Cndt2_Nguyễn Phúc Thiện_21126514_Thứ 2_789.Pdf

Tuy nhiên sự hiểu biết của con người về thực phẩm biến đổi gen còn mờ hồ và một số người còn không nhận thức được thực phẩm biến đổi gen là gì, dẫn đến những luồng ủng hộ và tranh cải về

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THU HOẠCH

CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN II

SINH VIÊN THỰC HIỆN : NGUYỄN PHÚC THIỆN

TP Thủ Đức, 6/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THU HOẠCH

THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN II

TP Thủ Đức, 6/2024

i

MỤC LỤC

Trang

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu thực hành 1

1.3 Nội dung thực hành 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 GMO 2

2.2 Kỹ thuật điện di 2

2.3 Kỹ thuật PCR 3

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 4

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 4

3.2 Vật liệu nghiên cứu 4

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 4

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ 4

3.2.3 Hóa chất sử dụng 4

3.2.4 Phương pháp nghiên cứu 4

3.3 Các bước tiến hành 4

3.3.1 Ly trích DNA 4

3.3.2 Kiểm tra DNA bằng phương pháp điện di và đo OD mẫu 7

3.3.3 PCR 8

3.3.4 Điện di kiểm tra GMO trong mẫu 8

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 9

4.1 Kết quả và thảo luận 9

4.1.1 Kết quả điện di DNA tổng số 9

4.1.2 Kết qủa đo OD kiểm tra lượng DNA ly trích 9

4.1.3 Kết quả điện di phát hiện GMO 9

ii

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt Từ tiếng anh Từ tiếng việt

DNA Deoxyribonucleic Acid

EDTA Ethylene Diamine TetraAcetic Acid

GMO Genetically Modified Organism Sinh vật biến đổi gen

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

RNA Ribonucleic Acid

PCI Phenol/CH3Cl/Isoamyl

PCR Pholymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi Pholymerase TAE Tris-Acetate-EDTA

TBE Tris-Boric Acid-EDTA

iii

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Thành phần hỗn hợp các chất trong PCR 8 Bảng 3.2 Chu trình nhiệt cho máy PCR 8

iv

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 2.1 Dâu tây biến đổi gen và dâu tây thường 2

Hình 3.1 Mẫu ngô số 2 a) Mẫu hạt được lấy tại Đồng Nai; b) Mẫu hạt nghiền nhuyễn 5

Hình 3.2 Dịch chiết SDS và mẫu 5

Hình 3.3 Mẫu sau khi ly tâm với dung dịch PCI 6

Hình 3.4 Mẫu sau khi ly tâm với dung dịch CI 6

Hình 3.5 Dung dịch chứa Iso propanol 7

Hình 3.6 Cho ethanol vào để rửa 7

Hình 4.1 Kết quả điện di DNA tổng số 9

Hình 4.2 Kết quả đo OD 9

Hình 4.3 Kết quả quá trình điện di 10

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Dân số ngày càng tăng cùng với biến đổi khí hậu ngày càng tăng đòi hỏi nhu cầu

về một tương lai với năng suất nông nghiệp cao hơn, nguồn thực phẩm lành mạnh hơn

và sự bền vững về môi trường Bên cạnh các khía cạnh xã hội và chính trị của những cuộc khủng hoảng này, nhu cầu lương thực ngày càng tăng và nạn đói đòi hỏi sự linh hoạt hơn trong hệ thống sản xuất lương thực, đổi mới khả năng phục hồi của cây trồng

và cải thiện chất lượng dinh dưỡng Vì những tiến bộ công nghệ trong sản xuất thực phẩm được coi là những thay đổi tất yếu trong ngành công nghiệp thực phẩm ngày nay nên việc phát triển GMO là một trong những câu trả lời cho những vấn đề đó Tuy nhiên

sự hiểu biết của con người về thực phẩm biến đổi gen còn mờ hồ và một số người còn không nhận thức được thực phẩm biến đổi gen là gì, dẫn đến những luồng ủng hộ và tranh cải về vấn đề này diễn ra trên toàn cầu

Việt Nam là một quốc gia đang phát triển nên việt nhập khẩu các giống bắp và đậu

từ các nước Brazil, Mỹ, Argentina, Ấn Độ, là khá lớn, và việc nhập khẩu các sản phẩm này vào nước ta cũng đã có từ rất lâu nhưng những vấn đề về dán nhãn thực phẩm biến đổi gen vẫn còn khá chủ quan Và có thể nói thực phẩm biến đổi gen đã có mặt hầu hết trong thức ăn của người Việt chúng ta

