congngheditruyenchuong 05 modification and mutagenesis

°Ổ Xác định promotor hoặc các trình tự điều hòa °Ổ Xác định cấu trúc sơ cấp và thứ cấp của protein quyết định đến hoạt động của nó ° Di truyền ngược: biến đổi kiểu gene > xem xét, đánh

Cải biến và đột biến

Nhằm

°Ổ Xác định promotor hoặc các trình tự điều hòa

°Ổ Xác định cấu trúc sơ cấp và thứ cấp của

protein quyết định đến hoạt động của nó

° Di truyền ngược: biến đổi kiểu gene > xem xét, đánh giá sự ảnh hưởng đến kiểu hình

Phương pháp

° Dựa trên enzyme cắt giới han

— Loại bỏ trình tự nhận biết đặc thù của RE

— Đưa vào trình tự nhận biết

— Xen đoạn

— Làm mất đoạn

¢ Dot bién dinh hudng bang oligonucleotide

— Khong dung PCR

— Dung PCR

Loại bỏ trình tự nhận biết của RE

GAATTC CTTAAG

| Cut with EcoRI

ee ( AATTIC mm

ees (A | ÀẮÂẴẰẴẰẴẴẴẴĂ~ EEE

ees (5; A ATT A ATTC mm ———

ees (TA A TTA A G ma .ẴĂẴĂẴĂẴx

or

ee ( j C

| Ligate

es CAAT AAD EEE ees (OA AT TA AC es

Đột biến định hướng

Mismatched oligo annealed

to single-stranded DNA

Second strand synthesized Mismatched duplex transformed into E coli

Repair and/or replication takes place

O-OO© Mutation fixed or Wild-type generated

Đột biến định hướng bằng PCR, megaprimer

Gene with target for mutation

First PCR with primer with mutant sequence and flanking primer

ne od

-®——

PCR product with mutant sequence, constituling megaprimer

PCR with megaprimer and second

E==——— —

cs

TS Sẽ flanking primer

+

Do ng Mutant

Đột biến định hướng bằng PCR

+

— —~.

PCR-amplified

Đột biến bằng overlap PCR

-amplifie

DNA with fragment

Đột biến bằng overlap PCR

Extension PCR

Overlap PCR

¥

Purification PCR

ÿ

Restrictinn site Restriction site

Bất hoạt gene

Giúp khám phá vai trò sinh lý của gene

Điều khiển sự biểu hiện một gene đột biến

Bất hoạt một gen không mong muốn

Phương pháp:

— Làm gián đoạn cấu trúc gene

— Kìm hãm sự biểu hiện của gene

Gian đoạn cấu trúc gene

| | Gene to be disrupted

is first cloned

Selectable marker inserted DNA linearized

— hn +

Transform into target cells Select for marker

` | | | Chromosomal copy

|

| ~~ of target gene

Homologous recombination replaces chromosomal copy with disrupted copy

——_L Km ~— Chromosome now carries disrupted copy

Gián đoạn cấu trúc gene (cont.)

Gene disrupted on

circular molecule

Transtorm into host Select for marker

4 po

Recombination with chromosomal copy

— hy ~—~—hYh F——

Chromosome has one disrupted copy and one potentially functional copy

Lam cam lang gene sau phién ma (Post-transcriptional gene silencing, PTGS}

e Antisense RNA:

Antisense

RNA sợi đơn, được đưa vào trong tế bào nhằm ức chế bộ

máy phiên mã thông qua sự bắt cặp bổ sung với mRNA

của gen mục tiêu.

Lam cam lang gene sau phién ma (Post-transcriptional gene silencing, PTGS}

e RNA interference

Target cleavage

call (RISC actwation)