độ sinh kháng thể trung hoà ở từng loại vaccine, định lượng đồng thời kháng thể kháng protein S trên 188 đối tượng để tìm mối tương quan (nếu có) giữa định lượng kháng thể kháng S và kháng thể trung hoà

Kết quả giai đoạn 1 sẽ tập trung trả lời về mức độ đáp ứng miễn dịch thông qua giá trị kháng thể trung hoà ở từng loại vaccine khác nhau, cùng với đó là phân tích sự ảnh hưởng của các yếu tố độ tuổi, giới tính, khoảng cách mũi tiêm, thời gian sau tiêm đến mức độ đáp ứng kháng thể trung hoà; đánh giá đáp ứng miễn dịch ở các nhóm vaccine và sự khác biệt dựa trên bản chất công nghệ sản xuất vaccine; đánh giá hiệu quả của hình thức tiêm trộn vaccine ở Việt Nam

Mục tiêu 2: Đánh giá mức độ thay đổi đáp ứng miễn dịch ở cá nhân tiêm tăng cường mũi 3, sự khác biệt giữa phối hợp vaccine cũng như phương án tiêm phối hợp ý nghĩa nhất

Nghiên cứu thu nhận được 339 cá nhân đã hoàn thành tiêm mũi tăng cường Giai đoạn này chỉ thực hiện đo kháng thể trung hoà, so sánh sự khác biệt ở các thời điểm cũng như xếp hạng các tình huống tiêm tăng cường bằng mũi vaccine phối hợp

Mục tiêu 3: Đánh giá mức đáp ứng miễn dịch ở cá nhân các cá nhân nhiễm virus SARS – CoV – 2 cùng với lịch sử tiêm chủng

Thực hiện thử nghiệm phát hiện mức kháng thể trung hoà trên các đối tượng đã nhiễm SARS – CoV – 2, phân tích sự khác biệt đáp ứng miễn dịch của đối tượng

với tình trạng tiêm chủng bao gồm chưa tiêm, đã nhận ít nhất một mũi tiêm, đã nhận ít nhất 2/3 mũi tiêm, các cá nhân đã tiêm và nhiễm và tiếp tục nhận mũi bổ sung Trong phạm vi đề tài, có 331 cá thể phù hợp đã tham gia thử nghiệm Kết quả trong nội dung này gợi ý về vai trò việc tiêm phủ vaccine cũng như sự cần thiết của mũi tiêm bổ sung hậu nhiễm

Mục tiêu 4: Theo dõi động lực học của mức độ đáp ứng miễn dịch kháng thể trung hoà ở một số đối tượng tham gia tái đánh giá

Thông qua việc phân tích sự thay đổi mức độ kháng thể trung hoà trên các đối tượng tái đánh giá, ghi nhận các tác động có thể diễn ra đến sự gia tăng/ suy giảm miễn dịch ngoài thực địa có bao gồm yếu tố dịch tễ đặc thù ở Việt Nam qua từng giai đoạn lây lan dịch

Mục tiêu 5: Đánh giá mức đáp ứng miễn dịch các cá nhân nhiễm biến chủng Omicron mới với lịch sử đã tiêm chủng

Giai đoạn 4 này tập trung trả lời câu hỏi về tính khả thi/ cần thiết của tiêm chủng mũi 4 để phòng biến chủng Omicron cũng như sự thay đổi của kháng thể trung hoà sau nhiễm biến chủng mới trên các đối tượng cùng với lịch sử tiêm chủng và lịch sử nhiễm trước đó Giai đoạn này thực hiện khảo sát trên 200 mẫu thử, chỉ theo dõi mức độ sinh kháng thể trung hoà

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng:

• Huyết thanh/ huyết tương của cá thể đã thực hiện tiêm chủng: 1 mũi, 1 liệu trình, tiêm tăng cường

• Huyết thanh/ huyết tương của cá thể đã nhiễm trùng SARS – CoV – 2

• Cá nhân tình nguyện tham gia khảo sát, đồng ý cung cấp thông tin cá nhân, thông tin tiêm chủng và nhiễm trùng SARS – CoV – 2 Đối tượng được định hướng theo từng giai đoạn thực hiện đề tài