1.2 Mục tiêu thực hành

Phát hiện thực phẩm biến đổi gen GMO trên giống bắp

1.3 Nội dung thực hành

Thực hiện ly trích DNA, PCR và điện di xác định có sự hiện diện của đoạn kích thước được biến đổi gen

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 GMO

GMO là viết tắt của “Genetically Modified Organism”, tức là “sinh vật biến đổi gen” Trong nông nghiệp và thực phẩm, GMO thường ám chỉ các loại cây trồng hoặc động vật mà vật liệu di truyền của chúng đã được thay đổi thông qua kỹ thuật di truyền

để có những đặc tính mong muốn như khả năng chống sâu bệnh, tăng hàm lượng dưỡng chất, hoặc chịu đựng được điều kiện môi trường khắc nghiệt Mục đích của việc sử dụng GMO là để tăng năng suất và chất lượng của thực phẩm, giúp đáp ứng nhu cầu thực phẩm toàn cầu

Về mặt nguyên tắc, người ta chỉ làm biến đổi gen mang tính có lợi Nghĩa là chỉ tiến hành biến đổi ở những gen không liên quan gì đến thành phần giá trị dinh dưỡng của thực phẩm, hoặc nếu có thì sẽ làm động tác theo hướng tăng cường hàm lượng mà không làm thay đổi theo chiều hướng ngược lại Do đó, giá trị dinh dưỡng của thành phẩm không hề bị suy giảm cho nên Bên cạnh việc cung cấp dinh dưỡng thì thực phẩm biến đổi gen còn cho chúng ta những vụ mùa bội thu, những vụ mùa tồn tại ngay cả ở trong điều kiện sâu bệnh và khí hậu khắc nghiệt

Tuy nhiên, việc sử dụng GMO cũng gây ra nhiều tranh cãi liên quan đến ảnh hưởng của chúng đối với sức khỏe con người và môi trường Một số người lo ngại rằng GMO

có thể gây hại cho các loài sinh vật khác và làm thay đổi hệ sinh thái nông nghiệp Để đảm bảo an toàn, các sản phẩm GMO thường phải trải qua các quy trình kiểm định nghiêm ngặt trước khi được đưa ra thị trường

Hình 2.1 Dâu tây biến đổi gen và dâu tây thường 2.2 Kỹ thuật điện di

Kỹ thuật điện di là một phương pháp quan trọng trong lĩnh vực hóa học, hóa sinh

và sinh học phân tử, được sử dụng để tinh sạch và phân tích các phân tử sinh học như nucleic acid, protein và một số ít phức hợp của carbohydrat, lipid Nguyên lý hoạt động

của điện di dựa trên hiện tượng dịch chuyển của các vật thể mang điện tích dưới tác động của điện trường Các phân tử được phân tách khi di chuyển trong gel với vận tốc khác nhau, phụ thuộc vào lực của điện trường tác động lên chúng, kích thước và hình dạng của chúng so với kích thước lỗ của gel

Trong kỹ thuật này, một bản gel (thường là agarose hoặc polyacrylamide) đóng vai trò là thể nền để phân tách các phân tử, và các chất nhuộm khác nhau như ethidium bromide, bạc, xanh Coomassie được sử dụng để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di1 Điện di có thể được áp dụng trong nhiều biến thể khác nhau như điện di trên gel agarose, điện di trên gel polyacrylamide, Native PAGE, SDS-PAGE, và điện di

2 chiều

2.3 Kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR, viết tắt của “Polymerase Chain Reaction” hay “Phản ứng Chuỗi Polymerase”, là một phương pháp mạnh mẽ và linh hoạt trong việc nhân bản một đoạn DNA cụ thể Phương pháp này cho phép tạo ra hàng triệu bản sao của một đoạn DNA nhỏ từ một mẫu ban đầu, thậm chí chỉ từ một bản sao duy nhất Đây là công cụ không thể thiếu trong nghiên cứu y học và sinh học phân tử, đặc biệt trong các phân tích về vật liệu di truyền DNA/RNA

Nguyên lý hoạt động của kỹ thuật PCR dựa trên việc khuếch đại một đoạn trình tự DNA Trong điều kiện in vitro, sử dụng enzyme DNA polymerase để tăng cường quá trình này Phản ứng khuếch đại diễn ra qua chu trình luân nhiệt, thường gồm 20-40 chu

kỳ, bao gồm các bước:

Biến tính (Denaturation): Sử dụng nhiệt độ cao để tách rời hai sợi của DNA mạch đôi, tạo thành các sợi đơn

Bắt cặp (Annealing): Ở nhiệt độ thấp hơn, mồi (primer) bắt đầu bám vào các đoạn mục tiêu trên DNA mẫu

Kéo dài (Elongation): Ở nhiệt độ cao hơn, enzyme DNA polymerase thêm vào các nucleotide mới vào mỗi sợi đơn, tạo ra sợi đối mới

Các thành phần cơ bản trong một phản ứng PCR bao gồm DNA mẫu, mồi (primer),

và nucleotide PCR có nhiều ứng dụng quan trọng, từ chẩn đoán bệnh, nghiên cứu bệnh nhiễm trùng, đến xác định huyết thống và phát hiện bệnh di truyền

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện nghiên cứu là ngày 23/05/2024 và ngày 03/06/2024

Địa điểm được thực hiện tại phòng Phòng 105 Tòa A2 Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu số 2 – hạt ngô được trồng tại tỉnh Đồng Nai

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ

Pipette, eppendorf, máy ly tâm, máy đo quang phổ, bồn điện di và tủ ủ

3.2.3 Hóa chất sử dụng

Hóa chất gồm: PCI buffer; CI; Isopropanol; Ethanol 70oC; TE buffer, Master mix; Gelred; SDS; loading dye; gel agarose; dung dịch đệm điện di (TAE hoặc TBE)

3.2.4 Phương pháp nghiên cứu

Dùng kỹ thuật điện di để kiểm tra DNA tổng số Sau đó dùng kĩ thuật PCR để khuếch đại DNA trong mẫu Điện di sản phẩm PCR kiểm tra DNA ly trích có dương tính hay âm tính với gen chuyển vào hay không thông qua band sáng xuất hiện (mẫu dương tính) hay không xuất hiện (mẫu âm tính)

3.3 Các bước tiến hành

3.3.1 Ly trích DNA

Bước 1: Lấy 1 lượng nhỏ hạt bắp được thu hoạch tại cánh đồng ngô ở tỉnh Đồng Nai đem nghiền nhuyễn bên trong túi zip bằng chài Sau đó chuẩn bị 1 tube sạch và cho

1 lượng nhỏ hạt đã nghiền(0,05 g) vào (Không được lấy quá nhiều hoặc quá ít vì sẽ khiến quá trình ly trích và điện di trở nên khó khăn.)

Hình 3.1 Mẫu ngô số 2 a) Mẫu hạt được lấy tại Đồng

Nai; b) Mẫu hạt nghiền nhuyễn

Bước 2: Cho 400 μL dịch chiết SDS sau đó dùng chày nghiền mẫu trong dung dịch Sau

đó bổ sung thêm 200 μL dịch chiết SDS

Hình 3.2 Dịch chiết SDS và mẫu

Bước 3: Thêm 600 μL PCI tỷ lệ 25:24:1 đã được chuẩn bị trước, sau đó lắc Sau

đó, đem tube đi ly tâm ở 10000 rpm trong 5 phút Sau ly tâm hút 500 μL dịch nổi chuyển qua tube mới

Hình 3.3 Mẫu sau khi

ly tâm với dung dịch PCI

Bước 4: Cho thêm 500 μL dung dịch CI vào tube và đem đi ly tâm ở 10000 rpm trong 5 phút, sau ly tâm hút 300 μL dịch nổi qua tube mới

Hình 3.4 Mẫu sau khi ly tâm với dung dịch CI

Bước 5: Bổ sung Isopropanol, như vậy sẽ thêm 180 μL Isopropanol sau đó đảo nhẹ

Hình 3.5 Dung dịch

chứa Iso propanol

Bước 6: Ủ lạnh ở -20ºC trong khoảng 30 phút, sau đó tiếp tục đem tube đi ly tâm

10000 rpm trong 10 phút

Bước 7: Sau đó đổ từ từ dịch ra (đổ nhẹ để tránh DNA bị đổ ra ngoài) rồi thêm 500

μL Ethanol 70o vào để rửa, đem đi ly tâm ở 10000 rpm trong 3 phút Tiếp tục lặp lại quá trình rửa thêm một lần nữa