Thời gian thực hiện đề tài dự kiến từ tháng 11/2021 đến tháng 11/2022

Số lượng mẫu thử thực hiện: Mẫu thử được thu nhận theo từng giai đoạn đề tài,

tổng số mẫu thử trong đề tài đạt 1017 Thông tin chi tiết mô tả trong bảng bên dưới Bảng 2.1 Thông tin đối tượng tham gia thử nghiệm phát hiện kháng thể trung hoà

Tiêm chủng 2 mũi cơ bản

Tiêm chủng 3 mũi (mũi tăng cường)

Đơn vị thực hiện: Mẫu thử được thu nhận trực tiếp tại NAM KHOA LAB hoặc

được thu ở các đơn vị y tế liên kết rồi chuyển về NAM KHOA LAB để tiến hành thử nghiệm miễn dịch

2.1.2 Hoá chất

2.1.2.1 Hoá chất phát hiện kháng thể trung hoà

Sinh phẩm sử dụng từ nhà sản xuất ThermoFisher: Invitrogen SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody ELISA Kit

Bảng 2.2 Thành phần Invitrogen SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody ELISA Kit

BMS2326 SARS-CoV-2 Neutralizing Ab Control, lyophilized 2 vials SARS-CoV-2 Neutralizing Ab Coated Plate 1 plate SARS-CoV-2 Neutralizing Ab Biotin Conjugate

(100X), lyophilized

1 vial

Streptavidin-HRP Conjugate (100X) 0.150 mL

Stabilized Chromogen (Tetramethylbenzidine) 15 mL

2.1.2.2 Hoá chất phát hiện kháng thể đặc hiệu protein S

Sinh phẩm sử dụng từ nhà sản xuất ThermoFisher: Invitrogen Human SARS-CoV-2 Spike (trimer) Ig Total ELISA Kit

Bảng 2.3 Thành phần Invitrogen Human SARS-CoV-2 Spike (trimer) Ig Total ELISA Kit

BMS2326 Human SARS-CoV-2 Ig total High Control, lyophilized 1 vial Human SARS-CoV-2 Ig total Calibrator, lyophilized 1 vial Human SARS-CoV-2 Ig total Low Control, lyophilized 1 vial Human SARS-CoV-2 Spike (trimer) Coated Plate 1 plate Human SARS-CoV-2 Ig total HRP Conjugate (100X) 0.120 mL

Stabilized Chromogen (Tetramethylbenzidine) 15 mL

Tủ Clean Bench vô trùng cấp II -Shinsaeng

SCBN 1013 Shinsaeng Hàn Quốc

THIẾT BỊ MODEL HÃNG QUỐC GIA

• Đầu tip vô trùng cho các mức thể tích pipette • Ống fancol: 50 ml

• Bình DURAN 1000 ml

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Sơ đồ quy trình thực hiện

Lai với cộng hợp Streptavidine - HRP

Bổ sung dung dịch STOP kết thúc quá trình hiện màu

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu

2.2.1.2 Thuyết minh quy trình

• Mẫu

Mẫu thử là huyết tương tách từ máu được kháng đông bằng EDTA (sử dụng tube lấy máu vaccutainer của BD có kháng đông EDTA) lấy từ các đối tượng nghiên cứu

• Xử lý mẫu

Đối với mẫu thử ban đầu là máu toàn phần thu từ cá nhân tham gia nghiên cứu, tube kháng đông EDTA được ly tâm trong 15’ ở 2500 rpm để phân tách hồng cầu và huyết tương Hút chuyển phần huyết tương sang tube vô trùng low-binding Các mẫu huyết tương được tách ngay sau khi lấy máu rồi giữ ở -40oC cho đến khi thực hiện xét nghiệm