Hình 3.6 Cho ethanol

vào để rửa Bước 8: Cuối cùng, đem tube đi phơi hoặc sấy khô rồi sau đó hút 30 μL TE cho vào 2 tube giúp cân bằng pH và giúp bảo quản mẫu

3.3.2 Kiểm tra DNA bằng phương pháp điện di và đo OD mẫu

Bước 1: Chuẩn bị các dụng cụ cho quá trình điện di

Bước 2: Hút 10 µL loading dye trộn với 5 µl mẫu DNA đã được ly trích

Bước 3: Bơm 15 µl hỗn hợp trên vào gel trong bồn điện di

Bước 4: Bật điện bồn điện di trong 25 phút ở hiệu điện thế 100V và chụp tấm gel

và quan sát kết quả

Đối với đo OD mẫu thì hút 2-3 µl mẫu cho vào máy Biodrop và quan sát kết quả trên màng hình thiết bị

3.3.3 PCR

Tiến hành pha hỗn hợp chứa vật liệu di truyền (PCR mix) bao gồm:

Bảng 3.1 Thành phần hỗn hợp các chất trong PCR

Thành phần Nồng độ gốc Nồng độ cuối Thể tích (µl)

Tổng thể tích = 12,5 µl Bước 1: Hút từng thành phần cho vào một tube gồm Master mix 6,25 µl cùng với primer forward và primer reverse mỗi loại 0,25 µl, sau đó thêm 1 µl DNA mẫu mà ta đã

ly trích từ trước Cuối cùng là cho 4,75 µl nước khử ion vào

Bước 2: Hút 200 µl hỗn hợp bên cho vào một tube mới rồi đem đi chạy PCR theo chu trình như bảng dưới

Bảng 3.2 Chu trình nhiệt cho máy PCR

Các giai đoạn Nhiệt độ (ºC) Thời gian Chu kì

Bước 3: Đợi quá trình PCR hoàn tất và đem dịch đó đi chạy điện di

3.3.4 Điện di kiểm tra GMO trong mẫu

Bước 1: Chuẩn bị các dụng cụ cho quá trình điện di

Bước 2: Hút 10 µL loading dye trộn với 5 µl mẫu DNA đã được ly trích

Bước 3: Bơm 15 µl hỗn hợp trên vào gel trong bồn điện di

Bước 4: Bật điện bồn điện di trong 40 phút ở hiệu điện thế 100V và chụp tấm gel

và quan sát kết quả

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả và thảo luận

4.1.1 Kết quả điện di DNA tổng số

Hình 4.1 Kết quả điện di DNA tổng số

Dựa vào hình ta thấy kết quả điện di cho ra band sáng của mẫu số 2 cho thấy trong quá trình ly trích mẫu và đo mật độ quang có DNA

4.1.2 Kết qủa đo OD kiểm tra lượng DNA ly trích

Hình 4.2 Kết quả đo OD

Nhìn vào kết quả thấy được tỷ lệ A260/A280 là 2,022 mẫu và nồng độ hiển thị 63,32ng/µl không quá dày đặc nhưng để đạt được hiểu quả cao trong quá trình PCR thì cần phải pha loãng thêm Nhìn vào biểu đồ ta thấy có những điểm nhấp nhô phía dưới dày và gần phần đỉnh cho thấy trong mẫu DNA vẫn còn chứa một số tạp chất nhưng có thể xem là tinh sạch vừa phải

4.1.3 Kết quả điện di phát hiện GMO

Hình 4.3 Kết quả quá trình điện di

Giếng số 2 là giếng đối chứng âm không có xuất hiện band sáng và giếng số 3 là giếng đối chứng dương thì lại có band sáng tại vị trí 195 bp Giếng số 5 chứa mẫu số 2 không có xuất hiện band sáng (kết quả không đáng tin cậy) vì trong quá trình thao tác bơm vào giếng để thực hiện điện di thì phần hỗn hợp của DNA mẫu và loading dye đã

bị bơm 1 phần ra ngoài Làm cho hàm lượng DNA mẫu bị giảm 1 phần

Kết luận chung: Những mẫu có band sáng giống với đối chứng tại vị trí 195 bp dương thì có thể khẳng định rằng đó là GMO còn những mẫu không có band sáng giống với đối chứng dương tại vị trí 195 bp thì là non-GMO