• Quy trình thử nghiệm kháng thể trung hoà

Nguyên tắc: SAR – CoV – 2 Neutralizing Antibody ELISA kit là một phản ứng

ELISA cạnh tranh được thiết kế để phát hiện mức độ (level) của kháng thể trung hoà SARS – CoV – 2 trong huyết thanh hoặc huyết tương Đĩa nhựa 96 giếng được phủ bởi kháng nguyên SARS – CoV – 2 Receptor Binding Domain (RBD), mẫu thử mang kháng thể trung hoà sẽ cạnh tranh với lượng ACE2 được gắn biotin Bất kỳ ACE2 nào liên kết với RBD sẽ cho xuất hiện tín hiệu Tín hiệu này sau đó được quy đổi ngược về tỷ trọng phần trăm của kháng thể trung hoà

Chuẩn bị trước thử nghiệm

Chuẩn bị mẫu: Mẫu thử huyết thanh/ huyết tương được pha loãng 1:50 với Assay

Buffer 1X (ví dụ, 5 µl mẫu + 245 µl Assau Buffer 1X)

Hoàn nguyên chứng chuẩn: Neutralizing Ab Control được dung làm chuẩn dương

của phản ưng Hoàn nguyên chứng chuẩn đông khô bằng Assay Buffer 1X Vortex nhẹ và ủ khoảng 10 phút, sử dụng chứng chuẩn trong vòng 15 phút sau khi hoàn nguyên

Chuẩn bị cộng hợp Biotin 1X: Cộng hợp được hoàn nguyên 15 phút trước khi sử

dụng Hoàn nguyên cộng hợp Biotin (100X) với Assay Buffer 1X Pha loãng 0.12 ml dung dịch cộng hợp 100X với 11.88 ml dung dịch Assay buffer 1X Trộn đều

Chuẩn bị cộng hợp Streptavidin – HRP: Cộng hợp Streptavidin – HRP được sử

dụng trong vòng 15 phút sau khi pha loãng Trộn 0.12 ml cộng hợp Streptavidin – HRP 100 X với 11.88 ml dung dịch Assay Buffer 1X Trộn đều

Tiến trình thử nghiệm

1 Gắn kết phức hợp kháng nguyên – kháng thể

• Rửa giếng nhựa 2 lần với Wash Buffer 1X

• Bổ sung 100 µl chứng chuẩn và các mẫu đã pha loãng ở bước trên vào các giếng tương ứng để ủ lai

• Bổ sung 100 µl dung dịch Assay Buffer vào một giếng cố định như là chứng âm

• Phủ đĩa nhựa với màng seal và ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng trên máy lắc

• Hút bỏ dung dịch đã ủ lai và rửa lại 3 lần với Wash Buffer 1X Ở mỗi bước rửa, giữ yên trong 10 – 15 giây trước khi hút bỏ

2 Bổ sung cộng hợp Biotin

• Bổ sung 100 µl dung dịch cộng hợp Biotin 1X vào các giếng

• Phủ đĩa bởi seal và tiếp tục ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng trên máy lắc

• Hút bỏ dung dịch đã ủ lai và rửa lại 3 lần với Wash Buffer 1X Ở mỗi bước rửa, giữ yên trong 10 – 15 giây trước khi hút bỏ

3 Bổ sung cộng hợp Streptavidin – HRP 1X

• Bổ sung 100 µl dung dịch cộng hợp Streptavidin – HRP 1X vào các giếng

• Phủ đĩa bởi seal và tiếp tục ủ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng trên máy lắc

• Hút bỏ dung dịch đã ủ lai và rửa lại 3 lần với Wash Buffer 1X Ở mỗi bước rửa, giữ yên trong 10 – 15 giây trước khi hút bỏ

4 Bổ sung dung dịch cơ chất

• Bổ sung 100 µl dung dịch cơ chất (Substrate) vào các giếng Dung dịch sẽ chuyển sang màu xanh lam

• Ủ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng

Lưu ý: TMB (Substrate) không thể dính vào các màng bọc nhôm hay kim loại (nên sử dụng màng seal nhựa 5 Bổ sung dung dịch

kết thúc phản ứng

• Bổ sung 100 µl dung dịch STOP vào các giếng để kết thúc quá trình hiên màu Gõ nhẹ vào bên hông đĩa nhựa để phản ứng diễn ra đồng đều Dung dịch sẽ chuyển từ màu lanh sang vàng

Đọc OD và phân tích kết quả

o Đọc mức độ hấp thu bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 450 nm như là